本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)領(lǐng)域，具體為膠原基復(fù)配非離子型多糖構(gòu)建復(fù)合水凝膠的制備方法。
背景技術(shù)：
膠原蛋白(Collagen)廣泛地存在于動(dòng)物骨、腱、軟骨和皮膚及其他結(jié)締組織中，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，約占動(dòng)物體膠原纖維固體物的85％，占體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25％～30％。膠原蛋白具有低抗原性、可生物降解性、生物相容性、細(xì)胞適應(yīng)性和細(xì)胞增殖作用以及促進(jìn)血小板凝聚等優(yōu)異的生物學(xué)性能，目前作為生物醫(yī)學(xué)材料得到了廣泛的研究和應(yīng)用。
魔芋葡甘聚糖(konjacglucomannan，KGM)是魔芋塊莖中所含的儲(chǔ)備性多糖，是由葡萄糖和甘露糖主要以β-1,4糖甙鍵連接起來(lái)的中性非離子型高分子多糖，是繼淀粉和纖維素之后，一種具有應(yīng)用前景的豐富的可再生天然高分子資源。KGM具有特別的物理化學(xué)性質(zhì)，例如很高的黏度，良好吸水、保濕、成膜、增稠性和膠凝性；同時(shí)，KGM具有良好的生物降解性、生物相容性和一定的生物活性，具有抗腫瘤、抑制高血糖、高血脂、糖尿病、肥胖癥和抑制大腸癌變等作用。KGM的凝膠具有促進(jìn)傷口愈合、止血和緩釋藥物等功能。這些性質(zhì)與功能使KGM作為生物材料在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有非常廣泛的應(yīng)用前景。
純膠原作為生物材料存在的最大不足是其力學(xué)性能較差，需要使用交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)改性以提高其機(jī)械力學(xué)性能，或者與其他類別的大分子(合成類高分子或生物大分子)共混以得到力學(xué)性能改善的復(fù)合材料。
而基于各取所長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)原理，目前，KGM作為生物醫(yī)學(xué)材料的應(yīng)用也主要是與其他類別的生物大分子或合成高分子相復(fù)合而得到復(fù)合膜材料或復(fù)合水凝膠材料，或者再與仿生無(wú)機(jī)礦物成分例如羥基磷灰石相復(fù)合而得到含有包括KGM在內(nèi)的兩種有機(jī)大分子的有機(jī)-無(wú)機(jī)復(fù)合凝膠材料。
在兼顧改善材料力學(xué)性能的條件下，從優(yōu)良的生物相容性和生物降解性出發(fā)，更傾向于生物大分子之間的共混復(fù)合。因此，以蛋白質(zhì)類的膠原和多糖類的KGM為主要成分的二元或三元復(fù)合材料也得到廣泛研究。
KGM作為生物材料的主要應(yīng)用形式是制備膜類和凝膠類復(fù)合支架材料。與KGM等非離子型多糖復(fù)配制備復(fù)合支架材料的大分子分為天然生物大分子類和人工合成高分子類。天然生物大分子又分為蛋白質(zhì)類和多糖類。
KGM與蛋白類大分子的復(fù)合主要與膠原復(fù)合為主，復(fù)合形式主要為膜。這種以KGM和膠原為主要成分的復(fù)合膜制備方法中，主要是基于KGM在高溫(60～90℃)和高pH值條件下發(fā)生凝膠化反應(yīng)，最終得到的膜是結(jié)合有膠原分子的KGM凝膠膜[景森，陳慶華，潘興華，張峰，董會(huì).膠原蛋白/葡甘聚糖共混膜的制備及性能表征.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2008,12(10):1885-1888；王碧,王坤余,但衛(wèi)華,張廷有,葉勇.葡甘聚糖-膠原蛋白-殼聚糖共混膜.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志,2006,23(1)∶102～106]。這類方法中的長(zhǎng)時(shí)間高熱高堿條件會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白分子的變性，從而會(huì)使膠原分子失去本身的生物活性。這是該類方法對(duì)于保持蛋白類生物大分子的生物活性方面所存在的關(guān)鍵性不足。
也有KGM與大豆蛋白相復(fù)配成膜或成凝膠的，但所用的大豆蛋白是已經(jīng)發(fā)生了變性的。該復(fù)合凝膠的形成機(jī)理是KGM分子與變性大豆蛋白的伸展分子鏈間形成的氫鍵增強(qiáng)產(chǎn)生的協(xié)同增效作用[丁金龍,孫遠(yuǎn)明，樂(lè)學(xué)義.魔芋膠與大豆分離蛋白相互作用研究,中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2003,18(3):65-69]。有以KGM、大豆分離蛋白(SPI)和膠原蛋白為主要原料，配以甘油、單甘脂等其他物質(zhì)研制成復(fù)合眼貼膜，雖然該膜制備過(guò)程所用的pH值屬弱堿范圍，但仍然是在高溫(75℃和45℃)條件下完成各成分的復(fù)合和膜的干燥的[潘廷跳，張俊明，潘振華，蘇晨帆，龐杰.復(fù)含眼貼膜的研制.日用化學(xué)品科學(xué),2012,35(3):31-35]。這樣的溫度足以使膠原分子變性失活。
也有將KGM與其他多糖類大分子，如卡拉膠、黃原膠以及普魯蘭多糖(Pullulan,PULL)等共混以制備復(fù)合凝膠支架材料。但KGM與卡拉膠或黃原膠類別多糖的共混復(fù)合凝膠的生成原理是基于卡拉膠分子或黃原膠分子在高溫作用下(分別不低于74℃和42℃)從有序態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)規(guī)線團(tuán)態(tài)后與KGM分子鏈發(fā)生絞合而生成凝膠網(wǎng)絡(luò)骨架；而由于普魯蘭多糖是粘度低不具有凝膠性的多糖，其與KGM的復(fù)合凝膠的制備則需要依賴于90℃高溫的堿熱處理以實(shí)現(xiàn)KGM分子的熱不可逆凝膠化以形成KGM-PULL復(fù)合凝膠[何東保,彭學(xué)東,詹東風(fēng).卡拉膠與魔芋葡甘聚糖協(xié)同相互作用及其凝膠化的研究.高分子材料科學(xué)與工程，2001，17(2)：28-30；何東保,楊朝云，詹東風(fēng),黃原膠與魔芋膠協(xié)同相互作用及其凝膠化的研究.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，1998，44(2)：198-200；寇丹丹，蘭潤(rùn)，葉偉建,薛麗華，魏雪琴，龐杰.魔芋葡甘聚糖/普魯蘭多糖半互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠彈性及其微觀形貌研究.西南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版).2014,36(4):205-212]。以上方法中的高溫高堿的嚴(yán)苛條件顯然是不適于膠原等蛋白質(zhì)類的生物活性大分子的復(fù)合的。
在KGM與透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)的共混復(fù)合中，將二者的溶液混合攪拌均勻，然后通過(guò)冷凍干燥成型而得到多孔的海綿狀支架[Takayuki Kondo1,Tetsuya Shinozaki1,Hiroyuki Oku,Shoji Takigami and Kenji Takagishi.Konjacglucomannan-based hydrogel with hyaluronic acid as a candidate for a novel scaffold for chondrocyte culture.J Tissue EngRegenMed.2009,3:361–367]。該制備方法是將KGM和HA的混合溶膠直接進(jìn)行凍干賦形，兩種大分子均沒(méi)有發(fā)生實(shí)質(zhì)的凝膠化轉(zhuǎn)變而形成穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)骨架。
除了與天然生物大分子復(fù)配，KGM也與人工合成高分子相結(jié)合以制得力學(xué)性能更穩(wěn)定的雜混水凝膠。例如以KGM為原料，以N，N-二亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，以丙烯酸為單體，在引發(fā)劑過(guò)硫酸鉀或硝酸鈰銨存在下引發(fā)聚合反應(yīng)制備得到的KGM/N，N-二亞甲基雙丙烯酰胺水凝膠或KGM/聚丙烯酸水凝膠[王雅立,魔芋葡甘聚糖/N，N-二亞甲基雙丙烯酰胺水凝膠的溶脹行為研究.安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2015，21(14):26-46；陳立貴，王忠，付蕾，等.魔芋葡甘聚糖/聚丙烯酸水凝膠的溶脹動(dòng)力學(xué)及性能影響因素.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(29):9134-9135]。但這類復(fù)合水凝膠的主要不足之處在于，反應(yīng)過(guò)程中引入的化學(xué)合成交聯(lián)劑、引發(fā)劑以及人工聚合高分子導(dǎo)致了水凝膠的生物相容性遠(yuǎn)不及天然生物大分子材料；其生物可降解性也較大程度地降低或不易降解。
現(xiàn)有技術(shù)一的技術(shù)方案：分別配制2％殼聚糖溶液、1％魔芋葡甘聚糖水溶液，將兩種溶液與適宜濃度的膠原蛋白溶液按一定比例于45℃熱水浴中充分混合,減壓脫泡后倒入成膜模具中,真空干燥成膜。然后用適宜濃度的NaOH溶液處理，再用蒸餾水反復(fù)洗滌、晾干。[王碧,王坤余,但衛(wèi)華,張廷有,葉勇.葡甘聚糖-膠原蛋白-殼聚糖共混膜.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志,2006,23(1)∶102～106]
以魔芋葡甘聚糖，膠原蛋白為主要原料，以甘油為添加劑，加入1mL氨水調(diào)節(jié)pH值為10～12，在100mL蒸餾水中制得不同配比的混合液，攪拌45min、靜置15min左右，減壓脫泡后倒入成膜模具中，在60℃下干燥8～9h即可成膜。[景森，陳慶華，潘興華，張峰，董會(huì).膠原蛋白/葡甘聚糖共混膜的制備及性能表征.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2008,12(10):1885-1888]
分別配制相同濃度的KGM和SPI溶液，并且等體積混合，在75℃下迅速攪拌10min，待二者充分混合后分別加入膠原蛋白、甘油及單甘酯攪拌至均勻，并用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH至8左右，充分?jǐn)嚢瑁コ龤馀荩?5℃下干燥2h，揭膜即得復(fù)合眼貼膜基膜。[潘廷跳，張俊明，潘振華，蘇晨帆，龐杰.復(fù)含眼貼膜的研制.日用化學(xué)品科學(xué),2012,35(3):31-35]
以現(xiàn)有技術(shù)一為代表的涉及以KGM和膠原為主要復(fù)配成分的制備方法都是以制備共混膜材料為目的，即制備“膜”形態(tài)的復(fù)合材料。
由于KGM在高溫高堿條件下會(huì)發(fā)生熱不可逆凝膠化反應(yīng)，技術(shù)一在制備以KGM和膠原為主要成分的共混膜的過(guò)程中，通常會(huì)使用遠(yuǎn)高于生理溫度的高溫(最低有用45℃，一般在60℃以上)和高堿的條件以實(shí)現(xiàn)KGM的熱不可逆凝膠化，從而進(jìn)一步增強(qiáng)共混膜的力學(xué)性能。然而這樣的高溫高堿條件會(huì)使液態(tài)環(huán)境中的膠原分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致膠原大部分或全部變性而失去本身的生物活性。
膠原分子的生物活性即生物學(xué)功能表現(xiàn)在：能誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化和遷移；能于體外再次重組形成與天然膠原纖維相似的有序纖維結(jié)構(gòu)；誘導(dǎo)纖維粘連素、氨基多糖和生長(zhǎng)因子；有好的凝血性能；低免疫原性等等。膠原分子的這些生物活性與其分子的三螺旋結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。因此，作為生物醫(yī)學(xué)材料，保持膠原分子本身的三螺旋結(jié)構(gòu)不被破壞以保留其具有的生物活性是實(shí)際應(yīng)用中人們所期望達(dá)到的要求，是至關(guān)重要的。
現(xiàn)有技術(shù)二，步驟一，共滴定法制備納米羥基磷灰石(HAP)/膠原復(fù)合粉體：
把一定量的磷酸溶液和膠原蛋白一起加入到盛有蒸餾水的燒杯中并置于磁力攪拌器上攪拌均勻，同時(shí)按羥基磷灰石的化學(xué)計(jì)量比稱取Ca(OH)2粉末加入到盛有蒸餾水的燒杯中磁力攪勻至上清液。把飽和Ca(OH)2溶液與膠原蛋白磷酸溶液同時(shí)滴入另一磁力攪拌的燒杯中，通過(guò)控制滴速來(lái)調(diào)節(jié)pH值及反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)溫度為室溫(25℃左右)。飽和Ca(OH)2溶液滴完后加入氨水調(diào)節(jié)pH值為10.0，反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)攪拌12h，此時(shí)pH值降為7.0左右。然后放入冷藏箱中陳化10天左右，用抽濾機(jī)抽除大部分水后置入冷藏冷凍柜中進(jìn)行冷凍，然后再置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥，最后將制得的粉末經(jīng)過(guò)400目篩過(guò)篩。
步驟二，溶膠凝膠法及冷凍干燥法制備納米HAP/膠原/KGM多孔骨支架：
量取少量的氨水滴入蒸餾水中，按一定比例加入納米羥基磷灰石/膠原納米粉和KGM粉并快速攪拌，形成粘稠狀凍膠，靜置一段時(shí)間后置于70℃水浴中膠凝24h。取出凝膠塊置入盛有蒸餾水的燒杯中，再置于70℃水浴鍋中進(jìn)行脫堿，直到pH值為7.0后脫堿完成。將試樣放入30℃水浴中恒溫1h后置入一定溫度的低溫冷凍箱中深冷凍24h，取出凍膠置入真空冷凍干燥機(jī)中干燥，制得復(fù)合多孔骨支架。[黃明華，陳寰貝，陳慶華，陶世剛，諶強(qiáng)國(guó)，顏廷亭.納米羥基磷灰石/膠原/魔芋葡甘聚糖多孔骨支架研究.人工晶體學(xué)報(bào).2015,44(7):1961-1967]
該方法先利用共滴定法在膠原蛋白存在下合成羥基磷灰石，經(jīng)過(guò)凍干后得到納米羥基磷灰石/膠原復(fù)合粉體，再將該復(fù)合粉體和KGM在堿性條件下混合均勻后再于70℃高溫下處理以得到KGM的凝膠體。與技術(shù)一相似，該制備過(guò)程仍然需要高溫堿性條件以實(shí)現(xiàn)KGM的凝膠固化，因而難以保持其中的重要成分膠原分子的生物活性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種膠原基復(fù)配非離子型多糖構(gòu)建復(fù)合水凝膠的制備方法，突破目前膠原與KGM的復(fù)配方式只局限于膜材料的現(xiàn)狀，實(shí)現(xiàn)以膠原和KGM為主要成分的蛋白-多糖醫(yī)用復(fù)合水凝膠材料的制備；在膠原與KGM的復(fù)配以及由此所得復(fù)合體系的凝膠固化過(guò)程中，實(shí)現(xiàn)膠原分子的生物活性得以很好保持，結(jié)構(gòu)不被破壞而變性。特別在以KGM為代表的非離子型多糖大分子對(duì)膠原基復(fù)合水凝膠力學(xué)性能的改善提高的基礎(chǔ)上，結(jié)合天然生物交聯(lián)劑的交聯(lián)作用，實(shí)現(xiàn)膠原基復(fù)合水凝膠力學(xué)性能的增強(qiáng)。
膠原基復(fù)配非離子型多糖構(gòu)建復(fù)合水凝膠的制備方法，包括以下過(guò)程：
以4℃的pH2～5的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為2～20mg/mL；
以4～100℃的去離子水配制質(zhì)量百分比為0.1～10％的非離子型多糖溶液；
將非離子型多糖溶液溫度保持在4～25℃，在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入非離子型多糖溶液，攪拌反應(yīng)10～120min；
反應(yīng)結(jié)束后，保持在4℃，將反應(yīng)所得混合液低速離心、濃縮；
濃縮結(jié)束后，保持在4℃，對(duì)濃縮物調(diào)節(jié)pH值至7～11；
將濃縮物于15～37℃恒溫保持0.5～10h，制得膠原-非離子型多糖復(fù)合水凝膠；
將膠原-非離子型多糖復(fù)合水凝膠置于去離子水中浸洗2～8次，除去其中殘留的鹽分；
將清洗后的膠原-非離子型多糖復(fù)合水凝膠置于濃度為1～20mg/ml的生物交聯(lián)劑溶液中，于15～37℃下恒溫振搖1～72h，然后于去離子水中反復(fù)浸洗，除去未反應(yīng)的生物交聯(lián)劑。
或者，膠原基復(fù)配非離子型多糖構(gòu)建復(fù)合水凝膠的制備方法，包括以下過(guò)程：
以4℃的pH2～5的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為2～20mg/ml；
以4～100℃的去離子水配制質(zhì)量百分比為0.1～10％的非離子型多糖溶液，將多糖溶液的pH值調(diào)節(jié)到7～11；
將非離子型多糖溶液溫度保持在4～25℃，在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入多糖溶液，攪拌反應(yīng)10～120min，調(diào)節(jié)混合體系的pH值到6～10；
反應(yīng)結(jié)束后，保持在4℃，將反應(yīng)所得混合液低速離心、濃縮；
濃縮結(jié)束后，將濃縮物于15～37℃恒溫0.5～10h，制得膠原-非離子型多糖復(fù)合水凝膠；
將膠原-非離子型多糖復(fù)合水凝膠置于去離子水中浸洗2～8次以除去其中殘留的鹽分；
將膠原-非離子型多糖復(fù)合水凝膠置于濃度為1～20mg/ml的生物交聯(lián)劑溶液中，于15～37℃下恒溫振搖1～72h，然后于去離子水中反復(fù)浸洗，除去未反應(yīng)的生物交聯(lián)劑。
所述的非離子型多糖為魔芋葡甘聚糖(KGM)、淀粉、普魯蘭多糖、刺槐豆膠中的至少一種。
所述的生物交聯(lián)劑為原花青素或京尼平。
本發(fā)明提供的膠原基復(fù)配非離子型多糖構(gòu)建復(fù)合水凝膠的制備方法，保持了較為完整的天然三螺旋結(jié)構(gòu)的膠原分子具有生物活性，而具有生物活性的膠原分子在接近生理?xiàng)l件(溫度，pH)的溫和環(huán)境下，能夠自發(fā)地重現(xiàn)機(jī)體內(nèi)膠原分子的1/4錯(cuò)位排列聚集組裝行為，生成由膠原分子自組裝而成的納米纖維三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，即形成膠原水凝膠。本發(fā)明依據(jù)膠原分子的這一天然屬性，在溫和條件下進(jìn)行膠原與非離子型多糖的共混復(fù)合后，通過(guò)膠原分子自組裝生成膠原水凝膠網(wǎng)絡(luò)骨架來(lái)實(shí)現(xiàn)膠原-非離子型多糖共混體系的固化，從而制備得到膠原-非離子型多糖復(fù)合水凝膠。因此，本發(fā)明的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)了以下有益效果：
(1)在溫和條件下，實(shí)現(xiàn)了以膠原和KGM等非離子型多糖為主要成分的膠原-非離子型多糖復(fù)合水凝膠的制備。拓展了膠原-非離子型多糖復(fù)合體系只局限于膜材料的研究和應(yīng)用。
(2)由于膠原-非離子型多糖復(fù)合水凝膠的制備條件均為溫和條件，避免了高溫環(huán)境，復(fù)合水凝膠中的膠原分子的生物活性得到很好保護(hù)，保持了膠原-非離子型多糖復(fù)合水凝膠作為生物醫(yī)學(xué)材料的優(yōu)勢(shì)。
(3)由于KGM等非離子型多糖分子與膠原分子有良好的相容性，并且非離子型多糖的平均分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于膠原分子量，在膠原分子自組裝成纖維網(wǎng)絡(luò)的過(guò)程中，穿插纏繞于膠原分子之間的屈曲態(tài)的非離子型多糖分子也會(huì)被結(jié)合在所生成的膠原纖維中，進(jìn)而絞結(jié)在三維的纖維網(wǎng)絡(luò)之中，形成有效的物理交聯(lián)效應(yīng)，因而相對(duì)于純膠原水凝膠較差的力學(xué)性能，非離子型多糖與膠原相復(fù)配就有效地提高了復(fù)合水凝膠的機(jī)械力學(xué)性能。
(4)在以KGM為代表的非離子型多糖大分子對(duì)膠原基全天然復(fù)合水凝膠力學(xué)性能改善提高的基礎(chǔ)上，結(jié)合天然生物交聯(lián)劑的交聯(lián)作用，進(jìn)一步增強(qiáng)膠原基全天然復(fù)合水凝膠的力學(xué)性能。
具體實(shí)施方式
結(jié)合實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方式。
實(shí)施例1
膠原基復(fù)配非離子型多糖構(gòu)建復(fù)合水凝膠的制備方法，包括以下過(guò)程：
以pH3的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為6mg/mL。以溫度為10℃的去離子水配制質(zhì)量百分比為0.6％的KGM溶液。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入KGM溶液，攪拌反應(yīng)20min，將反應(yīng)所得混合液低速離心后進(jìn)行濃縮。濃縮結(jié)束后，對(duì)濃縮物調(diào)節(jié)pH值至11。以上操作溫度均保持在4℃。之后將濃縮物于37℃恒溫4h制得膠原-KGM復(fù)合水凝膠。將膠原-KGM復(fù)合水凝膠置于去離子水中浸洗6次以除去其中殘留的鹽分。將清洗后的膠原-KGM復(fù)合水凝膠置于濃度為5mg/ml的原花青素溶液中，于37℃下恒溫振搖48h，然后于去離子水中反復(fù)浸洗以除去未反應(yīng)的原花青素小分子。
實(shí)施例2
膠原基復(fù)配非離子型多糖構(gòu)建復(fù)合水凝膠的制備方法，包括以下過(guò)程：
以pH5的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為3mg/mL。以溫度為4℃的去離子水配制質(zhì)量百分比為0.8％的KGM溶液。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入KGM溶液，攪拌反應(yīng)40min，將反應(yīng)所得混合液低速離心后進(jìn)行濃縮。濃縮結(jié)束后，對(duì)濃縮物調(diào)節(jié)pH值至10。以上操作溫度均保持在4℃。之后將濃縮物于32℃恒溫2h制得膠原-KGM復(fù)合水凝膠。將膠原-KGM復(fù)合水凝膠置于去離子水中浸洗4次以除去其中殘留的鹽分。將清洗后的膠原-KGM復(fù)合水凝膠置于濃度為1mg/ml的京尼平溶液中，于25℃下恒溫振搖72h，然后于去離子水中反復(fù)浸洗以除去未反應(yīng)的京尼平分子。
實(shí)施例3
膠原基復(fù)配非離子型多糖構(gòu)建復(fù)合水凝膠的制備方法，包括以下過(guò)程：
以pH2.5的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為5mg/mL。以溫度為4℃的去離子水配制質(zhì)量百分比為1％的KGM溶液，將KGM溶液的pH值調(diào)節(jié)到11。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入KGM溶液，攪拌反應(yīng)120min，調(diào)節(jié)混合體系的pH值到7.5。將反應(yīng)所得混合液低速離心后進(jìn)行濃縮。以上操作溫度均保持在4℃。濃縮結(jié)束后，將濃縮物于15℃恒溫10h制得膠原-KGM復(fù)合水凝膠。將膠原-KGM復(fù)合水凝膠置于去離子水中浸洗3次以除去其中殘留的鹽分。將膠原-KGM復(fù)合水凝膠置于濃度為15mg/ml的原花青素溶液中，于30℃下恒溫振搖5h，然后于去離子水中反復(fù)浸洗以去除未反應(yīng)的原花青素小分子。
實(shí)施例4
膠原基復(fù)配非離子型多糖構(gòu)建復(fù)合水凝膠的制備方法，包括以下過(guò)程：
以pH5的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為2mg/mL。以溫度為15℃的去離子水配制質(zhì)量百分比為1.5％的KGM溶液，將KGM溶液的pH值調(diào)節(jié)到11。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入KGM溶液，攪拌反應(yīng)60min，調(diào)節(jié)混合體系的pH值到9。將反應(yīng)所得混合液低速離心后進(jìn)行濃縮。以上操作溫度均保持在4℃。濃縮結(jié)束后，將濃縮物于35℃恒溫0.5h制得膠原-KGM復(fù)合水凝膠。將膠原-KGM復(fù)合水凝膠置于去離子水中浸洗3次以除去其中殘留的鹽分。將膠原-KGM復(fù)合水凝膠置于濃度為20mg/ml的京尼平溶液中，于25℃下恒溫振搖1h，然后于去離子水中反復(fù)浸洗以去除未反應(yīng)的京尼平分子。
實(shí)施例5
膠原基復(fù)配非離子型多糖構(gòu)建復(fù)合水凝膠的制備方法，包括以下過(guò)程：
以pH4的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為18mg/mL。以溫度為90℃的去離子水配制質(zhì)量百分比為0.1％的淀粉溶液，待溶液溫度降至15℃，調(diào)節(jié)其pH值至9。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入淀粉溶液，攪拌反應(yīng)90min，調(diào)節(jié)混合體系的pH值到8。將反應(yīng)所得混合液低速離心后進(jìn)行濃縮。以上操作溫度均保持在4℃。濃縮結(jié)束后，將濃縮物于37℃恒溫2h制得膠原-淀粉復(fù)合水凝膠。將膠原-淀粉復(fù)合水凝膠置于去離子水中浸洗3次以除去其中殘留的鹽分。將膠原-KGM復(fù)合水凝膠置于濃度為8mg/ml的原花青素溶液中，于35℃下恒溫振搖12h，然后于去離子水中反復(fù)浸洗以去除未反應(yīng)的原花青素小分子。
實(shí)施例6
膠原基復(fù)配非離子型多糖構(gòu)建復(fù)合水凝膠的制備方法，包括以下過(guò)程：
以pH3的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為10mg/mL。以溫度為100℃的去離子水配制質(zhì)量百分比為8％的淀粉溶液，待溶液溫度降至20℃，調(diào)節(jié)其pH值至11。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入淀粉溶液，攪拌反應(yīng)120min，調(diào)節(jié)混合體系的pH值到7。將反應(yīng)所得混合液低速離心后進(jìn)行濃縮。以上操作溫度均保持在4℃。濃縮結(jié)束后，將濃縮物于30℃恒溫5h制得膠原-淀粉復(fù)合水凝膠。將膠原-淀粉復(fù)合水凝膠置于去離子水中浸洗2次以除去其中殘留的鹽分。將清洗后的膠原-淀粉復(fù)合水凝膠置于濃度為1mg/ml的京尼平溶液中，于25℃下恒溫振搖36h，然后于去離子水中反復(fù)浸洗以除去未反應(yīng)的京尼平分子。
實(shí)施例7
膠原基復(fù)配非離子型多糖構(gòu)建復(fù)合水凝膠的制備方法，包括以下過(guò)程：
以pH5的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為15mg/mL。以溫度為95℃的去離子水配制質(zhì)量百分比為2％的淀粉溶液，將溶液溫度降至10℃。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入淀粉溶液，攪拌反應(yīng)100min，將反應(yīng)所得混合液低速離心后進(jìn)行濃縮。濃縮結(jié)束后，對(duì)濃縮物調(diào)節(jié)pH值至9。以上操作溫度均保持在4℃。之后將濃縮物于18℃恒溫2h制得膠原-淀粉復(fù)合水凝膠。將膠原-淀粉復(fù)合水凝膠置于去離子水中浸洗5次以除去其中殘留的鹽分。將清洗后的膠原-淀粉復(fù)合水凝膠置于濃度為10mg/ml的原花青素溶液中，于20℃下恒溫振搖48h，然后于去離子水中反復(fù)浸洗以除去未反應(yīng)的原花青素分子。
實(shí)施例8
膠原基復(fù)配非離子型多糖構(gòu)建復(fù)合水凝膠的制備方法，包括以下過(guò)程：
以pH4的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為12mg/mL。以溫度為80℃的去離子水配制質(zhì)量百分比為5％的淀粉溶液。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入淀粉溶液，攪拌反應(yīng)120min，將反應(yīng)所得混合液低速離心后進(jìn)行濃縮。濃縮結(jié)束后，對(duì)濃縮物調(diào)節(jié)pH值至10。以上操作溫度均保持在4℃。之后將濃縮物于23℃恒溫3h制得膠原-淀粉復(fù)合水凝膠。將膠原-淀粉復(fù)合水凝膠置于去離子水中浸洗8次以除去其中殘留的鹽分。將清洗后的膠原-淀粉復(fù)合水凝膠置于濃度為15mg/ml的京尼平溶液中，于37℃下恒溫振搖1h，然后于去離子水中反復(fù)浸洗以除去未反應(yīng)的京尼平分子。
實(shí)施例9
膠原基復(fù)配非離子型多糖構(gòu)建復(fù)合水凝膠的制備方法，包括以下過(guò)程：
以pH2.5的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為20mg/mL。以溫度為10℃的去離子水配制質(zhì)量百分比為3％的普魯蘭多糖溶液，將溶液的pH值調(diào)節(jié)到9。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入普魯蘭多糖溶液，攪拌反應(yīng)40min，調(diào)節(jié)混合體系的pH值到7.5。將反應(yīng)所得混合液低速離心后進(jìn)行濃縮。以上操作溫度均保持在4℃。濃縮結(jié)束后，將濃縮物于37℃恒溫6h制得膠原-普魯蘭多糖復(fù)合水凝膠。將膠原-普魯蘭多糖復(fù)合水凝膠置于去離子水中浸洗3次以除去其中殘留的鹽分。再將膠原-普魯蘭多糖復(fù)合水凝膠置于濃度為20mg/ml的原花青素溶液中，于20℃下恒溫振搖30h，然后于去離子水中反復(fù)浸洗以去除未反應(yīng)的原花青素小分子。
實(shí)施例10
膠原基復(fù)配非離子型多糖構(gòu)建復(fù)合水凝膠的制備方法，包括以下過(guò)程：
以pH3的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為7mg/mL。以溫度為15℃的去離子水配制質(zhì)量百分比為10％的普魯蘭多糖溶液，將溶液的pH值調(diào)節(jié)到11。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入普魯蘭多糖溶液，攪拌反應(yīng)20min，調(diào)節(jié)混合體系的pH值到8。將反應(yīng)所得混合液低速離心后進(jìn)行濃縮。以上操作溫度均保持在4℃。濃縮結(jié)束后，將濃縮物于15℃恒溫5h制得膠原-普魯蘭多糖復(fù)合水凝膠。將膠原-普魯蘭多糖復(fù)合水凝膠置于去離子水中浸洗4次以除去其中殘留的鹽分。再將膠原-普魯蘭多糖復(fù)合水凝膠置于濃度為10mg/ml的京尼平溶液中，于28℃下恒溫振搖16h，然后于去離子水中反復(fù)浸洗以去除未反應(yīng)的京尼平分子。
實(shí)施例11
膠原基復(fù)配非離子型多糖構(gòu)建復(fù)合水凝膠的制備方法，包括以下過(guò)程：
以pH5的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為4mg/mL。以溫度為40℃的去離子水配制質(zhì)量百分比為7％的普魯蘭多糖溶液，將溶液溫度降至10℃。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入普魯蘭多糖溶液，攪拌反應(yīng)80min，將反應(yīng)所得混合液低速離心后進(jìn)行濃縮。濃縮結(jié)束后，對(duì)濃縮物調(diào)節(jié)pH值至9。以上操作溫度均保持在4℃。之后將濃縮物于32℃恒溫0.5h制得膠原-普魯蘭多糖復(fù)合水凝膠。將膠原-普魯蘭多糖復(fù)合水凝膠置于去離子水中浸洗6次以除去其中殘留的鹽分。將清洗后的膠原-普魯蘭多糖復(fù)合水凝膠置于濃度為5mg/ml的原花青素溶液中，于37℃下恒溫振搖8h，然后于去離子水中反復(fù)浸洗以除去未反應(yīng)的原花青素分子。
實(shí)施例12
膠原基復(fù)配非離子型多糖構(gòu)建復(fù)合水凝膠的制備方法，包括以下過(guò)程：
以pH4的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為12mg/mL。以溫度為30℃的去離子水配制質(zhì)量百分比為0.5％的普魯蘭多糖溶液，將溶液溫度降至4℃。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入普魯蘭多糖溶液，攪拌反應(yīng)100min，將反應(yīng)所得混合液低速離心后進(jìn)行濃縮。濃縮結(jié)束后，對(duì)濃縮物調(diào)節(jié)pH值至7。以上操作溫度均保持在4℃。之后將濃縮物于35℃恒溫3h制得膠原-普魯蘭多糖復(fù)合水凝膠。將膠原-普魯蘭多糖復(fù)合水凝膠置于去離子水中浸洗3次以除去其中殘留的鹽分。將清洗后的膠原-普魯蘭多糖復(fù)合水凝膠置于濃度為8mg/ml的京尼平溶液中，于30℃下恒溫振搖20h，然后于去離子水中反復(fù)浸洗以除去未反應(yīng)的京尼平分子。
實(shí)施例13
膠原基復(fù)配非離子型多糖構(gòu)建復(fù)合水凝膠的制備方法，包括以下過(guò)程：
以pH3的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為18mg/mL。以溫度為85℃的去離子水配制質(zhì)量百分比為0.1％的刺槐豆膠溶液，將溶液溫度降至4℃，將其pH值調(diào)節(jié)到9。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入刺槐豆膠溶液，攪拌反應(yīng)50min，調(diào)節(jié)混合體系的pH值到7.0。將反應(yīng)所得混合液低速離心后進(jìn)行濃縮。以上操作溫度均保持在4℃。濃縮結(jié)束后，將濃縮物于37℃恒溫2h制得膠原-刺槐豆膠復(fù)合水凝膠。將膠原-刺槐豆膠復(fù)合水凝膠置于去離子水中浸洗4次以除去其中殘留的鹽分。再將膠原-刺槐豆膠復(fù)合水凝膠置于濃度為10mg/ml的原花青素溶液中，于25℃下恒溫振搖12h，然后于去離子水中反復(fù)浸洗以去除未反應(yīng)的原花青素小分子。
實(shí)施例14
膠原基復(fù)配非離子型多糖構(gòu)建復(fù)合水凝膠的制備方法，包括以下過(guò)程：
以pH2.5的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為11mg/mL。以溫度為75℃的去離子水配制質(zhì)量百分比為1％的刺槐豆膠溶液，將溶液溫度降至15℃，將其pH值調(diào)節(jié)到10。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入刺槐豆膠溶液，攪拌反應(yīng)70min，調(diào)節(jié)混合體系的pH值到7.5。將反應(yīng)所得混合液低速離心后進(jìn)行濃縮。以上操作溫度均保持在4℃。濃縮結(jié)束后，將濃縮物于30℃恒溫5h制得膠原-刺槐豆膠復(fù)合水凝膠。將膠原-刺槐豆膠復(fù)合水凝膠置于去離子水中浸洗2次以除去其中殘留的鹽分。再將膠原-刺槐豆膠復(fù)合水凝膠置于濃度為5mg/ml的京尼平溶液中，于30℃下恒溫振搖40h，然后于去離子水中反復(fù)浸洗以去除未反應(yīng)的京尼平分子。
實(shí)施例15
膠原基復(fù)配非離子型多糖構(gòu)建復(fù)合水凝膠的制備方法，包括以下過(guò)程：
以pH5的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為7mg/mL。以溫度為80℃的去離子水配制質(zhì)量百分比為3％的刺槐豆膠溶液，將溶液溫度降至10℃。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入刺槐豆膠溶液，攪拌反應(yīng)90min，將反應(yīng)所得混合液低速離心后進(jìn)行濃縮。濃縮結(jié)束后，對(duì)濃縮物調(diào)節(jié)pH值至8。以上操作溫度均保持在4℃。之后將濃縮物于25℃恒溫5h制得膠原-刺槐豆膠復(fù)合水凝膠。將膠原-刺槐豆膠復(fù)合水凝膠置于去離子水中浸洗6次以除去其中殘留的鹽分。將清洗后的膠原-刺槐豆膠復(fù)合水凝膠置于濃度為1mg/ml的原花青素溶液中，于37℃下恒溫振搖60h，然后于去離子水中反復(fù)浸洗以除去未反應(yīng)的原花青素分子。
實(shí)施例16
膠原基復(fù)配非離子型多糖構(gòu)建復(fù)合水凝膠的制備方法，包括以下過(guò)程：
以pH4的醋酸配制膠原溶液，膠原濃度為3mg/mL。以溫度為95℃的去離子水配制質(zhì)量百分比為5％的刺槐豆膠溶液，將溶液溫度降至25℃。在攪拌條件下，向膠原溶液中緩緩加入刺槐豆膠溶液，攪拌反應(yīng)110min，將反應(yīng)所得混合液低速離心后進(jìn)行濃縮。濃縮結(jié)束后，對(duì)濃縮物調(diào)節(jié)pH值至6.5。以上操作溫度均保持在4℃。之后將濃縮物于35℃恒溫8h制得膠原-刺槐豆膠復(fù)合水凝膠。將膠原-刺槐豆膠復(fù)合水凝膠置于去離子水中浸洗8次以除去其中殘留的鹽分。將清洗后的膠原-刺槐豆膠復(fù)合水凝膠置于濃度為15mg/ml的京尼平溶液中，于18℃下恒溫振搖30h，然后于去離子水中反復(fù)浸洗以除去未反應(yīng)的京尼平分子。