一種高效擴增冷凍保存nk細胞的方法及其應用
【專利摘要】本發(fā)明屬于細胞工程領域，具體涉及一種高效擴增冷凍保存NK細胞的方法及其應用。所述方法通過將融合基因通過質粒進行基因重組至AAVS1轉座子，并在細胞擴增中間階段引入冷凍/融化步驟至修飾K562細胞系為基礎的NK細胞擴增步驟；最后進行NK細胞的擴增和保存。通過使用位點特異性基因的整合技術開發(fā)的K562?mbIL15?41BBL?mbIL21細胞系，通過具有高的NK細胞活性，純度和細胞毒性，實現(xiàn)高NK細胞擴增效率以提高NK擴增；具有極大的市場前景和經(jīng)濟價值。
【專利說明】
一種高效擴増冷凍保存NK細胞的方法及其應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明屬于細胞工程領域，具體涉及一種高效擴增冷凍保存NK細胞的方法及其應 用。
【背景技術】
[0002] 人自然殺傷(NK)細胞是由表達⑶56和缺乏⑶3(⑶-⑶56+)的天然免疫系統(tǒng)的淋巴 細胞組成的。NK細胞具有廣譜的殺傷腫瘤細胞的功能，能夠通過細胞毒性顆粒諸如穿孔素 和顆粒酶，并通過如死亡受體相互作用，F(xiàn)as-Fas配體結合和TNF相關的細胞凋亡誘導配體 結合等機制發(fā)揮抗腫瘤作用。NK細胞還可以通過膜受體FcRyIII(CD16)介導抗體依賴性細 胞毒性(ADCChNK細胞的靶向識別和激活通過抑制和激活NK細胞表面受體和表達在靶細胞 上的相關配體這個平衡來發(fā)揮作用，其允許對病原體入侵和惡變立即響應。這一獨特的靶 向識別NK細胞的機制不同于主要組織相容性復合體(MHC)限制性T細胞受體(TCR)的T細胞 依賴性機制。因此，使用同種異體NK細胞來治療癌癥可能不會引起移植物抗宿主病(GVHD)。
[0003] 在健康受試者中，NK細胞大約占外周血單個核細胞(PBMC)的5-20%。在過繼免疫 治療中，大劑量的NK細胞范圍從5\10~6-5\10~7/1^體重每劑量，最多4劑量?，F(xiàn)有技術中， 能夠從大量的外周血中富集擴增NK細胞的方法，多數(shù)是借助于使用侵入性白細胞分離和大 型磁分離裝置，這種方式十分昂貴，并對患者造成一定風險。另一種流行的NK細胞療法是使 用飼養(yǎng)細胞擴增NK細胞，如K562細胞修飾的膜結合分子，例如白介素（IL)-15和4-1BB配體 (K562-mbl5-41BBL)。這些飼養(yǎng)細胞可以迅速地從外周血單個核細胞擴增NK細胞，使NK細胞 在第7天平均擴增21.6倍，第21天擴增277倍。但是，由于衰老導致的端粒酶縮短，所以會限 制繼續(xù)擴增。
[0004] 獲得大劑量NK細胞通常需要擴增數(shù)周，回輸?shù)腘K細胞必須是新鮮的，細胞培養(yǎng)和 多劑量細胞輸注之間的協(xié)調(diào)是具有極大的挑戰(zhàn)性的。因此，擴增后的NK細胞的凍存是很非 常有必要的。然而，傳統(tǒng)的NK細胞的凍存對細胞具有有害的影響，如降低NK細胞活力，細胞 毒性以及對功能至關重要的NK細胞受體的表達。通常NK細胞無法從凍存解凍后立即裂解癌 細胞，復蘇的NK細胞需要用IL-2刺激過夜以恢復凍存的NK細胞的細胞毒性（Denman， Senyukov et al.，2012;Lapteva N et al.，2012)。因此，現(xiàn)有技術中，細胞存活性仍然是 一個問題，并且復蘇后的NK細胞存活不能持續(xù)超過一周。同時，復蘇的NK細胞能否進一步擴 增仍然不明。因此，本領域目前非常需要一種新的保持NK細胞活性和原有功能并且具有很 好的擴增性的凍存方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為此，本發(fā)明所要解決的技術問題在于，從而提出一種保持NK細胞活性，功能和以 及擴增性的凍存方法。
[0006] 為解決上述技術問題，本發(fā)明公開了一種高效擴增冷凍保存NK細胞的方法，所述 方法通過將融合基因通過質粒進行基因重組至AAVS1轉座子，并在細胞擴增中間階段引入 冷凍/融化步驟至修飾K562細胞系為基礎的NK細胞擴增步驟;最后進行NK細胞的擴增和保 存。
[0007] 優(yōu)選的，所述融合基因為人染色體19編碼mbIL15,4-lBBL和mbIL21。
[0008] 優(yōu)選的，所述融合基因的基因表達質粒骨架為將pFastBacl。
[0009] 優(yōu)選的，所述質粒骨架的啟動子為巨細胞病毒。
[0010]優(yōu)選的，所述質粒的重組使用鋅指核酸酶-介導的同源重組技術。
[0011]優(yōu)選的，所述基因重組的步驟具體為：
[0012] 將K562細胞進行懸浮處理；
[0013 ] 將pFas tBac-ZFN和PFB-融合基因宿主電轉至細胞；
[0014]將電穿孔的細胞隨后轉移到K562生長培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。
[0015] 培養(yǎng)后，進行擴增單細胞、克隆進行PCR基因分型、流式細胞術分析，制得穩(wěn)定表達 融合基因的細胞。
[0016] 優(yōu)選的，所述NK細胞的擴增具體步驟為：
[0017] 先取外周血單個核細胞，并進行密度梯度法分析處理；
[0018] 然后使用無血清干細胞生長培養(yǎng)基對所述NK細胞進行擴增，并用PBMC與γ照射 Κ562飼養(yǎng)細胞在ΝΚ細胞生長培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)；
[0019] 將擴增得到的ΝΚ細胞在含有SCGM培養(yǎng)基和10%FBS的冷凍培養(yǎng)基以及10%DMS0的 冷凍管中凍存；
[0020] 更為優(yōu)選的，將細胞置于凍存處理后再進行解凍和洗滌;最后將解凍的NK細胞再 次與K562飼養(yǎng)細胞以1:1的比例進行刺激培養(yǎng)。
[0021] 本發(fā)明還公開了所述的高效擴增冷凍保存NK細胞的方法在細胞保存領域中的應 用。
[0022] 本發(fā)明的上述技術方案相比現(xiàn)有技術具有以下優(yōu)點，通過使用位點特異性基因的 整合技術開發(fā)的K562-mbIL15-41BBL-mbIL21細胞系，通過具有高的NK細胞活性，純度和細 胞毒性，實現(xiàn)高NK細胞擴增效率以提高NK擴增。
【附圖說明】
[0023] 為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實施例并結合 附圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，其中
[0024]圖1是實施例中的位點特異性整合的融合基因至K562細胞的過程示意圖；
[0025] 圖2是實施例中的流式細胞儀分析mbIL15,4-lBBL和mbIL21在修飾的K 562細胞中 的蛋白表達水平；
[0026]圖3是實施例中NK細胞擴增倍數(shù)；
[0027] 圖4是實施例中使用K562mbill5-41BBL-mbil21后NK細胞的純度比較；
[0028]圖5是實施例中擴增后NK細胞激活受體，抑制受體以及NK細胞標記的表達情況。 [0029]圖6是實施例中擴增得到的NK細胞對K562人白血病細胞系的殺傷活性示意圖； [0030]圖7是實施例中在抗CD20人源抗體存在下NK細胞對抗Raji B-細胞淋巴細胞系的 ADCC作用示意圖；
[0031]圖8是實施例中EpCAM特異性CAR修飾的初始NK細胞對PCRC7結直腸癌細胞的殺傷 活性示意圖；
[0032] 圖9是實施例中EpCAM特異性CAR修飾的初始NK細胞對MCF7乳腺癌細胞的殺傷活 性。
【具體實施方式】
[0033] 實施例1本實施例公開了一種高效擴增冷凍保存NK細胞的方法，具體步驟如下：
[0034] 1、人源細胞系的培養(yǎng)
[0035]從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得野生型K562和Raji細胞系。并將這些細胞 放在在含10%胎牛血清(GIBC0)RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBC0)中，并于放入37°C，5%C〇2的培養(yǎng) 箱中進行培養(yǎng)。
[0036] 2、質粒的構建
[0037] 將口？&8七1^(31(111￥；[1：1'08611，0&1'18匕&(1，04)作為質粒骨架用于表達2?1^和編碼 mbill5,4-lBBL和mbIL21的融合基因，其中啟動子為巨細胞病毒(CMV)。其中，pFastBac-ZFN 的具體構建之前被報道過(Tay，Tan et al.2013)。
[0038] 對于pFB-融合基因宿主的構建，該編碼融合基因的DNA片段首次由AIT生物技術根 據(jù)現(xiàn)有技術中報道的序列基因合成，將合成的構建體克隆到pUC57(氨芐抗性），然后將該片 段通過PCR擴增。
[0039]另外，CMV啟動子，內(nèi)部核糖體進入位點（IRES)，新霉素抗性基因（新）和土撥鼠肝 炎病毒轉錄后調(diào)控元件(WPRE)也通過PCR擴增。所有這些片段使用GENEART無縫克隆和組裝 試劑盒(Invitrogen)克隆到一個pUC19的質粒。隨后將合并片段切除，使用Asc/Clal I克隆 到pFastBacl骨干，其中包含屬于AAVS1轉座子的一個810bp的左同源臂與一個837bp的右同 源臂（Tay，Tan et al.2013)的。
[0040] 3、位點特異性整合的融合基因至K562細胞AAVS1基因座
[0041 ] 將2X106個K562細胞系分別重新懸浮于100μΙ的Opti-MEM。使用NE PA 21電穿孔 和Bio-Rad公司試管將3yg每一個的pFastBac-ZFN和PFB-融合基因宿主電轉至細胞。將電穿 孔的細胞隨后轉移到在6孔板中新鮮的K562生長培養(yǎng)基。電穿孔后第5天，在200yg/mL濃度 下進行為期1個月的G418選擇。培養(yǎng)基每2天更換。1個月的選擇后，使用細胞分選儀，BD FA CSAria(BD Biosciences公司）將單細胞分選到的96孔板。擴增單細胞和克隆進行PCR基因 分型和流式細胞術分析，以證實該位點特異性整合的融合基因的表達和穩(wěn)定表達。PCR基因 分選以鑒定細胞克隆與AAVS1位點的整合。細胞的基因組DNA，用廁ea s y?血液及組織試劑 盒(Qiagen，希爾登，德國）分離出來。PCR基因分型被用于檢測0KSM盒的位點特異性整合。 ΚΑΡΑ高保真熱啟動預拌（ΚΑΡΑ Biosystem，Woburn，MA)被一起使用，正向引物： ATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGG和反向引物：CGGGGATGCAGGGGAACGGGGCTCAGTCTG。擴增 產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠上進行分析。
[0042] 4、NK細胞的擴增和凍存
[0043] 取20名健康捐助者外周血單個核細胞，并使用Ficoll-Paque PREMIUM(GE醫(yī)療集 團生命科學），從外周血單個核細胞的新鮮棕黃層進行密度梯度法分析處理。使用補充有 10%FBS(GIBC0)和 10 或 50IU/ml 的 11^-2(?6口1〇了6吐，1?〇。1^.出11，町，1]5厶）的6103的無血清干 細胞生長培養(yǎng)基（SCGM)(CellGro/CellGenix)對NK細胞進行擴增，并用PBMC與γ照射K562 飼養(yǎng)細胞(數(shù)量比1: 2)在NK細胞生長培養(yǎng)基中共培養(yǎng)。在T75培養(yǎng)瓶中2 X 106個TOMC與4 X 106的K562飼養(yǎng)細胞在10ml的NK培養(yǎng)基中共培養(yǎng)。每2-3天半量換液并補加100IU/ml IL-2。 [0044] NK細胞擴增7天后，擴增得到的NK細胞以2X107細胞/mL在含有SCGM培養(yǎng)基+10% FBS的冷凍培養(yǎng)基+10%DMS0(Invitrogen)中在冷凍管(NUNC)中凍存。將細胞置于冷凍1°C 的冷凍容器(Thermo Fisher Scientific，Rochester，NY)在-80°C冰箱中凍存24小時，然后 轉移并儲存在液氮蒸氣儲罐。冷凍的NK細胞在37°C水浴中解凍直至剩下少量冷凍物質，然 后在NK細胞生長培養(yǎng)基洗滌。解凍NK細胞每7天再次與K562飼養(yǎng)細胞以1:1的比例刺激。凍 存NK細胞可至少擴增3個月。
[0045] 5、流式細胞儀分析
[0046] 所用流式細胞儀為BD Accuri C6流式細胞儀(BD Biosciences，F(xiàn)ranklin Lakes, NJ)〇
[0047] 所使用的APC標記的抗體購自美天旎(德國Bergisch Gladbach)，BD Biosciences 公司，或Beckman Coulter(Brea，CA) 〇
[0048] 6、細胞毒性分析
[0049] 所述DEL.FU?細胞的細胞毒性試劑盒(Perkin Elmer)用來測試對野生型K562和 Raj i細胞的細胞毒性。
[0050] NK細胞與靶細胞在1:1，1:5和1:10比例下在37°C，5%⑶2的培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)2小 時。
[0051 ] 7、實驗結果
[0052]位點特異性整合的融合基因至K562飼養(yǎng)細胞
[0053] 利用已建立的鋅指核酸酶(BV_ZFN)(Tay，Tan et al.2013)，兩個質粒構建技術： 一個編碼ZFN，靶向和裂解AAVS1轉座子(pFastBac-ZFN)和其他用過含有CMV啟動子以驅動 融合基因編碼的表達的宿主mbill5,4-lBBL，和mbil21以及新霉素基因。具體見圖）。圖中， 位點特異性整合的融合基因至K562細胞。pFastBac-融合基因宿主的構建，AAVS1至 PPP1R12C基因，剪切位點BV-ZFN，以及修飾的AAVS1在同源重組后。E1，E2和E3:前三個 PPP1R12C基因的外顯子。箭頭表示PCR前頭和反向啟動子(FP和RP)結合形成的一個2.4kb片 段的3'修飾的AAVS1
[0054] 此表達盒是由一個810-bp的左同源臂側翼和一個837-bp的右同源臂關于所述 AAVS1轉座子(pFastBac-mbIL21-宿主）（圖1)。1(562細胞通過電穿孔將兩種質粒實現(xiàn)位點特 異性整合。電穿孔后，將K562細胞進行G418選擇，5天后，進行單細胞分選。從G418耐性單細 胞克隆的基因組提取DNA，并通過使用特異于19號染色體的新霉素存在于所述的pFastBac- mbIL21-宿主基因（右同源臂的3'末端的下游）引物對進行PCR基因分型。2.5-kb的片段的擴 增表明通過ZFN介導的同源重組成功AAVS1修飾。以證明成功的修改將導致融合基因在克隆 的穩(wěn)定的蛋白質表達，所述克隆進行流式細胞儀分析。一個克隆顯示出蛋白質的高水平表 達被選定為NK細胞擴增的飼養(yǎng)細胞。具體見圖2。
[0055]凍存后NK細胞的擴增
[0056]已經(jīng)知道NK細胞的凍存對細胞有害，如細胞活力，細胞毒性的下降，NK細胞受體表 達的減少。為了克服這個問題，我們開發(fā)了一種方案，將新鮮分離的NK細胞與我們獲得的 K562細胞以1:2的比例培養(yǎng)短短7天，然后凍存擴增得到的細胞，然后在復蘇后以1:1的比例 與K562細胞共培養(yǎng)。隨后每隔7天將NK細胞用K562飼養(yǎng)細胞再刺激，NK細胞的擴增長達3個 月。我們發(fā)現(xiàn)，這種方法可克服冷凍保存所引起細胞活力下降的問題。如圖3所示，冷凍保存 的NK細胞能夠在復蘇后增殖至少35天。圖中顯示，NK細胞的平均總擴增倍數(shù)為78，880，152， 范圍在280,354到226,456,888倍。每一行代表一個?8如患者(11 = 3)。疆細胞用1(5621111^115- 41BBL-mbil21飼養(yǎng)層細胞擴增PBMC:K 562比例為1:2前7天，凍存于-80°C后。凍存的NK細胞 一周后復蘇，用K 562刺激后再次擴增。
[0057] 為確定NK細胞增殖的最佳培養(yǎng)條件，分別評價PBMC至K562-mbIL15-41BBL-mbIL21 比率，1:2，1:1.5和1:1的差異。觀察到，在配給初始PBMC刺激的降低可能導致NK細胞擴增倍 數(shù)的降低，PBMC: K562為1:2的比例產(chǎn)生最高NK細胞擴增倍數(shù)。比例的增加也將保持較高的 NK細胞純度，與PBMC:K562為1:2可以在培養(yǎng)的21天（圖4)后達到94.9±2.8%的最高純度。 [0058] 實驗例
[0059] 1、擴增的NK細胞的表型檢測實驗
[0060]對擴增得到的NK細胞粘附分子和受體的一個廣泛的陣列進行測試。大部分高表達 受體和粘附分子，有少數(shù)例外-活化受體，NKp44，和抑制性受體，表面CD158a，h，CD158i和 CD158el/e2(圖5)。
[0061 ]同時還比較了培養(yǎng)7天的NK細胞復蘇后粘附分子的表達以及在用K562-mbIL15- 41BBL-mbIL21重新刺激1周后黏附分子和受體的表達情況。抑制性受體，表面⑶158a，h和 ⑶158el/e2的以及活化受體，NKG2D和NKp44的表面表達出現(xiàn)顯著增加。結果顯示表面標記 ⑶16的表達會因 NK細胞(Sakamoto，Ishikawa et al. 2015)的冷凍保存而下調(diào)。與這些結果 相一致的是，在凍存和復蘇后NK細胞的表面標記⑶16的表達出現(xiàn)顯著的下降（高達86% )。 不過，這個問題在使用K562-mbIL15-41BBL-mbIL21再刺激1周后得到改善。CD16表面表達顯 示增加至平均90.6 ± 1.8 %。
[0062] 2、擴增的NK細胞對癌細胞殺傷性測試
[0063] 擴增的NK細胞能夠直接殺死NK敏感的白血病細胞K562，平均16.1 % (范圍從0.9% 至31.2%)，69.8% (范圍從58.5%至98.9%)和86.3% (從74.9%到98.7%)，以1效靶比例 分別為1:1，5:1和10:1 (圖6)。其中NK細胞與K562細胞以1:1，5:1和10:1的比例共培養(yǎng)2個小 時。每一行代表一個PBMC健康志愿者(η = 6)但是，Raj i淋巴瘤細胞對NK細胞較不敏感。通過 利用這些NK細胞的ADCC功能，在抗體CD20-hIgGl (圖7)的存在下可以明顯觀察到對Raji細 胞的細胞毒性。因此，擴增得到的NK細胞的ADCC功能可以顯著擴大對惡性細胞的殺傷譜。
[0064]將免疫細胞嵌合抗原受體(CAR)可以提高他們對癌細胞的殺傷活性。冷凍保存后 進一步增加擴增的NK細胞的癌細胞殺傷效率，通過測試抗EpCAM CAR-重定向NK細胞是否顯 示抗EpCAM的陽性結腸直腸癌和乳腺癌細胞的細胞毒性。電穿孔編碼抗EpCAM的mRNA后，將 修飾的NK細胞與pCRC7人大腸癌細胞（圖8)和MCF-7乳腺癌細胞（圖9)共培養(yǎng)。圖8、9中EpCAM 為特異性CAR修飾的初始NK細胞;CAR為對照修飾的初始NK細胞;wt為初始的NK細胞。
[0065] 得到如下結果:抗EpCAM CARNK細胞顯示強的細胞毒性活性，并能在E:T比值10:1 時100%的殺死腫瘤細胞，這較未修飾的初始NK細胞和mGFP CAR修飾的對照NK細胞具有更 有效的殺傷活性。
[0066] 綜上所述，可以看出過繼性NK細胞療法是一種有效的癌癥治療方法，顯示了高的 抗腫瘤潛力，同時在臨床試驗中具有極低的移植物抗宿主病(GVHD)的風險。然而，獲得足夠 數(shù)量的NK細胞用于過繼移植的難度是NK細胞療法的一個限制。NK細胞的體外擴增通常與復 雜的方案和昂貴的成本相關聯(lián)。通過使用位點特異性基因的整合技術開發(fā)的K562-mbIL15- 41BBL-mbIL21細胞系，通過具有高的NK細胞活性，純度和細胞毒性實現(xiàn)高NK細胞擴增效率 以提高NK擴增方案。隨機整合編碼NK刺激分子染K562細胞的逆轉錄病毒載體的基因用來產(chǎn) 生經(jīng)遺傳修飾的K562細胞，這可能導致刺激分子的表達水平不同，因此這將是具有挑戰(zhàn)性 的復制的細胞系可能表達轉基因的相同的表達水平。通過克服了由位點特異性基因的整合 問題引入AAVS1轉座子。AAVS1位于蛋白磷酸酶1，調(diào)節(jié)(抑制劑)亞單位12C(PPP1R12C)基因 對人19號染色體（19ql3.3-qter)之內(nèi)。這個位點用作特異性整合基因座AAV血清型2(AAV2) 的非致病性人細小病毒。AAVS1具有轉錄能力包括一個敞開的染色質結構和包含天然絕緣 體，使對轉基因沉默的基因整合阻力。由于存在來自PPP1R12C基因和插入位點的轉基因盒 的轉錄能力的破壞所造成的細胞上沒有已知的不利影響保持在不同類型的細胞，AAVS1被 認為是一個"安全港"為加法轉基因的成人類基因組。
[0067]擴增的NK細胞被冷凍保存后具有更好的效率，并在后續(xù)的擴增過程中具有改善的 NK細胞功能。
[0068]目前，由于冷凍對⑶16表達的影響，立即復蘇的NK細胞不能用于ADCC抗腫瘤治療。 這種療法將通過用K562-mbIL15-41BBL-mbI121重新刺激變得可行。目前NK細胞療法治療白 血病較實體瘤更成功。這是由于該顯示抑制信號以NK細胞的殺傷作用的固體腫瘤微環(huán)境因 素的影響。因此，CAR的基因修飾的NK細胞具有靶向實體瘤有抗藥性的NK細胞，開辟了更廣 泛的NK細胞治療各種癌癥類型的可能性。因此，復蘇凍存的NK細胞后，抗EpCAM CAR-重定向 NK細胞能有效殺滅EpCAM陽性結腸直腸癌和乳腺癌細胞。
[0069]顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對 于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或 變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或 變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。
【主權項】
1. 一種高效擴增冷凍保存NK細胞的方法，其特征在于，所述方法通過將融合基因通過 質粒進行基因重組至AAVS1轉座子，并在細胞擴增中間階段引入冷凍/融化步驟至修飾K562 細胞系為基礎的NK細胞擴增步驟;最后進行NK細胞的擴增和保存。2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述融合基因為人染色體19編碼mbIL15,4-lBBUPmbIL21。3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述融合基因的基因表達質粒骨架為將 pFastBacl〇4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述質粒骨架的啟動子為巨細胞病毒。5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述質粒的重組使用鋅指核酸酶-介導的同 源重組技術。6. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述基因重組的步驟具體為： 將K562細胞進行懸浮處理； 將pFastBac-ZFN和PFB-融合基因宿主電轉至細胞； 將電穿孔的細胞隨后轉移到K562生長培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。 培養(yǎng)后，進行擴增單細胞、克隆進行PCR基因分型、流式細胞術分析，制得穩(wěn)定表達融合 基因的細胞。7. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述NK細胞的擴增具體步驟為： 先取外周血單個核細胞，并進行密度梯度法分析處理； 然后使用無血清干細胞生長培養(yǎng)基對所述NK細胞進行擴增，并用PBMC與γ照射K562飼 養(yǎng)細胞在ΝΚ細胞生長培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)； 將擴增得到的ΝΚ細胞在含有SCGM培養(yǎng)基和10%FBS的冷凍培養(yǎng)基以及10%DMS0的冷凍 管中凍存； 將細胞置于凍存處理后再進行解凍和洗滌;最后將解凍的NK細胞再次與K562飼養(yǎng)細胞 以1:1的比例進行刺激培養(yǎng)。8. 如權利要求1-7任一項所述的高效擴增冷凍保存NK細胞的方法在細胞保存領域中的 應用。
【文檔編號】C12N5/0783GK105838677SQ201610340117
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】卓朗, 王暉, 王柯
【申請人】深圳市科暉瑞生物醫(yī)藥有限公司