本技術屬于分子生物學領域，涉及基因檢測，具體的是涉及一種用于檢測宮頸癌相關基因甲基化的核酸組合物及其相應的試劑盒和用途。

背景技術：

1、對宮頸癌的診療手斷主要為宮頸/陰道細胞學涂片檢查，目前主要采用宮頸液基薄層細胞學檢查(thin-prep?cytology?test，tct)。使用tct專門的采樣器采集子宮頸細胞樣本,將采集器置入裝有細胞保存液的小瓶中進行漂洗,隨后使用全自動細胞檢測儀將樣本分散并過濾，以減少血液、粘液及炎癥組織的殘跡,最終樣本進行顯微檢測和診斷。但tct檢測較為依賴細胞病理醫(yī)生的經(jīng)驗，且受患者個人生理情況與取樣位置等影響，會對判讀結果造成一定困難，此外某些特殊類型的宮頸癌可能會出現(xiàn)假陰性。

2、此外，由于絕大部分的宮頸癌都是hpv感染所致，其中hpv?16型約占50％，hpv?18型約占20％，故hpv檢測也常作為宮頸癌篩查的手段。但hpv檢測存在特異性不足的缺點，持續(xù)陽性會造成患者恐慌，導致醫(yī)院陰道鏡檢量暴增，甚至過度醫(yī)療。

3、宮頸癌的發(fā)生可通過對癌前病變的檢查和處理得以有效控制。在宮頸上皮內瘤變(cin)發(fā)展為宮頸癌癥的過程中，伴隨著特定基因甲基化異常表達，檢測基因甲基化程度可以作為宮頸癌變的重要指標。通過基因甲基化檢測轉化性病變(部分cin2與cin3)時，可知道癌癥進展的風險，提示醫(yī)生是否立即進行治療介入或是保持觀察追蹤。因此，dna甲基化檢測可能有助于癌癥的早期檢測、風險分層和治療方案的制定。

技術實現(xiàn)思路

1、針對上述現(xiàn)有檢測方法存在的缺陷，本技術的目的在于提供一種對宮頸癌早期極具診斷價值的新型生物分子標志物，以及對應的早期篩查方法。本技術具體技術方案如下：

2、1.一種用于體外檢測宮頸癌的組合物，所述組合物包括：

3、用于檢測目標基因甲基化狀態(tài)的核酸，

4、其中，所述目標基因甲基化狀態(tài)由所述目標基因的靶序列的甲基化來表征，

5、其中，所述目標基因為jam3基因、kcnk12基因和vstm2b基因中的一種或兩種以上。

6、2.根據(jù)項1所述的組合物，其中，所述目標基因為jam3基因、kcnk12基因和vstm2b基因。

7、3.根據(jù)項1所述的組合物，其中，所述jam3基因的靶序列如seq?id?no:1-12任一項所示或所述jam3基因的靶序列包括如seq?id?no:1-12任一項所示的序列，

8、優(yōu)選的，所述jam3基因的靶序列包括如seq?id?no:1-4任一項及seq?id?no:5-8任一項所示的序列，或所述jam3基因的靶序列包括如seq?id?no:1-4任一項及seq?id?no:9-12任一項所示的序列，或所述jam3基因的靶序列包括如seq?id?no:5-8任一項及seq?idno:9-12任一項所示的序列，或所述jam3基因的靶序列包括如seq?id?no:1-4任一項及seqid?no:5-8任一項及seq?id?no:9-12任一項所示的序列。

9、4.根據(jù)項1所述的組合物，其中，所述kcnk12基因的靶序列如seq?id?no:13-24任一項所示或所述kcnk12基因的靶序列包括如seq?id?no:13-24任一項所示的序列，

10、優(yōu)選的，所述kcnk12基因的靶序列包括如seq?id?no:13-16任一項及seq?id?no:17-20任一項所示的序列，或所述kcnk12基因的靶序列包括如seq?id?no:13-16任一項及seq?id?no:21-24任一項所示的序列，或所述kcnk12基因的靶序列包括如seq?id?no:17-20任一項及seq?id?no:21-24任一項所示的序列，或所述kcnk12基因的靶序列包括如seq?idno:13-16任一項及seq?id?no:17-20任一項及seq?id?no:21-24任一項所示的序列。

11、5.根據(jù)項1所述的組合物，其中，所述vstm2b基因的靶序列如seq?id?no:25-36任一項所示或所述vstm2b基因的靶序列包括如seq?id?no:25-36任一項所示的序列，

12、優(yōu)選的，所述vstm2b基因的靶序列包括如seq?id?no:25-28任一項及seq?id?no:29-32任一項所示的序列，或所述vstm2b基因的靶序列包括如seq?id?no:25-28任一項及seq?id?no:33-36任一項所示的序列，或所述vstm2b基因的靶序列包括如seq?id?no:29-32任一項及seq?id?no:33-36任一項所示的序列，或所述vstm2b基因的靶序列包括如seq?idno:25-28任一項及seq?id?no:29-32任一項及seq?id?no:33-36任一項所示的序列。

13、6.根據(jù)項1～5中任一項所述的組合物，其中，所述用于檢測目標基因甲基化狀態(tài)的核酸包括：

14、引物，所述引物為所述目標基因的靶序列中的至少9個核苷酸的片段，所述片段包含至少一個cpg二核苷酸序列。

15、7.根據(jù)項1～6中任一項所述的組合物，其中，所述用于檢測目標基因甲基化狀態(tài)的核酸包括：

16、探針，所述探針為在中等嚴緊或嚴緊條件下雜交于所述目標基因的靶序列中的至少15個核苷酸的片段，

17、所述片段包含至少一個cpg二核苷酸序列。

18、8.根據(jù)項1～7中任一項所述的組合物，其還包括：

19、將目標基因的靶序列的5位未甲基化胞嘧啶堿基轉化為尿嘧啶的試劑。

20、9.根據(jù)項1～8中任一項所述的組合物，其中所述用于檢測目標基因甲基化狀態(tài)的核酸還包括：

21、優(yōu)先與處于非甲基化狀態(tài)的靶序列結合的阻斷劑。

22、10.根據(jù)項9所述的組合物，其中，

23、所述至少9個核苷酸的片段，其為seq?id?no:37和seq?id?no:38的序列，或者其為seq?id?no:40和seq?id?no:41的序列，或者其為seq?id?no:43和seq?id?no:44的序列，或者其為seq?id?no:46和seq?id?no:47的序列，或者其為seq?id?no:49和seq?id?no:50的序列，seq?id?no:52和seq?id?no:53的序列，或者其為seq?id?no:55和seq?id?no:56的序列，或者其為seq?id?no:58和seq?id?no:59的序列，或者其為seq?id?no:61和seq?id?no:62的序列；

24、所述至少15個核苷酸的片段，其為seq?id?no:39的序列，或seq?id?no:42的序列，或seq?id?no:45的序列，或seq?id?no:48的序列，或seq?id?no:51的序列，或seq?id?no:54的序列，或seq?id?no:57的序列，或seq?id?no:60的序列，或seq?id?no:63的序列。

25、11.一種用于體外檢測宮頸癌的寡核苷酸，其包括：

26、如seq?id?no:1-12任一項所示的序列或其互補序列中的至少9個核苷酸且包含至少一個cpg二核苷酸序列的片段；和/或

27、如seq?id?no:13-24任一項所示的序列或其互補序列中的至少9個核苷酸且包含至少一個cpg二核苷酸序列的片段；和/或

28、如seq?id?no:25-36任一項所示的序列或其互補序列中的至少9個核苷酸且包含至少一個cpg二核苷酸序列的片段。

29、12.根據(jù)項11所述的寡核苷酸，其還包括：

30、在中等嚴緊或嚴緊條件下雜交于所述如seq?id?no:1-12任一項所示的序列或其互補序列中的至少15個核苷酸且包含至少一個cpg二核苷酸序列的片段；和/或

31、在中等嚴緊或嚴緊條件下雜交于所述如seq?id?no:13-24任一項所示的序列或其互補序列中的至少15個核苷酸且包含至少一個cpg二核苷酸序列的片段；和/或

32、在中等嚴緊或嚴緊條件下雜交于所述如seq?id?no:25-36任一項所示的序列或其互補序列中的至少15個核苷酸且包含至少一個cpg二核苷酸序列的片段。

33、13.根據(jù)項11所述的寡核苷酸，其還包括：

34、優(yōu)先與處于非甲基化狀態(tài)的靶序列結合的阻斷劑。

35、14.一種用于體外檢測宮頸癌的寡核苷酸，其包括：

36、seq?id?no:37和seq?id?no:38的序列。

37、15.根據(jù)項14所述的寡核苷酸，其還包括：

38、seq?id?no:39的序列。

39、16.一種用于體外檢測宮頸癌的寡核苷酸，其包括：

40、seq?id?no:40和seq?id?no:41的序列。

41、17.根據(jù)項16所述的寡核苷酸，其還包括：

42、seq?id?no:42的序列。

43、18.一種用于體外檢測宮頸癌的寡核苷酸，其包括：

44、seq?id?no:43和seq?id?no:44的序列。

45、19.根據(jù)項18所述的寡核苷酸，其還包括：

46、seq?id?no:45的序列。

47、20.一種用于體外檢測宮頸癌的寡核苷酸，其包括：

48、seq?id?no:46和seq?id?no:47的序列。

49、21.根據(jù)項20所述的寡核苷酸，其還包括：

50、seq?id?no:48的序列。

51、22.一種用于體外檢測宮頸癌的寡核苷酸，其包括：

52、seq?id?no:49和seq?id?no:50的序列。

53、23.根據(jù)項22所述的寡核苷酸，其還包括：

54、seq?id?no:51的序列。

55、24.一種用于體外檢測宮頸癌的寡核苷酸，其包括：

56、seq?id?no:52和seq?id?no:53的序列。

57、25.根據(jù)項24所述的寡核苷酸，其還包括：

58、seq?id?no:54的序列。

59、26.一種用于體外檢測宮頸癌的寡核苷酸，其包括：

60、seq?id?no:55和seq?id?no:56的序列。

61、27.根據(jù)項26所述的寡核苷酸，其還包括：

62、seq?id?no:57的序列。

63、28.一種用于體外檢測宮頸癌的寡核苷酸，其包括：

64、seq?id?no:58和seq?id?no:59的序列。

65、29.根據(jù)項28所述的寡核苷酸，其還包括：

66、seq?id?no:60的序列。

67、30.一種用于體外檢測宮頸癌的寡核苷酸，其包括：

68、seq?id?no:61和seq?id?no:62的序列。

69、31.根據(jù)項30所述的寡核苷酸，其還包括：

70、seq?id?no:63的序列。

71、32.一種試劑盒，其包括項1～10中任一項所述的組合物或包括項11～31中任一項所述的寡核苷酸。

72、33.根據(jù)項32所述的試劑盒，其還包含選自下述的至少一種其它組分：

73、三磷酸核苷、dna聚合酶和所述dna聚合酶功能所需的緩沖液。

74、34.根據(jù)項32或33所述的試劑盒，其中，所述試劑盒用于檢測的樣本包括：細胞系、組織學切片、組織活檢/石蠟包埋的組織、體液、糞便、結腸流出物、尿、血漿、血清、全血、分離的血細胞、從血液中分離的細胞，或其組合。

75、35.根據(jù)項32～34中任一項所述的試劑盒，其還包含：說明書。

76、36.項1～10中任一項所述的組合物或項11～31中任一項所述的寡核苷酸在制備用于體外檢測宮頸癌的試劑盒中的用途。

77、37.根據(jù)項36所述的用途，其中，所述用于體外檢測宮頸癌的試劑盒通過包括如下步驟的方法來檢測宮頸癌：

78、1)分離待測生物樣品中的包括目標基因的靶序列或其片段的dna樣品；

79、2)確定所述目標基因的靶序列的甲基化狀態(tài)；

80、3)通過所述目標基因的靶序列的甲基化狀態(tài)的檢測結果判斷生物樣品的狀態(tài)，從而實現(xiàn)對宮頸癌的體外檢測。

81、38.根據(jù)項37所述的用途，其中，所述方法包括如下步驟：

82、提取待測生物樣品的基因組dna；

83、使用試劑處理提取的基因組dna，使5位未甲基化的胞嘧啶堿基轉化為尿嘧啶或其它堿基；

84、將試劑處理過的dna樣品與dna聚合酶和目標基因的靶序列的引物接觸，進行dna聚合反應；

85、用探針檢測擴增產(chǎn)物；以及

86、基于所述擴增產(chǎn)物是否存在，確定所述目標基因的靶序列的至少一個cpg二核苷酸的甲基化狀態(tài)。

87、39.根據(jù)項38所述的用途，其中，所述試劑為亞硫酸氫鹽試劑。

88、40.jam3基因、kcnk12基因、vstm2b基因中的一種或兩種以上在制備用于體外檢測宮頸癌的試劑盒中的用途。

89、41.根據(jù)項40所述的用途，其中，所述jam3基因的靶序列如seq?id?no:1-12任一項所示或所述jam3基因的靶序列包括如seq?id?no:1-12任一項所示的序列，

90、優(yōu)選的，所述jam3基因的靶序列包括如seq?id?no:1-4任一項及seq?id?no:5-8任一項所示的序列，或所述jam3基因的靶序列包括如seq?id?no:1-4任一項及seq?id?no:9-12任一項所示的序列，或所述jam3基因的靶序列包括如seq?id?no:5-8任一項及seq?idno:9-12任一項所示的序列，或所述jam3基因的靶序列包括如seq?id?no:1-4任一項及seqid?no:5-8任一項及seq?id?no:9-12任一項所示的序列。

91、42.根據(jù)項40所述的用途，其中，所述kcnk12基因的靶序列如seq?id?no:13-24任一項所示或所述kcnk12基因的靶序列包括如seq?id?no:13-24任一項所示的序列，

92、優(yōu)選的，所述kcnk12基因的靶序列包括如seq?id?no:13-16任一項及seq?id?no:17-20任一項所示的序列，或所述kcnk12基因的靶序列包括如seq?id?no:13-16任一項及seq?id?no:21-24任一項所示的序列，或所述kcnk12基因的靶序列包括如seq?id?no:17-20任一項及seq?id?no:21-24任一項所示的序列，或所述kcnk12基因的靶序列包括如seq?idno:13-16任一項及seq?id?no:17-20任一項及seq?id?no:21-24任一項所示的序列。

93、43.根據(jù)項40所述的用途，其中，所述vstm2b基因的靶序列如seq?id?no:25-36任一項所示或所述vstm2b基因的靶序列包括如seq?id?no:25-36任一項所示的序列，

94、優(yōu)選的，所述vstm2b基因的靶序列包括如seq?id?no:25-28任一項及seq?id?no:29-32任一項所示的序列，或所述vstm2b基因的靶序列包括如seq?id?no:25-28任一項及seq?id?no:33-36任一項所示的序列，或所述vstm2b基因的靶序列包括如seq?id?no:29-32任一項及seq?id?no:33-36任一項所示的序列，或所述vstm2b基因的靶序列包括如seq?idno:25-28任一項及seq?id?no:29-32任一項及seq?id?no:33-36任一項所示的序列。

95、本技術具有以下有益效果：

96、本技術篩選出了能夠靈敏和特異地檢測宮頸癌相關標志物jam3基因、kcnk12基因和vstm2b基因，并確定了相關標志物發(fā)生甲基化異常的靶序列，能夠靈敏和特異地檢測該基因的甲基化的狀態(tài)。該標志物可以用于宮頸高級別病變或宮頸癌的輔助診斷和hpv陽性分流管理，并且對于晚期轉化型cin2/3與宮頸癌具有很高的靈敏度和特異性，更加精準、高效。同時，本技術所述的組合物以非侵入性的方式用于無癥狀人群的篩查，具有無創(chuàng)傷性的特點，能夠實現(xiàn)實時監(jiān)測。

97、因此，本技術提供了一種可用于體外檢測宮頸癌的組合物、試劑盒和檢測方法，能夠方便、快捷、有效地檢測宮頸癌，具有重要的臨床應用價值。