本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基及骨向分化方法。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來源于中胚層的多能干細胞，具有高度自我更新能力和多向分化潛能。目前已在多種成熟組織中成功分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細胞，如骨髓、臍帶、肌肉組織、脂肪組織、臍血、牙髓等。

人胎盤來源的羊膜組織作為孕婦分娩后的廢棄物，來源廣、增殖快且不受倫理道德限制，是近幾年的研究熱點。羊膜是胎盤包裹胎兒面的一層半透明膜，其表面沒有神經(jīng)、血管、肌肉和淋巴等組織，可分離出羊膜上皮細胞和羊膜間充質(zhì)干細胞。早在50多年前，科學(xué)家和臨床醫(yī)生們就已經(jīng)認識到羊膜擁有一定的生物學(xué)作用。早期羊膜曾被用作覆蓋皮膚傷口的敷料，可以抗感染、減輕炎癥的發(fā)生，并且抑制細胞的免疫反應(yīng)，還可以刺激血管的生成。這些特點使它在多種疾病的輔助治療中得到了較為廣泛的應(yīng)用，例如治療燒傷，覆蓋手術(shù)傷口，更重要的是用于眼表重建術(shù)。其中人胎盤羊膜來源的間充質(zhì)干細胞(human amnion mesenchymal cells,hAMSCs)來自于原條期的胚外中胚層，具有在一定條件下向多個細胞系分化潛能，向內(nèi)胚層分化，如肝細胞、胰島樣細胞；向中胚層分化，如成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心肌細胞；向外胚層分化，如神經(jīng)細胞等。

hAMSCs不僅具有干細胞的特征，且具有不排斥性及免疫效果，是細胞移植和組織工程的理想種子細胞。這種材料來源豐富、細胞來源無爭議，在骨治療、臟器治療、心肌修復(fù)和神經(jīng)組織重新構(gòu)造中具有廣闊科研前景。

目前對于hAMSCs成骨分化誘導(dǎo)的研究主要集中于不同細胞因子對其生物學(xué)行為產(chǎn)生的不同影響，但是往往局限于單一細胞因子對其作用的研究，或是維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉三種因子聯(lián)合誘導(dǎo)的傳統(tǒng)間充質(zhì)干細胞成骨分化誘導(dǎo)方法。對于誘導(dǎo)能力更強的誘導(dǎo)因子及方法仍有需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基及骨向分化方法。該成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、胰島素樣生長因子-1、堿性成纖維生長因子等誘導(dǎo)因子，多種誘導(dǎo)因子聯(lián)合應(yīng)用作用于hAMSCs等間充質(zhì)干細胞，能有效的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞骨向分化，其成骨分化效果顯著優(yōu)于現(xiàn)有常規(guī)的誘導(dǎo)方法。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，包括維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、胰島素樣生長因子-1、堿性成纖維生長因子和基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

目前，現(xiàn)有的常規(guī)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括維生素C、地塞米松和β-甘油磷酸鈉，本發(fā)明提供的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基在常規(guī)誘導(dǎo)因子組合的基礎(chǔ)上，添加胰島素樣生長因子-1和堿性成纖維生長因子，多種誘導(dǎo)因子聯(lián)合應(yīng)用作用于hAMSCs等間充質(zhì)干細胞，更加高效的誘導(dǎo)hAMSCs等間充質(zhì)干細胞的骨向分化。

作為優(yōu)選，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中各組分的用量為：

維生素C：10～100μg/L；

地塞米松：(1～10)×10^-8mol/L；

β-甘油磷酸鈉：1～20mol/L；

胰島素樣生長因子-1：5～20μg/L；

堿性成纖維生長因子：5～20μg/L；

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：補足。

優(yōu)選地，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中各組分的用量為：

維生素C：50μg/L；

地塞米松：1×10^-8mol/L；

β-甘油磷酸鈉：10mol/L；

胰島素樣生長因子-1：5～20μg/L；

堿性成纖維生長因子：5～20μg/L；

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：補足。

更優(yōu)選地，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中各組分的用量為：

維生素C：50μg/L；

地塞米松：1×10^-8mol/L；

β-甘油磷酸鈉：10mol/L；

胰島素樣生長因子-1：15μg/L；

堿性成纖維生長因子：15μg/L；

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：補足。

在本發(fā)明提供的實施例中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含有10％體積分數(shù)FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基。

本發(fā)明還提供了一種誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞骨向分化的方法，采用本發(fā)明提供的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞。

在本發(fā)明提供的實施例中，間充質(zhì)干細胞為羊膜間充質(zhì)干細胞。

作為優(yōu)選，間充質(zhì)干細胞為第2～5代間充質(zhì)干細胞。

在本發(fā)明提供的實施例中，間充質(zhì)干細胞為第3代間充質(zhì)干細胞。

作為優(yōu)選，間充質(zhì)干細胞的接種密度為(1～10)×10⁴cell/mL。

在本發(fā)明提供的實施例中，間充質(zhì)干細胞的接種密度為2×10⁴cell/mL。

作為優(yōu)選，間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)溫度為37℃。

作為優(yōu)選，間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)時間不低于14天。

優(yōu)選地，間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)時間不低于21天。

本發(fā)明提供了一種成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基及骨向分化方法。該成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、胰島素樣生長因子-1、堿性成纖維生長因子和基礎(chǔ)培養(yǎng)基。本發(fā)明至少具有如下優(yōu)勢之一：

1)本發(fā)明提供一種由多種誘導(dǎo)因子聯(lián)合應(yīng)用作用于hAMSCs等間充質(zhì)干細胞，具有協(xié)同作用，能有效的誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞骨向分化，其成骨分化效果顯著優(yōu)于現(xiàn)有常規(guī)的誘導(dǎo)方法。

2)本發(fā)明采用的原材料是胎盤來源的羊膜組織，胎盤作為孕婦分娩后的廢棄物，目前基本作為醫(yī)療廢棄物而扔掉；而本發(fā)明用于分離培養(yǎng)hAMSCs，進行骨向誘導(dǎo)，有效實現(xiàn)了醫(yī)療廢棄物的再利用。

3)本發(fā)明采用的原材料是胎盤來源的羊膜組織，來源廣、增殖快且不受倫理道德限制。

附圖說明

圖1示hAMSCs表面抗原流式檢測結(jié)果；其中，1-1～1-6分別示CD105、HLA-DR、CD90、CD34、CD73、CD45的陽性表達率；

圖2示對照組和實驗組誘導(dǎo)培養(yǎng)21d、28d的細胞染色效果圖；其中，2-1～2-4分別示對照組1中細胞誘導(dǎo)21天放大40倍、誘導(dǎo)21天放大100倍、誘導(dǎo)28天放大40倍、誘導(dǎo)28天放大100倍的圖片；

2-5～2-8分別示對照組2中細胞誘導(dǎo)21天放大40倍、誘導(dǎo)21天放大100倍、誘導(dǎo)28天放大40倍、誘導(dǎo)28天放大100倍的圖片；

2-9～2-12分別示對照組3中細胞誘導(dǎo)21天放大40倍、誘導(dǎo)21天放大100倍、誘導(dǎo)28天放大40倍、誘導(dǎo)28天放大100倍的圖片；

2-13～2-16分別示對照組4中細胞誘導(dǎo)21天放大40倍、誘導(dǎo)21天放大100倍、誘導(dǎo)28天放大40倍、誘導(dǎo)28天放大100倍的圖片；

2-17～2-20分別示實驗組1中細胞誘導(dǎo)21天放大40倍、誘導(dǎo)21天放大100倍、誘導(dǎo)28天放大40倍、誘導(dǎo)28天放大100倍的圖片；

2-21～2-24分別示實驗組2中細胞誘導(dǎo)21天放大40倍、誘導(dǎo)21天放大100倍、誘導(dǎo)28天放大40倍、誘導(dǎo)28天放大100倍的圖片；

2-25～2-28分別示實驗組3中細胞誘導(dǎo)21天放大40倍、誘導(dǎo)21天放大100倍、誘導(dǎo)28天放大40倍、誘導(dǎo)28天放大100倍的圖片；

2-29～2-32分別示實驗組4中細胞誘導(dǎo)21天放大40倍、誘導(dǎo)21天放大100倍、誘導(dǎo)28天放大40倍、誘導(dǎo)28天放大100倍的圖片；

2-33～2-36分別示實驗組5中細胞誘導(dǎo)21天放大40倍、誘導(dǎo)21天放大100倍、誘導(dǎo)28天放大40倍、誘導(dǎo)28天放大100倍的圖片；

圖3示對照組和實驗組中細胞礦化面積比較；

圖4示不同時間點對照組和實驗組的細胞堿性磷酸酶活性比較；

圖5示對照組和實驗組的OCN、Col-I、Runx2表達水平比較。

具體實施方式

本發(fā)明公開了一種成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基及骨向分化方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明提供的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基及骨向分化方法中所用生物材料、試劑或儀器均可由市場購得。

下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：

實施例1 hAMSCs原代分離培養(yǎng)、鑒定及傳代

取材：無菌條件下取38-40周正常剖宮產(chǎn)胎盤，無肝炎、梅毒、HIV等傳染性疾病，產(chǎn)婦及其家屬對胎盤可能用于科學(xué)研究均簽署了知情同意書。

漂洗：用手術(shù)剪把整個羊膜從胎盤上剪下來放入15cm玻璃培養(yǎng)皿中，去除血塊和損傷較嚴重的部位，PBS緩沖液漂洗3-4次。

剪碎：用手術(shù)剪將羊膜剪成(30-50)cm²大小的組織，分裝到50mL離心管中(體積10-15ml)。

胰酶消化：加入三倍體積的0.25％胰蛋白酶，置37℃、200R恒溫振蕩器中消化30min，每10min取出用手劇烈搖晃。

二次漂洗：消化結(jié)束后，用鑷子將消化好的組織塊轉(zhuǎn)移至裝有PBS緩沖液的250mL儲液瓶中，蓋緊蓋子用手劇烈搖晃，PBS緩沖液漂洗2-3次。

二次剪碎：用手術(shù)剪將羊膜剪成(10-30)cm²大小的組織。

Ⅰ型膠原酶消化：加入20mL的0.5％Ⅰ型膠原酶，補加DMEM/F12培養(yǎng)基至終體積為100mL。置37℃、200R恒溫振蕩器中消化，每10min取出用手劇烈搖晃，直到組織塊完全消化。

過篩：消化完成后，消化好的組織液分裝至50mL離心管，每管20-25mL，加入等體積的PBS緩沖液，2000rpm離心5min。棄上清后加入10mLPBS緩沖液重懸細胞沉淀，200μm細胞篩網(wǎng)過濾。2000rpm離心5min。棄上清，加入5-10mL含10％FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸細胞。

細胞計數(shù)與接種：對細胞懸液進行細胞計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果調(diào)整細胞懸液密度到1.0-1.5×10⁵cell/mL接種于培養(yǎng)皿中，5％CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。

原代培養(yǎng)：細胞接種48h后，對原代細胞進行換液，更換新鮮的含10％FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，放置5％CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)。

傳代：待細胞長滿80-90％，用吸管吸棄舊培養(yǎng)液，加入2-3mL 0.25％胰蛋白酶，消化1-3分鐘，鏡下觀察細胞收縮變圓時，立即加入適量含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化，收集細胞，1500rpm離心5min，棄上清。加入適量含10％FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，進行細胞計數(shù)，按1×10⁵cell/mL密度接種于培養(yǎng)皿中進行傳代培養(yǎng)，5％CO₂培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，每隔3-4天傳代一次。

hAMSCs鑒定：取第2代對數(shù)生長期細胞，流式細胞術(shù)檢測表面抗原CD105、CD90、CD73、CD45、CD34、HLA-DR表達情況，Cell-Quest軟件分析結(jié)果。每個樣本分析6000～8000個細胞。

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，細胞表面抗原CD105、CD90、CD73表達陽性，而CD45、CD34、HLA-DR表達陰性，說明本發(fā)明中得到的hAMSCs屬來源于中胚層的間充質(zhì)干細胞(表1，圖1)。

表1 hAMSCs表面抗原陽性表達率

實施例2 hAMSCs成骨分化

為了驗證本發(fā)明成骨分化誘導(dǎo)的效果，同時設(shè)置4組對照組和5組實驗組，對實驗組和對照組進行茜素紅染色、堿性磷酸酶活性測定及成骨基因OCN、Col-I、Runx2的檢測。

對照組1：為陰性對照組，為常規(guī)培養(yǎng)組，使用的培養(yǎng)液為：含體積分數(shù)10％FBS的低糖DMEM培養(yǎng)液。

對照組2：為陽性對照組，為常規(guī)間充質(zhì)干細胞成骨誘導(dǎo)配方，使用的成骨誘導(dǎo)液為：50μg/L維生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/Lβ-甘油磷酸鈉，體積分數(shù)10％FBS，余量為低糖DMEM培養(yǎng)液。

對照組3：為陽性對照組，使用的成骨誘導(dǎo)液為：50μg/L維生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/Lβ-甘油磷酸鈉，15μg/L胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，體積分數(shù)10％FBS，余量為低糖DMEM培養(yǎng)液。

對照組4：為陽性對照組，使用的成骨誘導(dǎo)液為：50μg/L維生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/Lβ-甘油磷酸鈉，15μg/L堿性成纖維生長因子(FGF-2)，體積分數(shù)10％FBS，余量為低糖DMEM培養(yǎng)液。

實驗組1中使用的成骨誘導(dǎo)液為：50μg/L維生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/Lβ-甘油磷酸鈉，15μg/L胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，15μg/L堿性成纖維生長因子(FGF-2)，體積分數(shù)10％FBS，余量為低糖DMEM培養(yǎng)液。

實驗組2中使用的成骨誘導(dǎo)液為：50μg/L維生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/Lβ-甘油磷酸鈉，5μg/L胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，20μg/L堿性成纖維生長因子(FGF-2)，體積分數(shù)10％FBS，余量為低糖DMEM培養(yǎng)液。

實驗組3中使用的成骨誘導(dǎo)液為：50μg/L維生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/Lβ-甘油磷酸鈉，20μg/L胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，5μg/L堿性成纖維生長因子(FGF-2)，體積分數(shù)10％FBS，余量為低糖DMEM培養(yǎng)液。

實驗組4中使用的成骨誘導(dǎo)液為：50μg/L維生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/Lβ-甘油磷酸鈉，5μg/L胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，5μg/L堿性成纖維生長因子(FGF-2)，體積分數(shù)10％FBS，余量為低糖DMEM培養(yǎng)液。

實驗組5中使用的成骨誘導(dǎo)液為：50μg/L維生素C，1×10^-8mol/L地塞米松，10mol/Lβ-甘油磷酸鈉，20μg/L胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，20μg/L堿性成纖維生長因子(FGF-2)，體積分數(shù)10％FBS，余量為低糖DMEM培養(yǎng)液。

各組培養(yǎng)液的配方如表2：

表2各組培養(yǎng)液的配方

試驗方法及結(jié)果如下：

(一)茜素紅染色

取實施例1制備的第3代hAMSCs，按2×10⁴cell/mL密度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)至細胞達到60％～70％融合以上時，各組分別更換表2所示成骨誘導(dǎo)液。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)21d、28d對細胞進行茜素紅染色。

茜素紅染色的具體方法為：棄培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞2到3次；加入4％多聚甲醛固定10-15min；吸棄多聚甲醛，PBS清洗3次；加入2％茜素紅，37℃孵育30min。孵育結(jié)束后吸棄殘液，用37℃預(yù)熱的去離子水清洗2到3次，每次20s；晾干后在倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。各組細胞染色效果如圖2。

使用圖像分析軟件Image-Pro-Plus 5.0(Media Cybernetics,美國)對各組誘導(dǎo)28天后的3個復(fù)孔中的細胞進行礦化結(jié)節(jié)面積計算。礦化結(jié)節(jié)面積如表3和圖3所示。

表3礦化面積計算結(jié)果

注：※，*，**表p﹤0.01。

由表3和圖2、圖3可知，對照組1不含誘導(dǎo)因子，不對細胞進行成骨分化誘導(dǎo)，因此，沒有著色，礦化面積為零。對照組3、4與對照組2無顯著性差異，說明在常規(guī)成骨分化誘導(dǎo)液的基礎(chǔ)上添加單一的IGF-1或FGF-2均沒有明顯提高hAMSCs成骨分化能力；實驗組2、3、4、5與各對照組之間均有極顯著性差異(*，p﹤0.01)，說明在常規(guī)成骨分化誘導(dǎo)液的基礎(chǔ)上同時添加IGF-1和FGF-2兩種因子能夠有效提高hAMSCs成骨分化能力；實驗組2、3與實驗組4、5之間有極顯著性差異(^※，p﹤0.01)，說明IGF-1和FGF-2兩者聯(lián)合作用下，合理的濃度搭配比過高或過低濃度搭配更能有效的提高hAMSCs成骨分化能力；實驗組1與其他各組均有極顯著性差異(**，p﹤0.01)，說明在常規(guī)成骨分化誘導(dǎo)液的基礎(chǔ)上添加15μg/L胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，15μg/L堿性成纖維生長因子(FGF-2)，促hAMSCs成骨分化效果更佳。實驗組1中的礦化面積均值為80.24±0.40％，是對照組2礦化面積的2.4倍左右。說明本發(fā)明實驗組1所示的成骨分化誘導(dǎo)液進行成骨分化誘導(dǎo)的效果最好。

(二)堿性磷酸酶活性(ALP)測定

對各組hAMSCs分別于誘導(dǎo)分化培養(yǎng)0d、14d、21d和28d對細胞進行堿性磷酸酶活性定量測定。具體測定方法為：

棄原培養(yǎng)液，PBS洗3次，每孔加200μL 0.2％TritonX-100，37℃孵育1h，鏡下可見細胞裂解完全，吸出裂解液至新離心管，離心后取上清，留作備用。

對上述裂解液進行蛋白含量測定，于96孔板中進行。按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書要求設(shè)置測定孔、標準孔和空白孔，每組設(shè)3個復(fù)孔，每孔液體20μL，37℃孵育30min后檢測562nmOD值，空白孔調(diào)零。根據(jù)標準孔OD值繪制蛋白濃度標準曲線，代入各孔OD值，算出各組的蛋白濃度。

對上述裂解液進行堿性磷酸酶活性測定，于96孔板中進行。按堿性磷酸酶測定試劑盒說明書要求設(shè)置測定孔、標準孔和空白孔，37℃孵育15min，每組設(shè)3個復(fù)孔，每孔加150μL顯色液，輕輕震蕩孔板混勻。檢測520nmOD值，空白孔調(diào)零。根據(jù)以下公式計算堿性磷酸酶活性：

堿性磷酸酶活性(U/gprot)＝(測定孔吸光度-空白孔吸光度)÷(標準孔吸光度-空白孔吸光度)×酚標準品濃度÷待測樣本蛋白濃度(gprot/mL)。

表4不同時間點各組細胞堿性磷酸酶活性

實驗結(jié)果如表4和圖4所示。實驗結(jié)果表明，細胞培養(yǎng)14d、21d、28d后，在同一時間內(nèi)，各誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)組(對照組1)堿性磷酸酶的活性均有極顯著性差異(*，p﹤0.01)，實驗組2、3、4、5與各對照組有顯著性差異(※，p﹤0.05)，實驗組2、3與實驗組4、5有顯著性差異(※，p﹤0.05)，實驗組1與其他各組均有極顯著性差異(**，p﹤0.01)。堿性磷酸酶活性隨細胞培養(yǎng)時間增加而升高，但未誘導(dǎo)組(對照組1)上升不明顯，實驗組1顯著升高。

(三)成骨基因OCN、Col-I、Runx2的檢測

各組hAMSCs分別于誘導(dǎo)分化培養(yǎng)21d后，RT-PCR法檢測成骨細胞標志性基因OCN、Col-I、Runx2的表達。按TRIzol試劑盒說明書進行細胞總RNA提取，M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。按SYBR Green定量PCR試劑盒說明書對成骨細胞標志性基因OCN、Col-I、Runx2表達水平進行檢測。β-actin作為內(nèi)參基因。2-△△Ct法定量分析。

表5引物序列表

實驗結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，細胞培養(yǎng)28d后，各誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)組(對照組1)比較，成骨細胞標志性基因OCN、Col-I、Runx2表達水平均有極顯著性差異(*，p﹤0.01)，實驗組2、3、4、5與各對照組比較，均有顯著性差異(※，p﹤0.05)，實驗組1與其他各誘導(dǎo)組均有極顯著性差異(**，p﹤0.01)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。