本發(fā)明屬于蔬菜商品性狀分子標(biāo)記開發(fā)和分子標(biāo)記輔助育種，具體涉及一種適用于西瓜果皮花斑性狀快速篩選的kasp分子標(biāo)記及其用途。

背景技術(shù)：

1、西瓜(citrullus?lanatus)是一種重要的園藝經(jīng)濟(jì)作物，因其果肉香甜多汁深受消費(fèi)者喜愛。此外，果皮表面覆紋是重要的外觀品質(zhì)性狀，會(huì)直接影響消費(fèi)者的消費(fèi)選擇(encinas-viso?et?al.,2014)。新穎獨(dú)特的果皮圖案能夠吸引更多消費(fèi)者(wang?et?al.,2022)。隨著人們對(duì)品質(zhì)生活需求的增加，外觀品質(zhì)也成為了現(xiàn)代西瓜育種工作的重點(diǎn)關(guān)注內(nèi)容。因此，厘清西瓜表皮覆紋花斑性狀的分子調(diào)控機(jī)制，挖掘控制果皮花紋形成基因可為外觀性狀的分子改良提供理論支撐。

2、果實(shí)外觀品質(zhì)是由其果皮決定的，果皮通常是由子房壁的組織分化發(fā)育而成的果實(shí)部分，果皮中不同的花色和圖案的表型形成主要是由色素的積累引起的，這個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程受多個(gè)功能基因和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控(趙潤(rùn)洲和劉鳴韜,2011)。目前在柑橘(lu?et?al.,2018)、蘋果(telias?et?al.,2011)、番茄(fernandez-moreno?et?al.,2016)、和梨(qianet?al.,2014)等作物果皮色素積累的分子調(diào)控方面多有研究。西瓜果皮花紋是由于果實(shí)表皮細(xì)胞分化、擴(kuò)張和色素沉著不均勻引起的，果皮特征包括條紋寬度、顏色和底色等(張磊等,2023)。西瓜果皮覆紋性狀相關(guān)的5個(gè)等位基因的顯隱性關(guān)系為g＞gw＞gm＞gn＞g(louand?wehner,2016)。在以往的研究中，已在西瓜中鑒定出一系列控制果皮條紋的相關(guān)基因座或基因，如寬窄條紋、深淺條紋、表皮顏色等(kumar?and?wehner,2011；lou?and?wehner,2016；zhang?et?al.,2017)。為豐富西瓜外觀品質(zhì)多樣性，本研究中我們開發(fā)出兩個(gè)與西瓜果皮花斑性狀高度連鎖的分子標(biāo)記，以期為基于分子標(biāo)記輔助的西瓜果皮外觀改良提供技術(shù)支撐，并開發(fā)穩(wěn)定高通量的分子標(biāo)記方法。

3、上文中涉及的參考文獻(xiàn)如下：

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種西瓜果皮花斑性狀的kasp分子標(biāo)記及其用途，本發(fā)明所獲得的分子標(biāo)記clrp(rind?pattern)為西瓜果皮花斑基因的基因標(biāo)記，能用于西瓜果皮花斑性狀的輔助選擇育種。

2、為了達(dá)到上述目的，作為第一方面，本發(fā)明提供一種西瓜果皮花斑性狀的kasp分子標(biāo)記，所述kasp分子標(biāo)記包括clm10和clm16；clm10位于西瓜基因組2號(hào)染色體的32351665bp處，前后50bp的序列如seq?id?no.1或seq?id?no.2所示；clm16位于西瓜基因組2號(hào)染色體的32250756bp處，前后50bp的序列如seq?id?no.3或seq?id?no.4所示。

3、進(jìn)一步地，所述kasp分子標(biāo)記clm10基因型為a或c，c基因型前后50bp的序列如seqid?no.1所示，對(duì)應(yīng)的表型為果皮有條紋，a基因型前后50bp的序列如seq?id?no.2所示，對(duì)應(yīng)的表型為果皮有花斑；clm16基因型為c或t，c基因型前后50bp的序列如seq?id?no.3所示，對(duì)應(yīng)的表型為果皮有條紋，t基因型前后50bp的序列如seq?id?no.4所示，對(duì)應(yīng)的表型為果皮有花斑。

4、作為第二方面，本發(fā)明提供一種上述kasp分子標(biāo)記在鑒定西瓜果皮花斑性狀中的用途。

5、進(jìn)一步地，以西瓜為物種，分子標(biāo)記引物選自下列引物對(duì)，其中的核苷酸序列為5’-3’：

6、clm10(cla97chr02:32,351,665)：

7、正向引物(f-hex)如seq?id?no.5所示：

8、gaaggtcggagtcaacggatttttttgaaagccacgacagca

9、正向引物(f-fam)如seq?id?no.6所示：

10、gaaggtgaccaagttcatgcttttttgaaagccacgacagcc

11、反向引物(r)如seq?id?no.7所示：

12、tgggaacttagggctattttttctc

13、clm16(cla97chr02:32,250,756)：

14、正向引物(f-hex)如seq?id?no.8所示：

15、gaaggtcggagtcaacggattgtagatcgcgatagactactatt

16、正向引物(f-fam)如seq?id?no.9所示：

17、gaaggtgaccaagttcatgctgtagatcgcgatagactactatc

18、反向引物(r)如seq?id?no.10所示：

19、tcactgtctacttgcgatagattac

20、進(jìn)一步地，所述kasp分子標(biāo)記在鑒定西瓜果皮花斑性狀中的用途，包括以下步驟：

21、(1)提取待測(cè)西瓜品種基因組dna；

22、(2)利用所述kasp分子標(biāo)記對(duì)西瓜基因組dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

23、(3)根據(jù)pcr擴(kuò)增結(jié)果熒光信號(hào)的差異，鑒別出每個(gè)待測(cè)西瓜的基因型；若pcr擴(kuò)增結(jié)果熒光信號(hào)顏色與正向引物f-hex的熒光接頭顏色一致，則待測(cè)西瓜為純合基因型cc；與正向引物f-fam的熒光接頭顏色一致，則待測(cè)西瓜為純合基因型tt；若pcr擴(kuò)增結(jié)果熒光信號(hào)顏色與正向引物f-hex、正向引物f-fam的熒光接頭顏色均不同，則待測(cè)西瓜為雜合基因型ct。

24、進(jìn)一步地，所述步驟(2)中，pcr擴(kuò)增使用的pcr反應(yīng)體系為：20～50ng/μl西瓜基因組dna?5.0μl，kasp?master?mix?5.0μl，kasp?assay?mix?0.14μl，共10.14μl；所述kaspassay?mix包括正向引物f-hex、正向引物f-fam和反向引物r，其摩爾濃度比為2:2:5；pcr反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃，讀取熒光信號(hào)1分鐘；94℃，預(yù)變性15分鐘；94℃，變性20秒；61℃，退火60秒，10個(gè)循環(huán)；94℃，變性20秒；55℃，退火60秒，31個(gè)循環(huán)；30℃，讀取熒光信號(hào)1分鐘。

25、本發(fā)明同時(shí)提供了上述分子標(biāo)記clrp的用途：用于西瓜果皮花斑株系或其后代分子輔助選擇育種。

26、進(jìn)一步地，所述分子標(biāo)記clrp的用途具體為：將果皮花紋基因供體zju129西瓜作為父本，果皮條紋西瓜zju132作為母本，進(jìn)行雜交獲得f1代，然后回交、自交，結(jié)合標(biāo)記輔助選擇，選擇分離群體中與zju129基因型一致的單株用于育種改良，定向選擇和改良西瓜外表皮的性狀。

27、本發(fā)明還同時(shí)提供了上述分子標(biāo)記clrp的開發(fā)方法，包括以下步驟：

28、(1)以果皮表面具有白色塊狀花斑材料zju129和果皮表面具有深綠色規(guī)則條紋材料zju132為親本進(jìn)行雜交，然后自交，從而獲得果皮花紋分離的f2、f3遺傳群體；

29、(2)提取待測(cè)西瓜品種幼嫩植株基因組dna；

30、(3)挑選f2群體中極端果皮花紋材料構(gòu)建有花斑混池和條紋混池，采用bsa(分離群體分析，bulked?segregant?analysis)定位與果皮花斑性狀相關(guān)的區(qū)域及基因；

31、(4)鑒定與西瓜果肉果皮花斑性狀緊密連鎖的snp變異和indel插入缺失變異。

32、(5)基于連鎖的變異，采用kasp(競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，kompetitive?allele?specific?polymerase?chain?reaction)方法進(jìn)行西瓜果皮花斑性狀分子標(biāo)記的篩選；

33、(6)開發(fā)出與西瓜果皮花斑性狀緊密連鎖的kasp分子標(biāo)記clrp。

34、本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：

35、(1)實(shí)施本標(biāo)記可以替代西瓜果皮花紋表型鑒定，在西瓜幼苗期即可進(jìn)行表型篩選，降低育種篩選難度，節(jié)省育種成本。

36、(2)kasp標(biāo)記可高通量快速檢測(cè)，提高育種篩選效率。

37、(3)利用本發(fā)明標(biāo)記可以在西瓜幼苗期對(duì)未知種質(zhì)的果皮花紋表型進(jìn)行預(yù)測(cè)，極大縮短性狀鑒定周期。