一種cik細胞的誘導培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及生物技術領域，具體的說是設及一種CIK細胞的誘導培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002] CIK細胞（巧tokinein化cedkiller,細胞因子誘導的殺傷細胞）是一種新型 的免疫活性細胞，它是自體外周血單個核細胞，經多種細胞因子共同誘導培養(yǎng)產生的一類 CD3+和CD56+兩種膜蛋白分子共同表達的殺傷細胞。CIK細胞具有抗腫瘤活性和非MHC殺 瘤特性，是一種具有增殖速度快，殺瘤活性高，殺瘤譜廣等特點的效應細胞。
[0003] 現有誘導培養(yǎng)CIK細胞的方法一般為從外周血分離得到的單個核細胞（PBMC)在 白介素-2(比-2)等細胞因子的作用下在37°C、5%二氧化碳的條件下直接誘導成CIK細胞。 但是運種方法誘導培養(yǎng)的CIK細胞中含有數量較多的CD4+CD25+調節(jié)性T細胞。
[0004] 1995年Sakaguchi發(fā)現成年鼠中近10%的外周CD4巧細胞表達IL-2受體α鏈 CD25。去除運群細胞會引起小鼠自發(fā)產生多種自身免疫性疾病而回輸該細胞則阻止疾病的 發(fā)生。因此將運群細胞命名為CD4+CD25+調節(jié)性Τ細胞Treg。 陽0化]調節(jié)性T細胞燈reg)是抑制性T細胞的一種功能亞群，天然的化eg細胞于1995 年由Sakafguchi等首次報道，他們約占外周血CD4巧細胞數的5% -10%左右。
[0006] 調節(jié)性Treg細胞分為兩類：天然Treg細胞和獲得性Treg細胞，目前認為天然 Treg細胞來自于胸腺，主要通過細胞接觸抑制發(fā)揮抑制功能；獲得性Treg細胞是外周血成 熟T細胞在持續(xù)抗原的刺激和細胞因子條件下誘導產生，主要通過TGF-β、比-10等可溶性 細胞因子發(fā)揮作用。
[0007] 近年來，許多學者對Treg細胞在腫瘤免疫方面大量的研究證實，肝癌、肺癌、卵巢 癌、胃腸道腫瘤、乳腺癌、急慢性淋己細胞白血病、惡性淋己瘤、鼻咽癌等患者外周血或腫瘤 局部Treg細胞成分顯著增加。在對結直腸癌的研究中發(fā)現進展期癌較早期癌患者外周血 調節(jié)性T細胞顯著增加。在對肝癌的研究中發(fā)現，肝癌組織較旁組織Treg細胞明顯增加， 運些分布方式說明，在腫瘤組織中的Treg由于與效應細胞T淋己細胞的緊密接觸，抑制效 應細胞的功能，從而發(fā)揮腫瘤免疫作用。因此，為了使免疫細胞治療，如CIK細胞治療，發(fā)揮 最大的免疫作用，故尋求一種降低CD4+CD25+調節(jié)性T細胞數量的CIK誘導培養(yǎng)方法非常 必要。

【發(fā)明內容】

[0008] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種CIK細胞的誘導培養(yǎng)方法，使得所述方法 能夠顯著降低CIK細胞中CD4+CD25+調節(jié)性T細胞數量。
[0009] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種CIK細胞的誘導培養(yǎng)方法，使得所述方法顯著 提高誘導培養(yǎng)出的CIK細胞中的效應細胞數量。
[0010] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種CIK細胞的誘導培養(yǎng)方法，使得所述方法顯著 提高誘導培養(yǎng)出的CIK細胞的殺傷活性。
[0011] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種CIK細胞的誘導培養(yǎng)方法，使得所述方法提高 誘導培養(yǎng)出的CIK細胞分泌TGF-β和IL-10的能力。
[0012] 為了實現上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：
[0013] 一種CIK細胞的誘導培養(yǎng)方法，包括：
[0014] 步驟1、用抗CD8抗體包被細胞培養(yǎng)容器；
[0015] 步驟2、將單個核細胞用免疫細胞培養(yǎng)基重懸并接種在步驟1包被好的容器中，添 加IFN-λ細胞因子于39°C下進行細胞培養(yǎng)；
[0016] 步驟3、培養(yǎng)后去掉培養(yǎng)基并再次加入新鮮的免疫細胞培養(yǎng)基重懸，并轉移至新的 容器中，添加IFN-λ、比-1α、0KT-3W及比-2細胞因子誘導培養(yǎng)CIK細胞，定期補充新鮮 培養(yǎng)基和IL-2細胞因子。
[0017] 針對現有CIK細胞誘導培養(yǎng)方法誘導的細胞中CD4+CD25+調節(jié)性Τ細胞數量較 高、效應細胞較少、殺傷活性不高W及分泌TGF-β和IL-10能力不高的一系列問題，本發(fā)明 在前期將單個核細胞培養(yǎng)在抗CD8抗體包被的容器中，并添加適當的細胞因子和提高細胞 培養(yǎng)溫度，而后期培養(yǎng)添加多種適宜細胞因子進行CIK細胞的誘導培養(yǎng)，才能夠多個措施 入手降低CD4+CD25+調節(jié)性Τ細胞數量。
[0018] 其中，作為優(yōu)選，所述單個核細胞采用Ficoll分離液運用S巧mate離屯、管從外周 血分離獲得。除此之外，本領域技術人員也可參照已公開的單個核細胞分離方法。
[0019] 作為優(yōu)選，步驟2所述IFN-λ細胞因子的濃度為500-1500U/I止，具體可W選擇 500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400 或 1500U/mL。
[0020] 作為優(yōu)選，所述免疫細胞培養(yǎng)基為X-VIV0 15培養(yǎng)基。
[0021] 作為優(yōu)選，所述單個核細胞接種W5Xl〇5-10X1〇5個/ml的細胞密度接種。
[0022] 作為優(yōu)選，步驟3所述各細胞因子濃度為500-1500U/mLIFN-λ、50-150U/mL的 比-Ια、10-50ng/ml的ΟΚΤ-3W及l(fā)OO-lOOOU/ml的比-2。其中，IFN-λ具體可W選擇 500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400或 1500U/mL;IL-1α具體可W選擇50、 75、100、125 或 150U/mL;0ΚΤ-3 具體可W選擇 10、20、30、40 或 50ng/ml;比-2 具體可W選擇 100、200、300、400、500、550、600、700、800、900 或lOOOU/ml。
[0023] 作為優(yōu)選，步驟3所述誘導培養(yǎng)細胞為在37°C、5%二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)14天。
[0024] 作為優(yōu)選，步驟2所述培養(yǎng)為在39°C、5%二氧化碳的環(huán)境中培養(yǎng)12-2地。 陽0巧]作為優(yōu)選，所述細胞培養(yǎng)容器為細胞培養(yǎng)瓶，例如T75細胞培養(yǎng)瓶等。 陽0%] 按照本發(fā)明方法誘導培養(yǎng)的CIK細胞其CD4+CD25+調節(jié)性T細胞數量為3.6%， 而現有的誘導培養(yǎng)方法中CD4+CD25+調節(jié)性T細胞數量為6. 7%，明顯得到降低，從而降低 了CIK細胞中CD4+CD25+調節(jié)性T細胞的免疫抑制作用。同時，本發(fā)明誘導的CIK細胞中 效應細胞數量為34. 3%，而現有的誘導培養(yǎng)方法中效應細胞的數量為20.8%，顯著提高效 應細胞的數量。
[0027] 此外，本發(fā)明還對所誘導的CIK細胞進行了殺傷活性檢測W及TGF-β和IL-10含 量檢測，雖然本發(fā)明改變了誘導培養(yǎng)方法，但是CIK細胞的殺傷活性和分泌TGF-β和IL-10 含量并未受到影響，且高于現有的CIK細胞的誘導培養(yǎng)方法。
[0028] 由W上技術方案可知，本發(fā)明增加單個核細胞在抗CD8抗體中培養(yǎng)的環(huán)節(jié)，并 調整誘導培養(yǎng)環(huán)節(jié)中細胞因子的加入，從多個方面整體控制誘導培養(yǎng)的過程，抑制了 CD4+CD25+調節(jié)性Τ細胞的產生，降低了其數量進而降低了其免疫抑制作用，使CIK細胞治 療發(fā)揮最大的免疫作用。
【附圖說明】
[0029] 圖1所示本發(fā)明所述方法誘導培養(yǎng)14天后CIK細胞的鏡檢圖；
[0030] 圖2所示為CIK細胞效應細胞W及CD4+CD25+調節(jié)性T細胞的流式檢測結果；其 中A為本發(fā)明誘導的CIK細胞CD4+CD25+調節(jié)性T細胞的流式檢測圖，B為現有方法誘導 的CIK細胞CD4+CD25+調節(jié)性T細胞的流式檢測圖，C為本發(fā)明誘導的CIK細胞效應細胞 的流式檢測圖，D為現有方法誘導的CIK細胞效應細胞的流式檢測圖；
[0031] 圖3所示為TGF-β標準品的吸光度值曲線；
[0032] 圖4所示為比-10標準品的吸光度值曲線。
【具體實施方式】
[0033] 本發(fā)明實施例公開了一種CIK細胞的誘導培養(yǎng)方法。本領域技術人員可W借鑒本 文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術 人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經通過較佳實施例 進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本【發(fā)明內