使用必需基因作為標(biāo)記并任選地將其再循環(huán)的細(xì)胞修飾方法
【專利說明】使用必需基因作為標(biāo)記并任選地將其再循環(huán)的細(xì)胞修飾方 法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及用于在靶位點修飾宿主細(xì)胞的方法。本發(fā)明還涉及通過這種方法能夠 得到的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及使用根據(jù)本發(fā)明被修飾的帶有目的核酸的細(xì)胞來生產(chǎn)目的 生物化合物的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 微生物（例如真菌或酵母）的轉(zhuǎn)化是增強(qiáng)、引入或改變特定性狀的公知程序。為 了這個目的，可以使用外源和內(nèi)源DNA序列二者。因為轉(zhuǎn)化并非100%有效，因此使用標(biāo)記 基因來選擇被轉(zhuǎn)化菌株，即含有期望性狀的個體。標(biāo)記基因是被引入DNA的一部分，其賦予 被轉(zhuǎn)化菌株可被選擇的新的屬性。普遍使用的標(biāo)記的實例是抗生素或其它有毒化合物抗性 基因、解除營養(yǎng)缺陷的基因或參與某化合物的代謝的基因。
[0004] 使用標(biāo)記基因的成功率不同。阻礙成功的因素包括：1)真正被轉(zhuǎn)化的菌株消耗來 源于培養(yǎng)基的抗生素/有毒化合物，從而允許未被轉(zhuǎn)化的菌株生長；和2)必需成分的互養(yǎng) (cross-feeding)。這些因素引起背景生長，因此需要多輪純化以獲得純的被轉(zhuǎn)化菌株。這 個過程可以是耗時的。此外，對于某些種類的選擇標(biāo)記（例如營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記或參與代謝 的標(biāo)記），必須使用限定培養(yǎng)基來選擇被轉(zhuǎn)化菌株。與非限定生長培養(yǎng)基相比，這些限定培 養(yǎng)基常常減緩生長。
[0005] 真菌常常顯示多核，這阻礙選擇其中所有核具有相同基因型的細(xì)胞。這要求多輪 選擇，經(jīng)常經(jīng)由孢子形成期以鑒定單核區(qū)（single-nuclei stadia)，這是耗時的。
[0006] 此外，通常需要從菌株中移除標(biāo)記基因以用于商業(yè)發(fā)酵。這種移除可導(dǎo)致意料之 外的基因型和/或表型效果。
[0007] 當(dāng)以微量滴定板方式進(jìn)行高通量（HTP)轉(zhuǎn)化時，背景生長的最小化變得甚至更加 困難。適用于這個目的的標(biāo)記較少，而且由于微孔中的有限生長區(qū)域，選擇劑的消耗或互養(yǎng) 是常見的。通常地，應(yīng)用選擇平板，但自動化可受益于在液體培養(yǎng)基中選擇，而這在選擇劑 的消耗或互養(yǎng)發(fā)生時是不可能的。
[0008] 因此，這些作用嚴(yán)重阻礙了 HTP轉(zhuǎn)化的效率。
[0009] 發(fā)明簡述
[0010] 本發(fā)明涉及修飾生物體的方法。該方法可被用于，例如敲除基因或者向生物體中 轉(zhuǎn)移任何期望的一種或多種核酸。換言之，該方法可被用作轉(zhuǎn)化生物體的方法。
[0011] 本發(fā)明基于必需基因（essential gene)的使用，必需基因即具有以下功能或編碼 以下功能的一種或多種核酸，即沒有所述功能的個體細(xì)胞無法生存或可不分裂（在細(xì)胞被 暴露的特定條件下）。這種基因可被用于通過必需功能的回補(bǔ)（complementation)進(jìn)行選 擇。這種基因的使用確保僅存活菌株是含有回補(bǔ)的必需功能的那些，因此背景生長被減輕。
[0012] 本文中，具有以下功能或編碼以下功能的一種或多種核酸可被稱為必需核酸，即 沒有所述功能的個體細(xì)胞無法生存或可不分裂/復(fù)制（在細(xì)胞被暴露的特定條件下）。必 需核酸可以是單一核酸。然而，可以以下述方式實施本發(fā)明，其中兩種或更多種核酸合起來 具有或編碼必需功能。
[0013] 為了能夠使用必需基因作為選擇標(biāo)記，通常首先使這個基因在宿主基因組中失 活，即致使其無功能，例如通過缺失。存在一些敲除必需基因表達(dá)的方法，例如利用siRNA 沉默、抑制啟動子活性、形成突變、從染色體中部分或完全移除或者重排必需基因DNA。在本 發(fā)明中，通常使用不同的方法來敲除必需基因。
[0014] 特別地，用被選擇的必需基因的精確拷貝或其變體，或者用一個或多個基因來完 全或部分替換被選擇的必需基因，其中所述一個或多個基因合起來可替換由被替換基因編 碼的必需功能。
[0015] 這種替換（必需）基因與位點特異性重組位點一起被提供，其中所述位點特異性 重組位點能夠被重組酶（例如酪氨酸重組酶，例如ere-重組酶）識別。替換（必需基因） 可位于兩個位點特異性重組位點之間。
[0016] 編碼重組酶的核酸也可通過質(zhì)粒被提供，例如位于相同重組位點之間（以使它將 在重組酶的誘導(dǎo)和表達(dá)之后被缺失）或者位于基因組的其它地方，或通過瞬時表達(dá)被提 供。
[0017] 重組酶編碼核酸可受誘導(dǎo)型啟動子的控制而表達(dá)，因此啟動子被誘導(dǎo)之后，重組 酶產(chǎn)生。
[0018] 重組酶被選擇以使它能夠識別位點特異性重組位點，且位點特異性重組位點被放 置以使，在重組酶存在時，重組發(fā)生從而使"替換"必需基因變得無功能。位點特異性重組 位點通常將位于替換必需基因的兩個位點（即"上游"和"下游"）以使替換必需基因被整 體缺失（在重組酶存在時）。
[0019] 在轉(zhuǎn)化步驟（transformation round)中，必需基因被（同時、順次或獨立地）再引 入到靶位點。以這種方法直接替換必需基因使成功轉(zhuǎn)化體能夠存活。在這種轉(zhuǎn)化步驟中， 包含必需基因的核酸被引入到靶位點。可實施轉(zhuǎn)化步驟以使必需基因替換靶位點的序列， 例如導(dǎo)致在靶位點的敲除（參見圖5)?？商娲鼗蚋郊拥?，一種或多種目的基因（例如生 化通路的每個成員）也可被引入到靶位點（參見圖4)。
[0020] 作為進(jìn)一步的改善，被引入到靶位點的必需基因還可與位點特異性重組位點和任 選的重組酶編碼序列一起被提供。以這種方法，可使用具有相同必需功能的一種序列或 合起來提供相同必需功能的多種序列進(jìn)行反復(fù)的轉(zhuǎn)化步驟（iterative transformation rounds)。在每個步驟中，可使必需序列在一個位置無功能并向革EU立點引入必需序列的替換 拷貝。每個靶位點可以是與之前轉(zhuǎn)化循環(huán)中的靶位點不同的靶位點或相同的靶位點。
[0021] 為了通過重組酶活性精確調(diào)控（fine-tune)標(biāo)記的缺失，可以使用重組酶基因的 雙重誘導(dǎo)，例如利用tet-on/tet-off系統(tǒng)。以這種方法，僅可同時由一個位置誘導(dǎo)重組酶。 還可以以交替方式使用不同的重組位點和重組酶。
[0022] 因此根據(jù)本發(fā)明，提供了在靶位點修飾宿主細(xì)胞的方法，所述方法包括：
[0023] 提供宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞在第一位點包含至少兩個位點特異性重組位點和具 有必需功能或編碼具有必需功能的產(chǎn)物的核酸；
[0024] 在靶位點向宿主細(xì)胞中引入具有必需功能或編碼具有必需功能的產(chǎn)物的另一核 酸；和
[0025] 通過所述至少兩個位點特異性重組位點在所述第一位點實施重組，以使所述具有 必需功能或編碼具有必需功能的產(chǎn)物的核酸（位于第一位點）無功能，
[0026] 從而在靶位點修飾所述宿主細(xì)胞。
[0027] 本發(fā)明還提供了通過根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法能夠得到的宿主細(xì)胞。圖 6和圖7中示意性地展示了本發(fā)明的方法一參見步驟1和2。圖6的步驟3示意性地展示 了可如何使用本發(fā)明的方法來反復(fù)修飾細(xì)胞。
[0028] 還可以以下述方式實施本發(fā)明，其中提供帶有具有必需功能或編碼具有必需功能 的產(chǎn)物的兩種或更多種核酸（本文中的"必需核酸"）的宿主細(xì)胞，每種核酸帶有兩個或更 多個位點特異性重組位點。
[0029] 以這種方法，可同時、順次或分別地將宿主細(xì)胞的修飾靶向兩個或更多個靶位點。 宿主細(xì)胞中的兩個或更多個必需核酸可被提供有相同或不同的位點特異性重組位點。換言 之，可使用一種重組酶同時移除多于一種必需核酸。
[0030] 本發(fā)明的方法可被用于產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。因為在宿主細(xì)胞中目的核酸與必需基 因緊密相連，所以轉(zhuǎn)化體穩(wěn)定。
[0031] 當(dāng)本發(fā)明的方法被用于引入目的核酸時，目的核酸可以是任何目的核酸，例如編 碼期望蛋白的核酸。
[0032] 因此，本發(fā)明提供了生產(chǎn)目的生物化合物的方法，所述方法包括：在有益于生產(chǎn)目 的生物化合物的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞被編碼目的生物化合物或參 與合成目的生物化合物的化合物的核酸轉(zhuǎn)化；和任選地，從發(fā)酵液中分離目的化合物。
[0033] 本發(fā)明還提供了生產(chǎn)目的生物化合物的方法，所述方法包括：根據(jù)本發(fā)明的方法 用編碼目的生物化合物或參與合成目的生物化合物的化合物的核酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；和在有 益于生產(chǎn)目的生物化合物的條件下培養(yǎng)所得宿主細(xì)胞；和任選地，從發(fā)酵液中分離目的化 合物。
[0034] 目的核酸可以是啟動子序列。因此，本發(fā)明涉及下述方法，其中所得轉(zhuǎn)化體包含位 于靶位點的必需核酸，隨后是位于靶位點的啟動子序列的替換序列。這允許調(diào)節(jié)控制核酸 的啟動子活性。這種方法可被期望用于產(chǎn)生一個或多個基因的表達(dá)譜被修飾的轉(zhuǎn)化體。
[0035] 目的核酸可以是必需核酸自身。因此，本發(fā)明涉及下述方法，其中所得轉(zhuǎn)化體包含 位于第二位點的必需核酸，所述必需核酸也是目的核酸。這種方法可被期望用于創(chuàng)造敲除 轉(zhuǎn)化體。
[0036] 附圖簡沐
[0037] 圖1展示了 TIF35缺失構(gòu)建體pDSM-Scl、pDSM-Anl和pDSM-Anla。這種構(gòu)建體中 的必需TIF35標(biāo)記基因被用于替換原始的內(nèi)源TIF35基因。增加Cre重組酶（被tet-on系 統(tǒng)或木糖誘導(dǎo)）和loxP位點以能夠在稍后階段切除構(gòu)建體。在非誘導(dǎo)條件下，TetR-SSN6 幫助降低S. cerevisiae中Cre重組酶的基礎(chǔ)表達(dá)。額外標(biāo)記（例如KanMX、腐草霉素抗性 和GFP)是任選的，它們僅用于檢驗?zāi)康摹?br>[0038] 圖2展示了通路整合構(gòu)建體pDSM-Sc2和pDSM-An2。使用TIF35作為必需標(biāo)記將 目的基因（例如LacZ和amyB)整合在所選位點。額外標(biāo)記（例如諾爾絲菌素抗性、潮霉素 B抗性和DsRed/RFP)是任選的，它們僅用于檢驗?zāi)康?。在pDSM-Sc2的情況下，DsRed/RFP和 HygroR被放置在loxP重組位點之間以檢驗來自構(gòu)建體pDSM-Scl、pDSM-Anl或pDSM-Anla 的Cre重組酶表達(dá)的效果。
[0039] 圖 3 展示了通路整合構(gòu)建體 pDSM-Sc3、pDSM-Sc3a、pDSM-An3 和 pDSM-An3a。使用 TIF35作為必需標(biāo)記將目的基因（例如LacZ和amyB)整合在所選位點。額外標(biāo)記（例如諾 爾絲菌素抗性、潮霉素B抗性和DsRed/RFP)是任選的，它們僅用于檢驗?zāi)康?。受Tet-off 系統(tǒng)控制的Cre重組酶被包含在內(nèi)以能夠切除標(biāo)記。這將允許通過使用TIF35必需標(biāo)記基 因的反復(fù)的轉(zhuǎn)化步驟。作為Cre重組酶的替代物（包含loxP重組位點），F(xiàn)LP重組酶與FRT 重組位點一起使用。Tet-off啟動子的替代物是第二可調(diào)控啟動子，例如S. cerevisiae中 的GAL10。這允許獨立調(diào)控位于分別的染色體上的兩個CRE重組酶基因或者CRE和FLP。
[0040] 圖4 :整合構(gòu)建體，其帶有必需TIF35基因作為標(biāo)記并含有可形成（部分）通路的 多個目的基因。〇rf:開放閱讀框；Int-x:整合位點X。還有顯示TIF35可位于不同位置的 變體以及顯示細(xì)菌操縱子結(jié)構(gòu)中的多個Orf?的變體。
[0041] 圖5 :本發(fā)明的方法還可被用于敲除DNA序列或者例如替換包含啟動子和終止子 的完整基因或多個基因，或者通過插入必需功能來分裂啟動子或Orf從來僅破壞某功能。 此外，該方法可被用于例如（部分）啟動子替換（中間）或部分蛋白替換，例如以交換部分 蛋白，從而制造雜合蛋白或進(jìn)行（部分）蛋白工程。
[0042] 圖6 :程序的示意性概述。在步驟1中，由SeqA編碼的"必需功能"被重組位點R1 和R2之間的能夠替換"必需功能"的拷貝或變體構(gòu)建體（被稱為SeqA*)替換。在步驟2中， 利用被誘導(dǎo)的重組酶將這個SeqA*從SeqA位點切除，并通過構(gòu)建體X將目的基因（G0I)連 同能夠用SeqA #替代"必需功能"SeqA/SeqA*的新拷貝或變體構(gòu)建體引入到位點X。作為供 替代的選擇，可以使用步驟3代替步驟2來進(jìn)行反復(fù)轉(zhuǎn)化，利用構(gòu)建體Y在位點y進(jìn)行相同 操作。除了目的基因（G0I)之外，構(gòu)建體Y還含有位于R3和R4重組位點之間的SeqA*，以 及受相同或不同的正交誘導(dǎo)系統(tǒng)控制的相同或另一種重組酶基因。這使得能夠隨后利用Y 上的重組酶從位點y切除SeqA(或變體），所述重組酶通過相同的或正交誘導(dǎo)系統(tǒng)被誘導(dǎo)。 因此，可使用必需SeqA(或變體）基因作為選擇系統(tǒng)在反復(fù)轉(zhuǎn)化步驟中使用這種菌株。
[0043] 圖7 :程序的示意性概述。在步驟1中，必需TIF35標(biāo)記基因被loxP重組位點之 間的拷貝替換。在步驟2中，利用經(jīng)由Tet-on系統(tǒng)被誘導(dǎo)的Cre重組酶將這個TIF35拷貝 從TIF35位點切除，并通過構(gòu)建體X將目的基因（G0I)連同TIF35基因的新拷貝引入到位 點X。作為供替代的選擇，可以使用步驟3代替步驟2來進(jìn)行反復(fù)轉(zhuǎn)化，利用構(gòu)建體Y在位 點y進(jìn)行相同操作。除了目的基因（G0I)之外，構(gòu)建體Y還含有位于FRT重組位點之間的 TIF35標(biāo)記，以及FLP重組酶基因。這使得能夠隨后利用FLP重組酶從位點y切除TIF35標(biāo) 記，F(xiàn)LP重組酶通過Tet-off系統(tǒng)被誘導(dǎo)。因此，可使用必需TIF35基因作為標(biāo)記在反復(fù)轉(zhuǎn) 化步驟中使用這種菌株。
[0044] 圖8a展示了替換構(gòu)建體的示意性概述。這種構(gòu)建體中的必需TIF35標(biāo)記基因被 用于替換原始的內(nèi)源TIF35基因。增加Cre重組酶（被半乳糖誘導(dǎo)）和loxP位點以能夠 在稍后階段切除構(gòu)建體。
[0045] 圖8b展示了通路整合構(gòu)建體的示意性概述?？墒褂肨IF35作為必需標(biāo)記，將目的 基因LacZ整合在所選位點（YPRC/TUA3)。額外標(biāo)記（潮霉素B抗性和kanMX)被提供用于 檢驗?zāi)康摹?br>[0046] 圖9展示了酵母菌落在應(yīng)用所示替換性選擇的培養(yǎng)基上的生長。使包含替換構(gòu)建 體的酵母菌株在2%葡萄糖中生長直至0D為~10D/ml，隨后在2%半乳糖中CRE誘導(dǎo)2小 時。以用于組裝通路整合構(gòu)建體的片段轉(zhuǎn)化之后，使細(xì)胞在無選擇的2%葡萄糖中生長1. 5 小時（30°C )，隨后涂布在潮霉素選擇平板上（2%葡萄糖+200 y g/ml HygB)。然后將21個 單獨的菌落劃線至用于基因分型的不同選擇平板上。
[0047] 圖10展示了酵母菌落在應(yīng)用所示替換性選擇的培養(yǎng)基上的生長。使包含替換構(gòu) 建體的酵母菌株在2%葡萄糖中生長直至OD為~10D/ml。以用于組裝通路整合構(gòu)建體的 片段轉(zhuǎn)化之后，使細(xì)胞在2%半乳糖的存在下在2%葡萄糖中生長1. 5小時（30°C )，隨后涂 布在潮霉素選擇平板上（2%葡萄糖+200 μg/ml HygB)。然后將21個單獨的菌落劃線至用 于基因分型的不同選擇平板上。
[0048] 圖11展示了酵母菌落在應(yīng)用所示替換性選擇的培養(yǎng)基上的生長。使包含替換構(gòu) 建體的酵母菌株在2%葡萄糖中生長直至0D為~10D/ml。以用于組裝通路整合構(gòu)建體的 片段轉(zhuǎn)化之后，使細(xì)胞在2%半乳糖存在時于2%葡萄糖中生長過夜，隨后涂布在潮霉素選 擇平板上（2%葡萄糖+200 μg/ml HygB)。然后將21個單獨的菌落劃線至用于基因分型的 不同選擇平板上。
[0049] 圖12展示了含有替換構(gòu)建體的酵母菌株的TIF35和CRE-依賴型致死率的表征。 使酵母菌株的不同菌落生長于YEP+2%葡萄糖中（作為對照，應(yīng)該存活）或YEP+2%半乳糖 中（以誘導(dǎo)CRE重組酶）。將稀釋約1000倍的48小時培養(yǎng)物（0. 5-20D/ml)涂布在平板上 用于獨立轉(zhuǎn)化菌落
[0050] 序列表描沐
[0051] SEQ ID NOs: 1-6 展示了用于 S. cerevisiae 中的側(cè)翼區(qū)域。
[0052] SEQ ID N0s:7-14、75 和 80 展示了用于 S. cerevisiae 中的啟動子。
[0053] SEQ ID N0s:15-24、74 和 76 展示了用于 S. cerevisiae 中的編碼序列。
[0054] SEQ ID NOs:25-36 和 77 展示了用于 S. cerevisiae 中的終止子。
[0055] SEQIDN0s:37_41展示了用于真菌中的側(cè)翼區(qū)域。
[0056] SEQIDNOs:42-51展示了用于真菌中的啟動子。
[0057] SEQ ID NOs:52-61展示了用于真菌中的編碼序列。
[0058] SEQ ID NOs: 62-69展示了用于真菌中的終止子。
[0059] SEQ IDN0s:70-73展示了重組位點序列。
[0060] SEQIDN0:78展示了 URA3標(biāo)記盒的序列（包含啟動子和終止子）。
[0061] SEQIDNO: 79展示了 NAT標(biāo)記盒的序列（包含啟動子和終止子）。
[0062] 發(fā)明詳沐
[0063] 貫穿本說明書和隨同的權(quán)利要求，詞語"包含"、"包括"和"具有"以及它們的變體 應(yīng)解釋為包含性的。換言之，當(dāng)語境允許時，這些詞語旨在表達(dá)可包含未明確列舉的其它要 素或整體。
[0064] 不使用數(shù)量詞修飾時指一個或多于一個（即一個或至少一個）的語法主體。例如， "元素"可表示一個元素或多于一個元素。
[0065] 本發(fā)明涉及修飾細(xì)胞的方法。為了本發(fā)明的目的，修飾細(xì)胞意味著使用本發(fā)明的 方法改變生物體的基因構(gòu)成。這種改變可以是對生物體基因構(gòu)成的任何改變，例如缺失或 替換基因材料或者引入新的基因材料。因此，本發(fā)明涉及敲除和替換基因序列，還涉及引入 一種或多種目的核酸。
[0066] 當(dāng)本發(fā)明的方法涉及引入一種或多種目的核酸時，本發(fā)明可被視為轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方 法。
[0067] 轉(zhuǎn)化細(xì)胞意味著其中一種或多種核酸被引入到細(xì)胞中的方法。因此，轉(zhuǎn)化是細(xì)胞 的基因改變，其由直接吸收、整合和任選地表達(dá)來自其周圍的外源基因材料和通過細(xì)胞膜 攝取。因為基因材料來源于所關(guān)注或所研宄的生物體的外部，因此其被稱為外源的。
[0068] 在一些細(xì)菌物種中，轉(zhuǎn)化自然發(fā)生，但在其它細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化也能夠被人工手段影 響。在本文中，"轉(zhuǎn)化"還被用來描述將新的基因材料整合入非細(xì)菌細(xì)胞中，包括動物和植物 細(xì)胞。將核酸引入真核細(xì)胞經(jīng)常被稱為"轉(zhuǎn)染"，但在本文中，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"還包含轉(zhuǎn)染。
[0069] 本發(fā)明的方法可以是體外方法、離體方法或體內(nèi)方法。
[0070] 通過使用本發(fā)明的方法被引入細(xì)胞的核酸可以是天然存在于所關(guān)注或所研宄的 生物體中的核酸，例如以增加所給核酸的另外拷貝?；蛘?，被引入的核酸可以是并非天然存 在于