本發(fā)明涉及腸癌試劑盒檢測領(lǐng)域，具體而言，涉及一種腸癌臨床用藥突變基因檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：近些年來，靶向治療使腫瘤的死亡率得到了有效的控制。靶向治療具有高選擇性和低毒性等優(yōu)點(diǎn)，可以長期指導(dǎo)臨床用藥，其作用機(jī)理是針對腫瘤細(xì)胞特有的靶點(diǎn)設(shè)計結(jié)合藥物，避免了傳統(tǒng)治療方法的缺點(diǎn)，從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞分裂增殖的作用，對患者而言不僅延長了患者的生存時間還改善了患者的生存質(zhì)量。目前，臨床上已經(jīng)確定的與腫瘤或癌癥突變相關(guān)的基因有很多個，而當(dāng)這些基因發(fā)生突變時，改變了細(xì)胞對相應(yīng)的靶向藥物的敏感性，從而引起耐藥性。為了更有效地指導(dǎo)臨床用藥，需要對不同的患病個體進(jìn)行相應(yīng)腫瘤突變位點(diǎn)的檢測，因而，市場上也出現(xiàn)了各種用于檢測不同腫瘤或癌癥的相關(guān)基因突變的檢測試劑盒。而目前市場上各個不同廠家生產(chǎn)的檢測試劑盒并無同一標(biāo)準(zhǔn)，因而，使用這類基因突變檢測試劑盒的檢測結(jié)果也存在差異，進(jìn)而使得檢測結(jié)果對臨床用藥的指導(dǎo)意義不大。針對這一現(xiàn)狀，目前還沒有很好的解決辦法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的主要目的在于提供一種腸癌臨床用藥突變基因檢測試劑盒，以解決現(xiàn)有技術(shù)中腸癌基因突變的檢測試劑盒的檢測結(jié)果存在多樣性而缺乏臨床指導(dǎo)意義的問題。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種腸癌臨床用藥突變基因檢測試劑盒，該試劑盒包括文庫構(gòu)建相關(guān)試劑，文庫構(gòu)建相關(guān)試劑包括2×hifi熱啟動酶緩沖液，2×hifi熱啟動酶緩沖液包括：850～950mmtris-hcl、3.5～5.5mmmgcl2、0.04u/μl高保真熱啟動酶和0.5～0.7mm雙脫氧核糖核酸。進(jìn)一步地，2×hifi熱啟動酶緩沖液包括：900mmtris-hcl、5mmmgcl2、0.04u/μl高保真熱啟動酶和0.6mm雙脫氧核糖核酸。進(jìn)一步地，試劑盒還包括：腸癌臨床用藥突變基因捕獲相關(guān)試劑，腸癌臨床用藥突變基因捕獲試劑包括腸癌臨床用藥突變基因捕獲探針。進(jìn)一步地，腸癌臨床用藥突變基因捕獲探針包括表1所示的基因的突變位點(diǎn)的捕獲探針：表1：進(jìn)一步地，表1所示的基因的突變位點(diǎn)的捕獲探針在表2所示區(qū)域內(nèi)通過疊瓦式設(shè)計獲得：表2：進(jìn)一步地，腸癌臨床用藥突變基因捕獲探針為探針混合物，探針混合物的濃度為20～30ng/μl，優(yōu)選為25ng/μl。進(jìn)一步地，腸癌臨床用藥突變基因捕獲試劑還包括雜交通用引物和雜交index引物；優(yōu)選地，雜交通用引物的濃度為225～275μm，更優(yōu)選為250μm；優(yōu)選地，雜交index引物的濃度為22.5～27.5μm，更優(yōu)選為25μm；優(yōu)選地，雜交index引物為24～96個，更優(yōu)選為48個。進(jìn)一步地，腸癌臨床用藥突變基因捕獲試劑還包括2×雜交緩沖液、雜交組分a以及cotdna，2×雜交緩沖液為2m的四甲基氯化銨緩沖液，雜交組分a為100％的甲酰胺；優(yōu)選地，腸癌臨床用藥突變基因捕獲試劑還包括2×hifi熱啟動酶緩沖液和捕獲樣本富集引物；更優(yōu)選，腸癌臨床用藥突變基因捕獲試劑中的2×hifi熱啟動酶緩沖液與文庫構(gòu)建相關(guān)試劑中的2×hifi熱啟動酶緩沖液相同；更優(yōu)選，捕獲樣本富集引物的濃度為3～6μm，進(jìn)一步優(yōu)選為5μm。進(jìn)一步地，試劑盒還包括陰性對照品和陽性對照品。進(jìn)一步地，文庫構(gòu)建相關(guān)試劑包括：末端修復(fù)加a反應(yīng)體系、接頭連接體系以及文庫富集引物；優(yōu)選地，末端修復(fù)加a反應(yīng)體系包括末端修復(fù)加a反應(yīng)緩沖液以及末端修復(fù)加a酶，更優(yōu)選地，末端修復(fù)加a反應(yīng)緩沖液包括400～600mmtris-hcl、80～120mmmgcl2、80～120mmdtt、8～10nmatp、3～5mmdatp、3～5mmdctp、3～5mmdgtp、3～5mmdttp；末端修復(fù)加a酶的濃度為0.04～0.06u/μl；優(yōu)選地，接頭連接體系包括雙鏈寡核苷酸接頭、dna連接酶以及dna連接酶緩沖液；更優(yōu)選地，雙鏈寡核苷酸接頭為24～96個，進(jìn)一步優(yōu)選為48個；dna連接酶的濃度為0.04～0.06u/μl；dna連接酶緩沖液包括800～900mm的tris-hcl、40～60mm的mgcl2、40～60mm的dtt及0.5～1.5mm的atp；優(yōu)選地，文庫富集引物的濃度為3～6μm，進(jìn)一步優(yōu)選為5μm。應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，通過對文庫構(gòu)建相關(guān)試劑中的熱啟動酶緩沖液進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化，并控制該熱啟動酶緩沖液體系包含850～950mmtris-hcl、3.5～5.5mmmgcl2、0.04u/ul高保真熱啟動酶以及0.5～0.7mm雙脫氧核糖核酸，使得各組分間的協(xié)同配合作用更加精準(zhǔn)，提高了高保真熱啟動酶hifi的保真性能，進(jìn)而提高了擴(kuò)增文庫的保真性，從而使得對突變基因檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，降低了假陽性率，為臨床用藥提供相對更準(zhǔn)確的指導(dǎo)意義。具體實(shí)施方式需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相互組合。下面將結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。如
背景技術(shù)：
所提到的，現(xiàn)有技術(shù)中與癌癥相關(guān)的基因突變的檢測試劑盒的檢測結(jié)果存在多樣性而缺乏臨床指導(dǎo)意義，而目前尚無有效的解決辦法。在本申請一種典型的實(shí)施方式中，提供了一種腸癌臨床用藥突變基因檢測試劑盒，該試劑盒包括：文庫構(gòu)建相關(guān)試劑，文庫構(gòu)建相關(guān)試劑包括2×hifi熱啟動酶緩沖液，2×hifi熱啟動酶緩沖液包括：850～950mmtris-hcl、3.5～5.5mmmgcl2、0.04u/μl高保真熱啟動酶和0.5～0.7mm雙脫氧核糖核酸。本申請的上述腸癌臨床用藥突變基因檢測試劑盒，通過對文庫構(gòu)建相關(guān)試劑中的熱啟動酶緩沖液進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化，并控制該熱啟動酶緩沖液體系包含850～950mmtris-hcl、3.5～5.5mmmgcl2、0.04u/μl高保真熱啟動酶以及0.5～0.7mm雙脫氧核糖核酸，使得各組分間的協(xié)同配合作用更加精準(zhǔn)，提高了高保真熱啟動酶hifi的保真性能，進(jìn)而提高了擴(kuò)增文庫的保真性，從而使得對突變基因檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，降低了假陽性率，為臨床用藥提供相對更準(zhǔn)確的指導(dǎo)意義。為了進(jìn)一步降低上述試劑盒檢測的假陽性率，在本申請一種優(yōu)選的實(shí)施例中，2×hifi熱啟動酶緩沖液包括：900mmtris-hcl、5mmmgcl2、0.04u/μl高保真熱啟動酶和0.6mm雙脫氧核糖核酸。該優(yōu)選實(shí)施例所制備的文庫，檢測得到的基因突變的假陽性率更低。在上述試劑盒成分的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步提高試劑盒應(yīng)用的便利性，在本申請一種優(yōu)選的實(shí)施例中，上述試劑盒還包括：腸癌臨床用藥突變基因捕獲相關(guān)試劑，腸癌臨床用藥突變基因捕獲試劑包括腸癌臨床用藥突變基因捕獲探針。通過在上述試劑盒中同時包含腸癌臨床用藥突變基因捕獲相關(guān)試劑，便于直接獲得與腸癌臨床用藥相關(guān)突變基因的文庫信息。上述優(yōu)選實(shí)施例中，腸癌臨床用藥突變基因捕獲探針根據(jù)實(shí)際操作中選擇的與腸癌用藥相關(guān)的基因的不同而不同。在本申請一種優(yōu)選的實(shí)施例中，腸癌臨床用藥突變基因捕獲探針包括表1所示的基因的突變位點(diǎn)的捕獲探針：表1：。上述優(yōu)選實(shí)施例中，表1所示的基因的突變位點(diǎn)能夠涵蓋目前已知的腸癌臨床用藥突變基因。具體地，在結(jié)直腸癌中，當(dāng)kras基因出現(xiàn)第2號外顯子區(qū)域的g12s、g12c、g12d、g12a、g12v突變中的一種和/或g13d突變時，患者將對egfr抑制劑藥物應(yīng)答低下。當(dāng)nras基因出現(xiàn)第2號外顯子區(qū)域的g12d突變和/或第3號外顯子區(qū)域的q61r、q61k突變中的一種時，患者將對egfr抑制劑藥物應(yīng)答低下。當(dāng)braf基因出現(xiàn)第15號外顯子區(qū)域的v600e突變時，患者將對egfr抑制劑藥物應(yīng)答低下。當(dāng)pik3ca基因出現(xiàn)第20號外顯子區(qū)域的h1047r突變時，患者將對egfr抑制劑藥物應(yīng)答低下。針對上述表1中的基因的突變位點(diǎn)的探針可以采用現(xiàn)有的探針設(shè)計方法進(jìn)行設(shè)計獲得。在本申請一種優(yōu)選的實(shí)施例中，表1所示的基因的突變位點(diǎn)的捕獲探針在表2所示區(qū)域內(nèi)通過疊瓦式設(shè)計獲得：表2：本申請的上述探針，通過以待檢測位點(diǎn)為中心，上下游各選取一定區(qū)域，在該區(qū)域內(nèi)設(shè)計探針使得每條探針之間像瓦片一樣錯開。探針的總數(shù)可達(dá)210萬條。針對同一檢測位點(diǎn)的探針序列多樣化且探針密度很大，確保每條待檢測區(qū)域的dna模板都有對應(yīng)探針與之結(jié)合，大大提高了覆蓋度和捕獲效率。根據(jù)待檢測區(qū)域，進(jìn)一步優(yōu)化每種探針的濃度，可使得檢測均一性更好。在本申請一種優(yōu)選的實(shí)施例中，腸癌臨床用藥突變基因捕獲探針為探針混合物，探針混合物的濃度為20～30ng/μl，優(yōu)選為25ng/μl。在上述試劑盒成分的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步提高試劑盒應(yīng)用的便利性，在本申請一種優(yōu)選的實(shí)施例中，腸癌臨床用藥突變基因捕獲試劑還包括雜交通用引物和雜交index引物；優(yōu)選地，雜交通用引物的濃度為225～275μm，更優(yōu)選為250μm；優(yōu)選地，雜交index引物的濃度為22.5～27.5μm，更優(yōu)選為25μm；優(yōu)選地，雜交index引物為24～96個，更優(yōu)選為48個。同樣地，上述試劑盒在含有上述成分的同時，還可以包括其他有助于進(jìn)行捕獲的試劑。在本申請一種優(yōu)選的實(shí)施例中，腸癌臨床用藥突變基因捕獲試劑還包括2×雜交緩沖液、雜交組分a以及cotdna(即胎盤dna)，2×雜交緩沖液為2m的四甲基氯化銨緩沖液，雜交組分a為100％的甲酰胺；優(yōu)選地，腸癌臨床用藥突變基因捕獲試劑還包括2×hifi熱啟動酶緩沖液和捕獲樣本富集引物；更優(yōu)選，腸癌臨床用藥突變基因捕獲試劑中的2×hifi熱啟動酶緩沖液與文庫構(gòu)建相關(guān)試劑中的所述2×hifi熱啟動酶緩沖液相同；更優(yōu)選，捕獲樣本富集引物的濃度為3～6μm，進(jìn)一步優(yōu)選為5μm。為了進(jìn)一步提高試劑盒的檢測準(zhǔn)確性及便利性，在本申請一種優(yōu)選的實(shí)施例中，上述試劑盒還包括陰性對照品和陽性對照品。陰性對照品為11個位點(diǎn)均未野生型的dna，陽性對照品為含11種基因突變序列的dna。為了進(jìn)一步提高試劑盒使用的便利性，在本申請一種優(yōu)選的實(shí)施例中，上述文庫構(gòu)建相關(guān)試劑包括：末端修復(fù)加a反應(yīng)體系、接頭連接體系以及文庫富集引物；優(yōu)選地，末端修復(fù)加a反應(yīng)體系包括末端修復(fù)加a反應(yīng)緩沖液以及末端修復(fù)加a酶，更優(yōu)選地，末端修復(fù)加a反應(yīng)緩沖液包括400～600mmtris-hcl、80～120mmmgcl2、80～120mmdtt、8～10nmatp、3～5mmdatp、3～5mmdctp、3～5mmdgtp、3～5mmdttp；所述末端修復(fù)加a酶的濃度為0.04～0.06u/μl；優(yōu)選地，接頭連接體系包括雙鏈寡核苷酸接頭、dna連接酶以及dna連接酶緩沖液；更優(yōu)選地，雙鏈寡核苷酸接頭為24～96個，進(jìn)一步優(yōu)選為48個；述dna連接酶的濃度為0.04～0.06u/μl；所述dna連接酶緩沖液包括800～900mm的tris-hcl、40～60mm的mgcl2、40～60mm的dtt及0.5～1.5mm的atp；優(yōu)選地，文庫富集引物的濃度為3～6μm，進(jìn)一步優(yōu)選為5μm。下面將結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本申請的有益效果。需要說明的是，以下實(shí)施例以不含腸癌臨床用藥突變基因的陰性樣本為實(shí)驗(yàn)對象，來詳細(xì)說明本申請的試劑盒在降低假陽性率方面的有益效果。陰性樣本為四個不同的dna混合物，這四個不同的dna混合物的來源不同，但均不含有腸癌用藥相關(guān)基因的突變，分別命名為n1、n2、n3和n4。具體所使用的試劑盒的成分見下表3：表3：附：pre-pcr引物：指文庫富集引物；post-pcr引物指捕獲樣本富集引物；cotdna：指胎盤dna；上述試劑盒中的引物及探針的具體序列見后續(xù)的表21。實(shí)驗(yàn)一：文庫構(gòu)建進(jìn)行文庫構(gòu)建，具體步驟如下：.(1)末端修復(fù)及加a取dna樣品和試劑依次加入配制混合液1(見表4，渦旋震蕩混勻后，于pcr儀中20℃孵育30分鐘，65℃孵育30分鐘。表4：組分加入量dna樣品1大于等于20ng末端修復(fù)&加a緩沖液7μl末端修復(fù)&加a酶3μl水補(bǔ)足至60μl1陰性對照品和陽性對照品濃度為5ng/μl，各加入4μl即可。(2)添加接頭向末端修復(fù)&加a后的混合液1中依次加入試劑配制混合液2(見表5)，用移液器吹打混勻后，于pcr儀中20℃孵育15分鐘。表5：組分加入量(μl)末端修復(fù)&加a后的混合液160dna連接酶緩沖液30dna連接酶10接頭25水5合計1102接頭的使用濃度根據(jù)如下表6格進(jìn)行調(diào)整：表6：模板dna量/ng接頭的濃度/μm1000155001525015100155015257.510351.52.50.7510.3(3)添加接頭后純化1)將添加接頭后的110μl混合液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，向其中加入88μl純化磁珠，用移液器吹打混勻，室溫靜置5～15分鐘，使dna和磁珠充分結(jié)合。2)將離心管置于磁力架上至溶液澄清后，用移液器吸去上清。3)向離心管中加入200μl80％乙醇，室溫靜置30秒，用移液器吸去上清。4)重復(fù)上一步，室溫靜置3～5分鐘至乙醇完全揮發(fā)。注：避免磁珠過干。5)乙醇完全揮發(fā)后，從磁力架上取下離心管，每個離心管中分別依次加入22μl水，用移液器吹打混勻，室溫靜置2分鐘。6)將離心管置于磁力架上至溶液上清澄清后，取1μl上清用于qubit定量。(4)文庫富集1)分別按下表7要求依次加入試劑配制混合液3于兩個不同的pcr管中，制備兩個平行的文庫以做對比。表7：組分加入量(μl)上清202×hifi熱啟動酶緩沖液a/b25pre-pcr引物5合計50附：2×hifi熱啟動酶緩沖液a代表上表3中的2×hifi熱啟動酶緩沖液體系；2×hifi熱啟動酶緩沖液b代表的2×hifi熱啟動酶緩沖液的成份為：1000mmtris-hcl、2mmmgcl2、0.04u/μl高保真熱啟動酶hifi以及0.4mm雙脫氧核糖核酸。2)調(diào)整移液器至最佳量程上下吹打混勻液體并蓋好pcr管蓋，短暫離心。3)將配制好的混合液3置于pcr儀，按以下表8的反應(yīng)程序擴(kuò)增：表8：3具體循環(huán)數(shù)可根據(jù)如下表9進(jìn)行調(diào)整：表9：pcr模板dna量/ng循環(huán)數(shù)0.512～13111～1259～11107～9505～61003～45001～2注：擴(kuò)增后的產(chǎn)物于4℃或～20℃保存，但不超過72小時。4)擴(kuò)增后純化及片段大小分選①將50μl擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，加入50μl純化磁珠，渦旋震蕩混勻。室溫靜置15分鐘。②將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。③向離心管中加入200μl80％乙醇，室溫靜置30秒，用移液器吸去上清。④重復(fù)上一步，室溫靜置3～5分鐘至乙醇完全揮發(fā)。注：避免磁珠過干。⑤從磁力架上取下離心管，加50μl水，用移液器吹打混勻，室溫靜置2分鐘。⑥將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器移取50μl上清至新的離心管中。⑦向上述50μl上清中加入35μl純化磁珠，渦旋震蕩混勻，室溫靜置10分鐘。⑧將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸取上清約85μl于新的離心管中注：此步需小心留取上清，而非棄上清。⑨向上述85μl上清中，加入10μl純化磁珠，渦旋震蕩混勻，室溫靜置10分鐘。⑩將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。向離心管中加入200μl80％乙醇，室溫靜置30秒，用移液器吸去上清。重復(fù)上一步，室溫靜置數(shù)秒至乙醇完全揮發(fā)。注：避免磁珠過干。乙醇完全揮發(fā)后，從磁力架上取下離心管，加52μl水，用移液器吹打混勻，室溫靜置2分鐘。將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸取1μl進(jìn)行qubit定量檢測，吸取50μl上清至新的離心管中。dna文庫樣品質(zhì)量分析：對文庫樣品進(jìn)行qubit定量，濃度應(yīng)不小于2.5ng/μl；用2100生物分析儀分析文庫大小，應(yīng)在于150～500bp之間。注：純化后的文庫溶液應(yīng)在-20℃條件下保存，于7天內(nèi)完成后續(xù)處理。(5)文庫雜交和捕獲1)按下表10的要求依次加入試劑配制混合液4于新的1.5ml離心管中：表10：組分加入量dna文庫混合樣品1μg4雜交通用引物1000pmol雜交index引物1000pmol5cotdna5μl4根據(jù)文庫樣品濃度計算樣本量，按下表11等質(zhì)量加入文庫樣本。1個捕獲樣本至少加入8個文庫，至多加入12個文庫：表11：5應(yīng)加入與接頭相對應(yīng)的雜交index引物，加入量根據(jù)以下表12調(diào)整：表12：組分加入量雜交index引物15μl(125pmol)雜交index引物25μl(125pmol)雜交index引物35μl(125pmol)雜交index引物45μl(125pmol)雜交index引物55μl(125pmol)雜交index引物65μl(125pmol)雜交index引物75μl(125pmol)雜交index引物85μl(125pmol)2)用移液器吹打混勻后，用真空離心濃縮儀在60℃、1350r/min下進(jìn)行干燥，直至液體完全蒸干。3)待液體蒸干后，按下表13加入試劑配制混合液5：表13：組分加入量(μl)2×雜交緩沖液7.5雜交組分a3合計10.54)向干燥后的混合液4中，加入10.5μl混合液5配成雜交混合液，渦旋震蕩混勻，短暫離心以去除管壁殘留。于恒溫金屬浴儀95℃孵育10分鐘使dna變性，短暫離心以去除管壁殘留。5)用移液器將雜交混合液轉(zhuǎn)移至新的pcr管中，加入4.5μl探針，渦旋震蕩混勻，短暫離心以去除管壁殘留。于pcr儀47℃孵育16～20小時，同時pcr儀加熱蓋溫度設(shè)置為57℃以上。(6)文庫清洗1)緩沖液的稀釋方法見下表14：表14：組分超純水加入量(μl)30μl～10×洗脫緩沖液i27020μl～10×洗脫緩沖液ii18020μl～10×洗脫緩沖液iii18040μl～10×洗脫緩沖液iv360200μl～2.5×磁珠洗脫緩沖液3002)取100μl1×洗脫緩沖液i和400μl1×洗脫緩沖液iv在47℃預(yù)熱至少2小時。3)取100μl捕獲磁珠于新的1.5ml離心管中，將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。4)從磁力架上取下離心管，加入200μl1×磁珠洗脫緩沖液，渦旋震蕩混勻。將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。5)重復(fù)上一步。6)向離心管加入100μl1×磁珠洗脫緩沖液，渦旋震蕩混勻。將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。7)取雜交后的文庫樣品15μl，加入到磁珠離心管中，用移液器吹打混勻，于pcr儀47℃孵育45分鐘。每間隔15分鐘渦旋震蕩3秒，使磁珠處于懸浮狀態(tài)。8)孵育結(jié)束后，向離心管中加入100μl47℃預(yù)熱的1×洗脫緩沖液i，渦旋震蕩混勻。9)將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。10)從磁力架上取下離心管，加入200μl47℃預(yù)熱的1×洗脫緩沖液iv，用移液器吹打混勻。于恒溫金屬浴儀47℃孵育5分鐘。11)重復(fù)一次9)～10)的步驟。12)將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。13)從磁力架上取下離心管，每個離心管中分別依次加入200μl未加熱的1×洗脫緩沖液i，渦旋震蕩2分鐘。將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。14)從磁力架上取下離心管，每個離心管中分別依次加入200μl1×洗脫緩沖液ii，渦旋震蕩1分鐘。將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。15)從磁力架上取下離心管，每個離心管中分別依次加入200μl1×洗脫緩沖液iii，渦旋震蕩30秒。將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。16)從磁力架上取下離心管，加入40μl水，用移液器吹打混勻。將混勻后的液體標(biāo)記為“1”。(7)捕獲樣本富集及純化1)按下表15配制混合液6表15：組分加入量(μl)2×hifi熱啟動酶緩沖液a/b50post-pcr引物10合計602×hifi熱啟動酶緩沖液a/b同表7。2)將混合液6與“1”混合，渦旋震蕩混勻。按50μl/管分裝量分裝到兩個新的pcr管中，按以下表16的反應(yīng)程序擴(kuò)增：表16：注：擴(kuò)增后的產(chǎn)物可于2～8℃保存，但不超過72小時。3)將100μl擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離心管中，加入180μl純化磁珠，渦旋震蕩混勻。室溫靜置15分鐘。4)將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器吸去上清。5)向離心管中加入200μl80％乙醇，室溫靜置30秒，用移液器吸去上清。6)重復(fù)上一步，室溫靜置3～5分鐘至乙醇完全揮發(fā)。注：避免磁珠過干。7)乙醇完全揮發(fā)后，從磁力架上取下離心管，分別加入52μl水。用移液器吹打混勻，室溫靜置2分鐘。8)將離心管置于磁力架上使磁珠進(jìn)行磁力收集，至溶液上清澄清后，用移液器轉(zhuǎn)移50μl上清于新的離心管中。此時捕獲的文庫樣品處于上清中。注：純化后的文庫溶液應(yīng)在～20℃以下保存7天。(8)上機(jī)測序使用illumina公司生產(chǎn)的nextseq500測序儀及相關(guān)配套試劑進(jìn)行上機(jī)測序。經(jīng)生物信息學(xué)分析得到以下結(jié)果。陰性對照品和陽性對照品在采用本申請的2×hifi熱啟動酶緩沖液a和作為比較例的2×hifi熱啟動酶緩沖液b進(jìn)行文庫富集及捕獲樣本富集，所得到的檢測結(jié)果見下表17和表18。表17：表18：從表17和表18可以看出，無論采用本申請的試劑盒中還是采用作為比較例的試劑盒，其中陰性對照品和陽性對照品的檢測結(jié)果都全部合格，都表明整個實(shí)驗(yàn)體系沒有污染，沒有錯誤。此次試驗(yàn)的結(jié)果可信。進(jìn)一步檢測陰性樣本在采用本申請的2×hifi熱啟動酶緩沖液a和作為比較例的2×hifi熱啟動酶緩沖液b進(jìn)行文庫富集及捕獲樣本富集后結(jié)果，所得到的檢測結(jié)果分別見表19和20。表19：已知上述4種陰性參考品的11個位點(diǎn)均未發(fā)生突變。將ngs檢測結(jié)果大于等于千分之三的突變判定為陽性，根據(jù)檢測結(jié)果可以計算出假陽性率(假陽性數(shù)/金標(biāo)準(zhǔn)真陰性數(shù)*100％＝9/132)為6.82％。表20：將ngs檢測結(jié)果大于等于千分之三的突變判定為陽性，根據(jù)檢測結(jié)果可以計算出假陽性率假陽性率(假陽性數(shù)/金標(biāo)準(zhǔn)真陰性數(shù)*100％＝29/132)為22％。比較表19和表20的數(shù)據(jù)可見，本申請的對熱啟動酶的緩沖液成份比例進(jìn)行調(diào)整后的試劑盒，可降低假陽性檢出率約15％左右。為了進(jìn)一步證明本申請的試劑盒的成分中可能的優(yōu)選范圍，發(fā)明人還進(jìn)一步采用如下表21和表22中的試劑盒成分對上述四個陰性對照品進(jìn)行了同樣的文庫構(gòu)建及檢測，檢測結(jié)果與表21類似，此處不再提供相應(yīng)數(shù)據(jù)。表21：表22：本申請的上述試劑盒中的引物及探針的具體序列均見下表23。表23：從以上的描述中，可以看出，本發(fā)明上述的實(shí)施例實(shí)現(xiàn)了如下技術(shù)效果：本申請的上述腸癌臨床用藥突變基因檢測試劑盒，通過對文庫構(gòu)建相關(guān)試劑中的熱啟動酶緩沖液進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化，并控制該熱啟動酶緩沖液體系包含850～950mmtris-hcl、3.5～5.5mmmgcl2、0.04u/ul高保真熱啟動酶以及0.5～0.7mm雙脫氧核糖核酸，使得各組分間的協(xié)同配合作用更加精準(zhǔn)，提高了高保真熱啟動酶hifi的保真性能，進(jìn)而提高了擴(kuò)增文庫的保真性，從而使得對突變基因檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，降低了假陽性檢出率，為臨床用藥提供相對更準(zhǔn)確的指導(dǎo)意義。以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>臻悅生物科技江蘇有限公司<120>腸癌臨床用藥突變基因檢測試劑盒<130>pn73756zhkej<160>102<170>patentinversion3.5<210>1<211>58<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭1-48第一鏈<400>1aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct58<210>2<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭1-48第一鏈<400>2gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacaacgtgatatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>3<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭2第二鏈<400>3gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacaaacatcgatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<210>4<211>65<212>dna<213>artificialsequence<220><223>接頭3第二鏈<400>4gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacatgcctaaatctcgtatgccgtcttct60gcttg65<2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