本發(fā)明涉及生物活性肽，更具體地，涉及一種具有抗氧化和酪氨酸酶抑制活性的發(fā)酵山茶籽多肽及其制法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、肽(peptide)即小分子的蛋白質(zhì)，是分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物，是蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能片段?；钚陨锒嚯木哂邪踩€(wěn)定、易溶于水、易吸收、分子量小等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)具有清除自由基、抗氧化、美白、抗衰老等多種生物活性。

2、山茶是我國(guó)重要的木本油料作物之一，它與油橄欖、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料植物。山茶籽粕是山茶籽經(jīng)過(guò)榨油加工后剩下的殘?jiān)?，其?shù)量相當(dāng)于茶油的3倍。油茶餅粕中蛋白質(zhì)含量約為10％～15％，其氨基酸組成為17種，其中8種為人體必需氨基酸，具有較高的利用價(jià)值。眾多研究表明，動(dòng)植物蛋白經(jīng)水解后的小分子多肽產(chǎn)物通常具有降血糖、抗氧化、抗黑素生成、降血壓等生物活性。

3、傳統(tǒng)的抗氧化肽研究過(guò)程通常包括酶解并逐步對(duì)分離出的組分進(jìn)行評(píng)價(jià)。與酶水解相比，微生物發(fā)酵具有生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，微生物來(lái)源廣泛且繁殖較快，可產(chǎn)生多種酶系發(fā)酵工藝具有提高抗氧化活性的潛力。

4、目前關(guān)于山茶籽多肽的制備與鑒定方面的研究工作很少，僅有少部分現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)了山茶籽多肽的制備，但是未能實(shí)現(xiàn)鑒定具體哪些多肽具備高抗氧活性和酪氨酸酶抑制活性。

5、因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)一種具有抗氧化和酪氨酸酶抑制活性的發(fā)酵山茶籽肽。豐富生物活性肽資源庫(kù)，促進(jìn)山茶籽粕資源的開(kāi)發(fā)利用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供了一種山茶籽肽及其制法與應(yīng)用。本發(fā)明以山茶籽為原料，獲得山茶籽肽的氨基酸序列，通過(guò)虛擬篩選得到的肽段具有良好抗氧化和酪氨酸酶抑制活性。

2、在本發(fā)明的第一方面提供了一種具有抗氧化和酪氨酸酶抑制功能的組合物，所述組合物包含分離的、合成的或重組的多肽，所述多肽包括選自下組活性肽中的一種或多種組合：

3、(1)seq?id?no:4所示的lpfr氨基酸序列，

4、(2)seq?id?no:18所示的wgfkpk氨基酸序列，

5、(3)seq?id?no:26所示的pfdlr氨基酸序列，

6、(4)seq?id?no:31所示的fpgel氨基酸序列。

7、在另一優(yōu)選例中，所述分離的、合成的或重組的多肽包含至少4個(gè)氨基酸、10個(gè)氨基酸、15個(gè)氨基酸或20個(gè)氨基酸。

8、在另一優(yōu)選例中，所述組合物還包含治療、營(yíng)養(yǎng)或化妝品用的賦形劑。

9、在本發(fā)明的第二方面提供了一種具有抗氧化和酪氨酸酶抑制功能的多肽的制備方法，包括如下步驟：

10、s1：以山茶籽為原料，將山茶籽脫脂后，利用枯草芽孢桿菌對(duì)其進(jìn)行液態(tài)搖床發(fā)酵，得到山茶籽粕發(fā)酵液；

11、s2：將步驟s1得到的山茶籽粕發(fā)酵液分離純化、冷凍干燥、多肽組學(xué)分析后得到多肽段；

12、s3：將步驟s2得到的多肽段通過(guò)基于機(jī)器學(xué)習(xí)的虛擬篩選，得到具有抗氧化和酪氨酸酶抑制功能的多肽；

13、所述多肽包括選自下組活性肽中的一種或多種組合：

14、(1)seq?id?no:4所示的lpfr氨基酸序列，

15、(2)seq?id?no:18所示的wgfkpk氨基酸序列，

16、(3)seq?id?no:26所示的pfdlr氨基酸序列，

17、(4)seq?id?no:31所示的fpgel氨基酸序列。

18、在另一優(yōu)選例中，所述發(fā)酵的條件為：脫脂山茶籽粉與水的比例為25～35g/l、接種量為15～20％、發(fā)酵時(shí)間為24～48h、發(fā)酵溫度為35～37℃、搖瓶轉(zhuǎn)速120～180r/min。

19、在另一優(yōu)選例中，所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌cgmcc?no.29154。

20、在另一優(yōu)選例中，所述步驟s2中的分離純化的方法包括超濾和lc-ms/ms液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜?？莶菅挎邨U菌在發(fā)酵過(guò)程中能生產(chǎn)出多種蛋白酶，這些蛋白酶在蛋白質(zhì)酶解為多肽片段的過(guò)程中共同發(fā)揮作用，生產(chǎn)出的多肽具有更大的生物活性潛力。

21、在另一優(yōu)選例中，所述的分離純化的具體步驟為：

22、1)首先利用超濾對(duì)山茶籽粕發(fā)酵液進(jìn)行超濾分離，得到不同分子量的多肽組分，對(duì)超濾各組分進(jìn)行真空冷凍干燥處理，測(cè)定不同分子量多肽組分的抗氧化能力和酪氨酸酶抑制能力；

23、2)收集抗氧化能力酪氨酸酶抑制能力最佳的組分，利用lc-ms/ms液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行序列鑒定解析。

24、在另一優(yōu)選例中，所述步驟s3在虛擬篩選前還包括以下步驟：

25、采用lc-ms/ms對(duì)上述組分進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定，質(zhì)譜測(cè)定的結(jié)果采用質(zhì)譜分析軟件分析，獲得多條不重復(fù)多肽序列；

26、在另一優(yōu)選例中，所述的分離純化和所述質(zhì)譜鑒定的具體步驟為：

27、1)首先利用超濾對(duì)山茶籽粕發(fā)酵液進(jìn)行超濾分離，得到不同分子量的多肽組分，測(cè)定不同分子量多肽組分的抗氧化能力和酪氨酸酶抑制能力；

28、2)收集抗氧化能力和酪氨酸酶抑制能力最佳的組分，利用lc-ms/ms液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行序列鑒定解析；

29、在另一優(yōu)選例中，所述步驟1)得到的多肽組分包括分子量＜3kd、3～10kd、＞10kd的多肽，其中＜3kd的多肽抗氧化能力和酪氨酸酶抑制能力最強(qiáng)。

30、在另一優(yōu)選例中，所述步驟s3中的虛擬篩選包括以下步驟：

31、1)將利用lc-ms/ms液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行序列鑒定解析步驟2)獲得的多肽段的序列導(dǎo)入到biopep數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)確定肽段是否為新肽；

32、2)將確定為新肽的肽段導(dǎo)入peptide?ranker網(wǎng)站進(jìn)行活性預(yù)測(cè)篩選，評(píng)分高于0.8的多肽被認(rèn)為具有潛在的生物活性，并對(duì)其進(jìn)行毒性和親水性預(yù)測(cè)；

33、3)對(duì)步驟2)篩選出的多肽進(jìn)行分子對(duì)接，根據(jù)對(duì)接結(jié)果挑選出前四條結(jié)合能較低的多肽序列，得到具有抗氧化能力和酪氨酸酶抑制能力佳的多肽；所述多肽抗氧化能力和酪氨酸酶抑制能力佳的多肽分子量＜3kd的多肽。

34、在本發(fā)明的第三方面提供了本發(fā)明第一方面所述組合物或本發(fā)明第二方面所述的制備方法得到的多肽在制備抗氧化和/或具有酪氨酸酶抑制功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

35、在另一優(yōu)選例中，所述產(chǎn)品包括以下至少一種：食品、藥品、保健品和化妝品。

36、應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

37、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下技術(shù)效果：

38、(1)本發(fā)明以山茶籽為原料，提供一種新的具有抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性多肽的氨基酸序列。

39、(2)本發(fā)明提供一種具有抗氧化活性和酪氨酸酶抑制活性多肽的制備和篩選方法，提高了多肽序列分離鑒定的效率，合能低且易溶的多肽為山茶籽粕的充分利用和深入研究提供了一定的參考，為山茶籽副產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用提供了一條新的思路，同時(shí)也為微生物發(fā)酵制備其他功能性多肽提出了一條具有潛力的途徑。

40、(3)通過(guò)本發(fā)明方法制備得到的多肽與抗氧化相關(guān)蛋白keap1和酪氨酸酶分子間相互作用強(qiáng)，活性高，可以應(yīng)用于抗氧化和抑制酪氨酸酶產(chǎn)品中。

41、(4)本發(fā)明提供的多肽無(wú)毒，具有良好的溶解性。