本發(fā)明屬于精細(xì)化工，具體涉及一種以吡啶取代喹啉腈為母核的多種生物標(biāo)志物檢測(cè)探針的構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、乙酰膽堿酯酶、活性氧物種、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶及酯酶等，作為神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茲海默癥、抑郁癥)(j.am.chem.soc.2019,141,2061-2068.nat.commun.,2022,13,998)惡性腫瘤(如胰腺癌、肝癌、卵巢癌)(angew.chem.int.ed.2020,59,2-12，chem.sci.,2019,10,398-405)的特異性標(biāo)志物，對(duì)于實(shí)現(xiàn)疾病的特異性診療至關(guān)重要。

2、近紅外(nir)小分子聚集誘導(dǎo)發(fā)光(aie)染料是開(kāi)發(fā)可激活熒光探針的首選材料(angew.chem.int.ed.,2020,59,9812-9825.)。然而，由于aiegens的水溶性較差，其在水或生物系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)激活型熒光響應(yīng)仍然存在巨大挑戰(zhàn)(adv.mater.,2022,34,2107444.)。目前報(bào)道的酶響應(yīng)aie探針主要基于提高探針的水溶性并通過(guò)調(diào)節(jié)其聚集態(tài)行為來(lái)實(shí)現(xiàn)“off-on”的特異性熒光響應(yīng)(j.am.chem.soc.,2019,141,3171-3177.)。具體來(lái)說(shuō)可以分為靶向型和酶切響應(yīng)型，主要通過(guò)水溶性的單元提升探針在水中的初始溶解狀態(tài)，在靶向聚集或者酶切導(dǎo)致溶解度下降之后發(fā)生聚集，產(chǎn)生aie信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定物質(zhì)的響應(yīng)，這種方法對(duì)溶液中的體外檢測(cè)有效(bioconjugate?chem.,2020,31,276-292.)。然而，生物系統(tǒng)不是純水環(huán)境，很多生物干擾物容易引起探針的不良聚集，產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)(acs?nano,2023,17,15,14347-14405.)。因此，提高探針的水溶性并通過(guò)操縱激發(fā)態(tài)能量流向，共同猝滅探針的初始熒光對(duì)構(gòu)建應(yīng)用于特異性生物標(biāo)志物檢測(cè)的aie可控激活型熒光探針?lè)浅Ｖ匾?/p>

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述現(xiàn)有熒光探針存在的不足，本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有aie熒光探針在生物環(huán)境應(yīng)用遇到的困難，通過(guò)調(diào)控聚集態(tài)及激發(fā)態(tài)能量，提高生物相容性、降低熒光量子產(chǎn)率，并實(shí)現(xiàn)對(duì)相關(guān)生物標(biāo)志物可視化檢測(cè)。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、本發(fā)明第一方面，提供了一種激活型喹啉腈聚集誘導(dǎo)發(fā)光探針，結(jié)構(gòu)如下式ⅰ所示：

4、

5、式ⅰ中，

6、其中r1選自中的一種；

7、r2選自氫、碳鏈、鹵素或其同位素、羥基、巰基、氨基、羧基、磺酸基、磷酸基、二甲氨基、三甲胺基、吡啶或其衍生物、酯基或其衍生物或聚乙烯鏈中的一種；

8、r3選自三苯胺、n,n-二苯基-4-(噻吩-2-基)苯胺、n,n-二甲基-4-(噻吩-2-基)苯胺、1-乙基-4-苯基吡啶鎓、n,n-二甲基苯胺、9-(噻吩-2-基)-9h-咔唑、2-(9h-芴-9-基)噻吩中的一種；

9、r4選自下式中的任意一種：

10、

11、其中x為o或n。

12、優(yōu)選的，該探針的結(jié)構(gòu)選自如下任意一種：

13、

14、本發(fā)明第二方面，提供了上述激活型喹啉腈聚集誘導(dǎo)發(fā)光探針的制備方法，包括以下步驟：以吡啶取代喹啉腈為原料，通過(guò)knoevenage縮合反應(yīng)連接r3，再通過(guò)取代反應(yīng)連接r4基團(tuán)，反應(yīng)路線如下：

15、

16、具體制備步驟如下：

17、a、染料ache-qm的合成

18、

19、在反應(yīng)容器中加入摩爾比為5:6的py-qm和ache-i，并加入有機(jī)溶劑(優(yōu)選乙腈)溶解，惰性氣體(如氮?dú)?保護(hù)下加熱回流10～14h(優(yōu)選12h)，反應(yīng)結(jié)束后，旋干溶劑，dcm:meoh＝20:1的硅膠柱色譜分離，得產(chǎn)物ache-qm；

20、b、產(chǎn)物合成

21、在反應(yīng)容器中，將ache-qm、有機(jī)溶劑、r4和哌啶依次加入，其中，ache-qm與r4之間的摩爾比為3:4～4:5，有機(jī)溶劑和哌啶之間的體積比為30:1，ache-qm的摩爾濃度為0.02～0.03mol/l；

22、在惰性氣體(如氮?dú)?保護(hù)下，加熱至100℃，攪拌回流8h反應(yīng)充分后，去除反應(yīng)溶液，經(jīng)dcm:meoh＝10～20:1硅膠色譜分離，得產(chǎn)物ache-qm-tpe。

23、本發(fā)明第三方面，提供了上述所述的激活型喹啉腈聚集誘導(dǎo)發(fā)光探針在制備酶或活性氧檢測(cè)試劑中的應(yīng)用，其中，所述酶為乙酰膽堿酯酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或酯酶。

24、檢測(cè)步驟如下：制備探針儲(chǔ)備液，將探針儲(chǔ)備液稀釋到一定濃度，與待測(cè)物質(zhì)、細(xì)胞或活體進(jìn)行孵育、注射、檢測(cè)。

25、優(yōu)選的，檢測(cè)濃度為0.01-100μm；儲(chǔ)備液溶劑選自二甲基亞砜、四氫呋喃、甲醇、乙醇、甲苯、二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙腈、水、緩沖液中的任意一種或多種；所述緩沖液選自3-羥甲基氨基甲烷溶液、磷酸鹽緩沖液，羥乙基哌嗪乙硫磺酸溶液，醋酸鹽緩沖液，tris緩沖液，碳酸鹽緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液，hepes緩沖液中的任意一種或多種。

26、具體應(yīng)用方面，本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)體外對(duì)乙酰膽堿酯酶、活性氧的實(shí)時(shí)線性響應(yīng)；可以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)乙酰膽堿酯酶的可視化成像；可以繪制顱內(nèi)乙酰膽堿酯酶分布；可以實(shí)現(xiàn)胰腺癌中活性氧物種的可視化成像。

27、酶響應(yīng)測(cè)試：在上述探針溶液中加入不同當(dāng)量(可描述為濃度、酶活)的特異性生物標(biāo)志物，測(cè)試在不同時(shí)間點(diǎn)的紫外吸收和熒光響應(yīng)情況。

28、細(xì)胞成像：將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到具有1.0ml培養(yǎng)基的nest共聚焦小皿中培養(yǎng)12h。加入所需濃度的探針，37℃孵育相應(yīng)的時(shí)間，再加入pbs洗滌，除去未攝入的探針。然后使用leicatcs?sp8激光顯微鏡進(jìn)行共聚焦熒光成像。在所屬探針對(duì)于激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)處采集探針培養(yǎng)的細(xì)胞熒光信號(hào)。

29、活體成像：對(duì)于不同小鼠模型，采用尾靜脈、腹腔或原位注射方式進(jìn)行給藥，在不同時(shí)間點(diǎn)采集活體熒光成像。

30、組織切片及完整組織離體成像：在上述活體成像完成后，處死小鼠，經(jīng)解剖獲取不同組織器官。組織切片成像：對(duì)特定組織或器官進(jìn)行切片處理(包括冰凍和石蠟)，獲取相應(yīng)切片，切片成像方式同細(xì)胞成像。組織離體成像：對(duì)組織進(jìn)行透明化處理，然后根據(jù)特定探針波長(zhǎng)，通過(guò)光片顯微鏡成像采集數(shù)據(jù)，經(jīng)配準(zhǔn)、三維重構(gòu)等技術(shù)手段處理數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)完整組織的可視化成像。

31、本發(fā)明第四方面，提供了一種酶或活性氧檢測(cè)試劑，包括激活型喹啉腈聚集誘導(dǎo)發(fā)光探針以及溶劑。其中，酶為乙酰膽堿酯酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或酯酶；激活型喹啉腈聚集誘導(dǎo)發(fā)光探針以及溶劑均如上所述。

32、本發(fā)明的有益技術(shù)效果：

33、效果方面，本發(fā)明提供的aie探針可以實(shí)現(xiàn)乙酰膽堿酯酶、ros的超靈敏檢測(cè)，具有快速線性響應(yīng)；同時(shí)該aie探針還實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物的檢測(cè)，以及衰老小鼠顱內(nèi)乙酰膽堿酯酶檢測(cè)與分布繪制。

34、制備技術(shù)方面，本發(fā)明的aie探針的制備方法簡(jiǎn)單，不需要苛刻的反應(yīng)條件，有利于后續(xù)的擴(kuò)大化試驗(yàn)或生產(chǎn)。