本發(fā)明涉及培養(yǎng)基技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種TIL細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
目前TIL細(xì)胞(即腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞)培養(yǎng)多用RPMI-1640或者DMEM培養(yǎng)基，但由于TIL細(xì)胞自身增殖能力不強(qiáng)，單純的RPMI-1640或者DMEM培養(yǎng)基無(wú)法提高TIL細(xì)胞生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)成分，因此目前培養(yǎng)TIL細(xì)胞多用含有10～20wt％胎牛血清的RPMI-1640或者DMEM培養(yǎng)基。但是使用胎牛血清培養(yǎng)TIL細(xì)胞存在多種問(wèn)題，不僅增加了培養(yǎng)基的成本，而且不同品牌的胎牛血清之間差異較大，另外由于胎牛血清中成分復(fù)雜，這些成分會(huì)嚴(yán)重影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性，培養(yǎng)基可重復(fù)性差，培養(yǎng)效率僅為15～20％。而且由于臨床所使用的細(xì)胞制品嚴(yán)禁殘留動(dòng)物血清蛋白，而常規(guī)培養(yǎng)基中存在胎牛血清，工藝上需要增加細(xì)胞制成品中牛血清蛋白殘余檢測(cè)，增加了生產(chǎn)難度和成本，促使人們開(kāi)始進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)。
因此目前TIL細(xì)胞培養(yǎng)基存在培養(yǎng)效率不高、細(xì)胞活性低下、后續(xù)實(shí)驗(yàn)干擾、動(dòng)物血清蛋白殘留等較大的問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種TIL細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法，提高了TIL細(xì)胞培養(yǎng)效率，增加細(xì)胞活性，保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，降低了TIL細(xì)胞培養(yǎng)基的使用成本，而且避免動(dòng)物血清蛋白的摻入，節(jié)省了TIL細(xì)胞培養(yǎng)基的配置工序和成本。
本發(fā)明提出的一種TIL細(xì)胞培養(yǎng)基，其組分包括：RPMI-1640培養(yǎng)基、白 介素-2、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、煙酸、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子α。
優(yōu)選地，白介素-2的終濃度為5～20μg/L，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的終濃度為0.1～0.5μg/L，煙酸的終濃度為30～100μg/L，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的終濃度為20～100μg/L，腫瘤壞死因子α的終濃度為10～50μg/L。
優(yōu)選地，白介素-2的終濃度為10μg/L，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的終濃度為0.2μg/L，煙酸的終濃度為50μg/L，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的終濃度為50μg/L，腫瘤壞死因子α的終濃度為20μg/L。
優(yōu)選地，所述TIL細(xì)胞培養(yǎng)基的pH值為7.35～7.40。
本發(fā)明還提出的上述TIL細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，向RPMI-1640培養(yǎng)基中加入白介素-2完全溶解后，靜置，再加入內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子完全溶解后，靜置，接著加入煙酸完全溶解后，靜置，繼續(xù)加入粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子完全溶解后，靜置，然后加入腫瘤壞死因子α完全溶解后，靜置，接著調(diào)節(jié)pH值，然后濾膜過(guò)濾得到TIL細(xì)胞培養(yǎng)基。
優(yōu)選地，濾膜的孔徑為0.1μm，用于去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)及可能含有的微生物。
優(yōu)選地，采用丙酮酸鈉調(diào)節(jié)pH值。
優(yōu)選地，靜置時(shí)間均為4～6min。
為了提高TIL細(xì)胞培養(yǎng)效率，增加TIL細(xì)胞活性，保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，本發(fā)明在RPMI-1640培養(yǎng)基的基礎(chǔ)之上，完全不加入胎牛血清，針對(duì)RPMI-1640培養(yǎng)基本身營(yíng)養(yǎng)較差的特點(diǎn)，創(chuàng)新性地加入多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括白介素-2、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、煙酸、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子α，各種成分濃度固定，培養(yǎng)基配置可重復(fù)性好，同時(shí)降低了TIL細(xì)胞培養(yǎng) 基的使用成本，而且避免動(dòng)物血清蛋白的摻入，節(jié)省了TIL細(xì)胞培養(yǎng)基的配置工序和成本。
具體實(shí)施方式
下面，通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1
本發(fā)明提出的一種TIL細(xì)胞培養(yǎng)基，其組分包括：RPMI-1640培養(yǎng)基、白介素-2、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、煙酸、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子α；其中，白介素-2的終濃度為5μg/L，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的終濃度為0.5μg/L，煙酸的終濃度為30μg/L，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的終濃度為100μg/L，腫瘤壞死因子α的終濃度為10μg/L。
本發(fā)明還提出的上述TIL細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，向RPMI-1640培養(yǎng)基中加入白介素-2完全溶解后，靜置6min，再加入內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子完全溶解后，靜置4min，接著加入煙酸完全溶解后，靜置6min，繼續(xù)加入粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子完全溶解后，靜置4min，然后加入腫瘤壞死因子α完全溶解后，靜置6min，接著采用丙酮酸鈉調(diào)節(jié)pH值至7.35，然后孔徑為0.1μm的濾膜過(guò)濾得到TIL細(xì)胞培養(yǎng)基。
實(shí)施例2
本發(fā)明提出的一種TIL細(xì)胞培養(yǎng)基，其組分包括：RPMI-1640培養(yǎng)基、白介素-2、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、煙酸、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子α；其中，白介素-2的終濃度為20μg/L，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的終濃度為0.1μg/L，煙酸的終濃度為100μg/L，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的終濃度為20μg/L，腫瘤壞死因子α的終濃度為50μg/L。
本發(fā)明還提出的上述TIL細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，向RPMI-1640培養(yǎng)基中 加入白介素-2完全溶解后，靜置4min，再加入內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子完全溶解后，靜置6min，接著加入煙酸完全溶解后，靜置4min，繼續(xù)加入粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子完全溶解后，靜置6min，然后加入腫瘤壞死因子α完全溶解后，靜置4min，接著采用丙酮酸鈉調(diào)節(jié)pH值至7.38，然后孔徑為0.1μm的濾膜過(guò)濾得到TIL細(xì)胞培養(yǎng)基。
實(shí)施例3
本發(fā)明提出的一種TIL細(xì)胞培養(yǎng)基，其組分包括：RPMI-1640培養(yǎng)基、白介素-2、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、煙酸、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子α；其中，白介素-2的終濃度為10μg/L，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的終濃度為0.2μg/L，煙酸的終濃度為50μg/L，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的終濃度為50μg/L，腫瘤壞死因子α的終濃度為20μg/L。
本發(fā)明還提出的上述TIL細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，在室溫為20～25℃、濕度為40～60％、處于常壓狀態(tài)的二級(jí)生物安全柜中，向500mL RPMI-1640培養(yǎng)基中加入5μg白介素-2完全溶解后，靜置5min，再加入0.1μg內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子完全溶解后，靜置5min，接著加入25μg煙酸完全溶解后，靜置5min，繼續(xù)加入25μg粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子完全溶解后，靜置5min，然后加入10μg腫瘤壞死因子α完全溶解后，靜置5min，接著采用丙酮酸鈉調(diào)節(jié)pH值至7.40，然后孔徑為0.1μm的濾膜過(guò)濾去除所有微生物得到TIL細(xì)胞培養(yǎng)基。
實(shí)施例3所得TIL細(xì)胞培養(yǎng)基為酚紅色液體，澄清無(wú)渾濁。
取實(shí)施例3所得TIL細(xì)胞培養(yǎng)基在37℃、5％CO2條件下空培96h，外觀無(wú)明顯變化，顯微鏡下未見(jiàn)渾濁物。
取實(shí)施例3所得TIL細(xì)胞培養(yǎng)基在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)TIL細(xì)胞，48h采用細(xì)胞計(jì)數(shù)及MTS法檢測(cè)細(xì)胞活性，細(xì)胞培養(yǎng)效率達(dá)50％以上，具有增殖活 性的TIL細(xì)胞>90％。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。