技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有機(jī)化學(xué)和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種嘧啶類化合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
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惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的一大疾病，惡性腫瘤已成為我國(guó)第二大致死疾病，僅次于心腦血管疾病。傳統(tǒng)抗腫瘤藥物主要分為烷化劑、抗代謝、生物堿、激素和抗生素五個(gè)主要類別。傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物大都是偶然發(fā)現(xiàn)或者基于其結(jié)構(gòu)與關(guān)鍵造血因子的相似性開發(fā)。例如，第一個(gè)修飾dna的藥物由芥子氣衍生而來(lái)：在戰(zhàn)爭(zhēng)中受芥子氣毒害的幸存者患有白細(xì)胞減少癥病，這引導(dǎo)人們?cè)?943年使用芥子氣衍生物氮芥治療淋巴瘤。在二十世紀(jì)的后幾十年中，這類藥物的使用(用量，時(shí)機(jī)及方案)純粹基于臨床觀察來(lái)決定。直到后來(lái)才慢慢明白這些化療藥物的作用機(jī)理：干擾dna的完整性；干擾dna的復(fù)制；作用于有絲分裂紡錘體中微管，阻止染色體向兩極中心體的移動(dòng)，從而抑制有絲分裂。這些早期的抗腫瘤藥物(如鉑衍生物，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，核苷類似物，長(zhǎng)春新堿類和紫杉醇)在現(xiàn)在仍然是臨床上使用較多的藥物，它們能成功地治療很多癌癥，但它們并不是對(duì)所有類型的癌癥都有效。重要的是，這些化療藥物有可能導(dǎo)致繼發(fā)性惡性腫瘤。此外，這些藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞缺乏選擇性，存在很高的細(xì)胞毒性，會(huì)抑制快速增長(zhǎng)的正常細(xì)胞(如腸上皮細(xì)胞、毛發(fā)細(xì)胞、生殖細(xì)胞)和心肌細(xì)胞、外周神經(jīng)細(xì)胞，因此常伴隨有嚴(yán)重的毒副反應(yīng)，這極大地制約了它們的臨床藥效和應(yīng)用。
隨著分子醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，傳統(tǒng)抗腫瘤藥物的局限性和腫瘤細(xì)胞分子機(jī)制的闡明，開發(fā)廣譜低毒或具有靶向性的抗腫瘤藥物已成為人們最為關(guān)注的熱點(diǎn)?？拱┧幬锏难芯恳呀?jīng)從傳統(tǒng)的，非特異的細(xì)胞毒藥物向作用于多信號(hào)傳導(dǎo)分子，多環(huán)節(jié)的選擇性靶向抗癌藥物發(fā)展。癌細(xì)胞靶點(diǎn)主要涉及多種信號(hào)通路，主要是基因融合的產(chǎn)物、獲得性突變、過(guò)表達(dá)的癌基因。這些靶點(diǎn)有的是基因上發(fā)生改變并對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)展至關(guān)重要的，被稱為癌基因成癮性(oncogeneaddiction)，其他靶點(diǎn)并沒有在基因上發(fā)生改變，但是對(duì)腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞更為重要，被稱為非癌基因成癮性(non-oncogeneaddiction)。
2014年，著名的學(xué)術(shù)期刊《自然》(nature)在同一期中連續(xù)發(fā)表兩篇論文(nature508,215–221；nature508,222–227)，證實(shí)8-羥基鳥嘌呤核苷酸酶(humanmutthomologuemth1；8-oxoguaninenucleosidetriphosphatase)可作為抗腫瘤的一個(gè)新的非癌基因成癮性靶點(diǎn)。
mth1的主要生物功能是修復(fù)因自由基導(dǎo)致的dna氧化損傷。氧在體內(nèi)代謝中會(huì)產(chǎn)生一系列活性氧自由基(reactiveoxygenspecies，ros)。作為堿基基本組成之一的鳥嘌呤，其氧化電勢(shì)最低，最容易被ros氧化。目前已被確認(rèn)的鳥嘌呤氧化產(chǎn)物有15種，其中羥自由基可使鳥嘌呤8位碳原子氧化，形成8-羥基-脫氧鳥嘌呤(8-oxoguannine，8-oxog)，鳥嘌呤c8位的氧化形成8-oxog是最多見的，數(shù)量也是最多的，且具有遺傳毒性，而且越來(lái)越多的研究表明，8-oxog較為穩(wěn)定地在體內(nèi)存在且容易被檢測(cè)，被視為重要的dna氧化損傷的生物標(biāo)志物之一。8-oxog的存在會(huì)導(dǎo)致dna鏈在復(fù)制時(shí)發(fā)生錯(cuò)配，進(jìn)而發(fā)生dna斷裂、突變和細(xì)胞凋亡。而mth1可以清除8-oxog。有趣的是，mth1在很多腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)(mol.cell.biol.24,465–474；oncogene30,1489–1496)，因此mth1抑制劑可以被開發(fā)為抗腫瘤藥物。目前所知的mth1抑制劑還很少，只有上述兩篇《自然》論文中各自發(fā)表的兩類抑制劑，以th588和(s)-crizotinib為代表，
其中th588選擇性抑制mth1且抑制活性(ic50＝15.0nm)較好。但是，th588的對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制活性卻偏低。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種具有8-羥基鳥嘌呤核苷酸酶抑制活性的嘧啶類化合物，為了得到對(duì)腫瘤細(xì)胞具有高抑制活性的mth1抑制劑，本發(fā)明以th588為先導(dǎo)化合物，應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)手段，設(shè)計(jì)合成了一系列結(jié)構(gòu)新穎的mth1抑制劑。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：
一種嘧啶類化合物，結(jié)構(gòu)如式(i)所示:
r1選自氫、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、二甲氨基、cl-6烷基、cl-6全氟烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、c3-6環(huán)烷基、c3-12雜脂環(huán)基或cl-6烷氧基中的一種；
r2選自氫、cl-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、c3-6環(huán)烷基、c3-6環(huán)烷氧基、c3-12雜脂環(huán)基、芳基、取代芳基或基團(tuán)p中的一種，p基團(tuán)為
r3選自氫或基團(tuán)q，基團(tuán)q為
基團(tuán)p和基團(tuán)q至少出現(xiàn)一個(gè)；
m為1-7；n為1-7。
優(yōu)選地，嘧啶類化合物結(jié)構(gòu)如式(ia)所示:
式中，x選自o、s、nh或-nhco-中的一種；
r1選自氫、鹵素、硝基、氰基、氨基、二甲氨基、cl-6烷基或cl-6全氟烷基中的一種；
r2選自氫、cl-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、c3-6環(huán)烷基、c3-6環(huán)烷氧基、c3-12雜脂環(huán)基、芳基或取代芳基中的一種；n為1-7。
優(yōu)選地，嘧啶類化合物結(jié)構(gòu)如式(ib)所示:
式中，r1選自氫、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、二甲氨基、cl-6烷基、cl-6全氟烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、c3-6環(huán)烷基、c3-12雜脂環(huán)基或cl-6烷氧基中的一種；m為1-7。
優(yōu)選地，嘧啶類化合物結(jié)構(gòu)如式(ic)所示：
式中，x選自o、s、nh或-nhco-中的一種；m為1-7；n為1-7。
優(yōu)選地，所述嘧啶類化合物包括以下化合物：
(e)-n-(3-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)苯基)-6-(3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺基)己酰胺；
(e)-n-(3-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)苯基)-5-(3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺基)戊酰胺；
(e)-n-(3-(2-氨基-6-(甲氨基)嘧啶-4-基)苯基)-5-(3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺基)戊酰胺；
(e)-n-(3-(2-氨基-6-(乙炔氨基)嘧啶-4-基)苯基)-5-(3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺基)戊酰胺；
(e)-n-(5-(3-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)戊基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺；
(e)-n-(5-(4-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)戊基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺；
(e)-n-(5-(2-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)戊基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺；
(e)-n-(5-(3-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)-2,4-二氟苯酚基)戊基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺；
(e)-n-(5-(3-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)-2-氯4-氟苯酚基)戊基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺；
(e)-n-(2-(3-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)乙基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺；
(e)-n-(3-(3-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)丙基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺；
(e)-n-(7-(3-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)庚基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺；
(e)-n-(6-(3-(2-氨基-6-(甲氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺；
(e)-n-(6-(3-(2-氨基-6-(環(huán)丁氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺；
(e)-n-(6-(3-(2-氨基-6-(丙烯氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺；
(e)-n-(6-(3-(2-氨基-6-((3-乙炔苯基)氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺；
(e)-n-(6-((3-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)苯基)氨基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺；
(e)-n-(6-((3-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)苯基)巰基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺；
(e)-n-(6-((2-氨基-6-(2,3-二氯苯基)嘧啶-4-基)氨基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺；
(e)-n-(5-((2-氨基-6-苯基嘧啶-4-基)氨基)戊基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺；
(e)-n-(6-((2-氨基-6-(3-氨基苯基)嘧啶-4-基)氨基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺；
(e)-n-(6-((2-氨基-6-(2-甲基苯基)嘧啶-4-基)氨基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺；
(e)-n-(6-((2-氨基-6-(4-氰基苯基)嘧啶-4-基)氨基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺；
(e)-n-(6-((2-氨基-6-(3-(吡咯-1-基)苯基)嘧啶-4-基)氨基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺；
(e)-n-(6-((2-氨基-6-(2-三氟甲基苯基)嘧啶-4-基)氨基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺；
(e)-n-(6-((2-氨基-6-(3-乙炔基苯基)嘧啶-4-基)氨基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺；
(e)-n-(6-(3-(2-氨基-6-((5-((e)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺基)戊基)氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺。
本發(fā)明還提供了所述嘧啶類化合物的制備方法，可以選自如下幾種合成路線：
由步驟scheme1組成：
其中，x選自o、s或nh；
r1選自氫、鹵素、硝基、氰基、氨基、二甲氨基、cl-6烷基或cl-6全氟烷基中的一種；
r2選自氫、cl-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、c3-6環(huán)烷基、c3-6環(huán)烷氧基、c3-12雜脂環(huán)基、芳基或取代芳基中的一種；n為1-7；
lg選自f、cl、br、i、oms、ots或otf中的一種，lg表示有機(jī)化學(xué)中常見的離去基團(tuán)；
pg選自boc、fmoc或cbz，pg表示有機(jī)化學(xué)中常見的氨基的保護(hù)基團(tuán)。
或由步驟scheme2組成：
其中，r1選自氫、鹵素、硝基、氰基、羥基、氨基、二甲氨基、cl-6烷基、cl-6全氟烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、c3-6環(huán)烷基、c3-12雜脂環(huán)基或cl-6烷氧基中的一種；m為1-7；pg選自boc、fmoc或cbz，pg表示有機(jī)化學(xué)中常見的氨基的保護(hù)基團(tuán)。
或由步驟scheme3組成：
其中，x選自o、s或nh；m為1-7；n為1-7；
lg選自f、cl、br、i、oms、ots或otf中的一種，lg表示有機(jī)化學(xué)中常見的離去基團(tuán)；
pg選自boc、fmoc或cbz，pg表示有機(jī)化學(xué)中常見的氨基的保護(hù)基團(tuán)。
或由步驟scheme4組成：
其中，r2選自氫、cl-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基、c3-6環(huán)烷基、c3-6環(huán)烷氧基、c3-12雜脂環(huán)基、芳基或取代芳基中的一種；n為1-7；
pg選自boc、fmoc或cbz，pg表示有機(jī)化學(xué)中常見的氨基的保護(hù)基團(tuán)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供嘧啶類化合物在制備治療因8-羥基鳥嘌呤核苷酸酶活性異常所引起的疾病藥物中的應(yīng)用。
優(yōu)選地，所述疾病為腫瘤，包括實(shí)體瘤和液體瘤。
本發(fā)明化合物組成的藥物組合物的應(yīng)用中所述的腫瘤包括：肺癌、骨癌、膜腺癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內(nèi)黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、月工門區(qū)癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、陰戶癌、何杰金病、食道癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎癌、中樞神經(jīng)中樞系統(tǒng)贅生物、脊柱軸腫瘤、垂體腺瘤、胃腸間質(zhì)腫瘤、結(jié)腸直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、肥大細(xì)胞增多癥、膠質(zhì)瘤、肉瘤、淋巴瘤中的一種或任意幾種的組合。
本發(fā)明的目的還在于提供一種用于治療因8-羥基鳥嘌呤核苷酸酶活性異常所引起的疾病的藥物，藥物包含嘧啶類化合物中一種或幾種或其在藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑合物、前藥。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提出的嘧啶類化合物是8-羥基鳥嘌呤核苷酸酶(humanmutthomologuemth1；8-oxoguaninenucleosidetriphosphatase)抑制劑，可用于治療因8-羥基鳥嘌呤核苷酸酶活性異常所引起的疾病，例如腫瘤。
具體實(shí)施方式：
以下是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
除特別說(shuō)明，本發(fā)明使用的設(shè)備和試劑為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)市購(gòu)產(chǎn)品。
根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的公知常識(shí)，化學(xué)反應(yīng)多數(shù)情況下需要在溶劑中進(jìn)行，制備本發(fā)明的化合物常用的溶劑(solvent)包括但不限于水、甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、二氯甲烷、1，2－二氯乙烷、氯仿、四氫呋喃、二氧六環(huán)、乙酸乙醋、乙醋、甲基叔丁醋、已烷、環(huán)己烷、甲苯、乙腈、乙二醇二甲醚、n,n-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜或這些溶劑中的兩種或多種的混合物等。
化學(xué)反應(yīng)有些情況下需要在堿存在的情況下發(fā)生，制備本發(fā)明的化合物常用的堿(base)包括但不限于et3n、i-pr2net、吡啶、dbu、dabco、naoh、koh、cs2c03、na2co3、k2co3、nahco3、kf、csf、k3po3、k2hpo4、kh2po4、nah、n-buli、s-buli、t-buli、nan(sime3)2、lin(sime3)2、kn(sime3)2或這些堿中的兩種或多種的混合物等。
化學(xué)反應(yīng)有些情況下需要在偶聯(lián)試劑存在的情況下發(fā)生，制備本發(fā)明的化合物常用的偶聯(lián)試劑(coup1ingreagent)包括但不限于dcc、edci、hatu、tbtu、bop、pybop、pybrop、dic、hobt、hoat、cdi、depbt等。
本發(fā)明的化合物的制備方法中有些步驟需要脫保護(hù)基(deprotection)，當(dāng)保護(hù)基是boc時(shí)，常用的脫保護(hù)試劑包括但不限于hcl、tfa、h2so4等；當(dāng)保護(hù)基是fmoc時(shí)，常用的脫保護(hù)試劑包括但不限于哌啶，二乙胺等；當(dāng)保護(hù)基是cbz時(shí)，常用的脫保護(hù)試劑包括但不限于濃hcl、h2+pd/c等。
本發(fā)明的化合物的制備方法中的反應(yīng)通常在常溫下進(jìn)行，但有時(shí)需要降低至－78℃或加熱至200℃；反應(yīng)通常在前述的溶劑及溫度及常規(guī)攪拌條件下進(jìn)行；當(dāng)使用的堿、試劑、催化劑對(duì)水或氧氣敏感時(shí)，反應(yīng)需在無(wú)水無(wú)氧條件下進(jìn)行。
“藥學(xué)上可接受的鹽”指本發(fā)明所述化合物與無(wú)機(jī)酸、有機(jī)酸通過(guò)化學(xué)反應(yīng)形成的鹽，這種鹽保留本發(fā)明所述化合物的生物活性及有效性。所述的無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸可以為：鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、碳酸、磷酸、高氯酸、醋酸、檸檬酸、草酸、乳酸、蘋果酸、水楊酸、酒石酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、取代的苯磺酸(例如，對(duì)甲基苯磺酸)、異煙酸、油酸、鞣酸、泛酸、抗壞血酸、丁二酸、馬來(lái)酸、龍膽酸、富馬酸、葡萄糖酸、糖醛酸、葡萄糖二酸或蔗糖酸、甲酸、苯甲酸、谷氨酸、雙羥萘酸、山梨酸等。
“溶劑合物”指本發(fā)明所述化合物與化學(xué)上常用的溶劑以共價(jià)鍵、氫鍵、離子鍵、范德華力、絡(luò)合、包合等形成的穩(wěn)定物質(zhì)，所述的溶劑可以為：甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、丙酣、乙酮、乙腈、甲基叔丁基醚等。
“前藥”指通過(guò)化學(xué)合成或物理的方法將本發(fā)明中的化合物轉(zhuǎn)化為另一種化合物，并將該化合物給予哺乳動(dòng)物后，在動(dòng)物體內(nèi)被轉(zhuǎn)化成本發(fā)明所述的化合物。利用“前藥”方法通常是為了克服藥物化合物本身不良或欠佳的物理化學(xué)性質(zhì)或成藥性。
實(shí)施例1
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(3-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)苯基)-5-(3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺基)戊酰胺的制備：
第一步：
將2-氨基-4,6-二氯嘧啶(1g,6.45mmol)和3-氨基苯硼酸(0.96g,5.87mmol)溶于1,4－二氧六環(huán)(20ml)和水(5ml)中，加入碳酸鈉(1.24g,11.74mmol)和四三苯基膦鈀(170mg,0.15mmol)，于90℃反應(yīng)2小時(shí)，減壓蒸除溶劑，加入乙酸乙酯(50ml)和水(40ml)，萃取后有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸除溶劑后柱層析得到化合物1-1(1g，產(chǎn)率78％)。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：1hnmr(400mhz,dmso)δ7.28(s,1h),7.19(d,j＝7.8hz,1h),7.13(t,j＝7.8hz,1h),7.07(s,2h),6.72(dd,j＝7.8,2.4hz,1h),5.31(brs,2h).ms(esi,m/z):254.1[m+na]+。
第二步：
將化合物1-1(1g,4.54mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺，依次加入5-(n-叔丁氧羰基氨基)戊酸(1.2g,4.54mmol)和edci(1.25g,9.08mmol)、n,n-二異丙基乙胺(1.6ml,9.08mmol)，在常溫下反應(yīng)5小時(shí)，減壓蒸除溶劑，加入乙酸乙酯(40ml)和水(30ml)，萃取后有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸除溶劑后柱層析得到化合物1-2(1.6g，產(chǎn)率90％)。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.20(s,1h),7.68-7.64(m,3h),7.40(t,j＝8.0hz,1h),7.06(s,1h),5.31(s,2h),4.61(s,1h),3.12(q,j＝6.3hz,2h),2.38(t,j＝6.5hz,2h),1.52–1.50(m,2h),1.43–1.40(m,4h),1.40(s,9h).
第三步：
將化合物1-2(1.6g,4.05mmol)溶于正丁醇，加入環(huán)丙胺(2.77ml,40mmol)和n,n-二異丙基乙胺(3.57ml,20mmol)，在95℃反應(yīng)24小時(shí)，減壓蒸除溶劑，加入乙酸乙酯(40ml)和水(30ml)，萃取后有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸除溶劑后柱層析得到化合物1-3(1.3g，產(chǎn)率74％)。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.24(2,1h),7.98(s,1h),7.82(d,j＝7.6hz,1h),7.54(d,j＝7.6hz,1h),7.34(t,j＝7.6hz,1h),6.44(s,1h),5.85(s,1h),5.43(brs,2h),4.71(s,1h),3.60(t,j＝6.3hz,2h),3.08(q,j＝6.5hz,2h),2.60(s,1h),2.35–2.32(t,j＝6.3hz,2h),1.73–1.66(m,2h),1.50–1.32(m,13h),0.85–0.82(m,2h),0.62–0.59(m,2h).ms(esi,m/z):441.2[m+h]+。
第四步：
將化合物1-3(1.3g,3mmol)溶于二氯甲烷(10ml)，加入三氟乙酸(2ml)，常溫下反應(yīng)2小時(shí)，減壓蒸除溶劑，得到棕色油狀物。將油狀物用二氯甲烷(20ml)溶解，依次加入n,n-二異丙基乙胺(1.6ml,9mmol)，反-3(3-吡啶基)烯丙酸(448mg,3mmol)、edci(1.7g,9mmol)、dmap(73mg,0.6mmol)，在常溫反應(yīng)4小時(shí)，加入飽和氯化銨(20ml)，用二氯甲烷萃取(20mlx3)，合并有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸除溶劑后柱層析得到化合物1((e)-n-(3-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)苯基)-5-(3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺基)戊酰胺)(0.9g，產(chǎn)率68％)。
產(chǎn)物鑒定結(jié)果：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.69(d,j＝2.2hz,1h),8.53(dd,j＝4.9,1.6hz,1h),8.07(s,1h),7.97(s,1h),7.73(d,j＝8.0hz,1h),7.71(d,j＝8.0hz,1h),7.60(d,j＝8.0hz,1h),7.56(d,j＝15.7hz,1h),7.36(t,j＝7.9hz,1h),7.26(t,j＝4.3hz,1h),6.52–6.49(m,2h),6.37(t,j＝5.7hz,1h),5.30(s,1h),5.24(s,1h),4.88(s,2h),3.38(q,j＝6.6hz,2h),2.58–2.56(m,1h),2.38(t,j＝6.2hz,2h),1.78–1.70(m,2h),1.60–1.55(m,2h),1.45–1.37(m,2h),0.84–0.79(m,2h),0.59–0.52(m,2h).
實(shí)施例2
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(3-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)苯基)-6-(3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺基)己酰胺的制備：
制備方法類同實(shí)施例1。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：ms(esi,m/z):508.1[m+na]+。
實(shí)施例3
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(3-(2-氨基-6-(甲氨基)嘧啶-4-基)苯基)-5-(3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺基)戊酰胺的制備：
制備方法同實(shí)施例1。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：ms(esi,m/z):468.1[m+na]+。
實(shí)施例4
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(3-(2-氨基-6-(乙炔氨基)嘧啶-4-基)苯基)-5-(3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺基)戊酰胺的制備：
制備方法同實(shí)施例1。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：ms(esi,m/z):478.2[m+na]+。
實(shí)施例5
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(5-(3-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)戊基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
第一步：
將2-氨基-4,6-二氯嘧啶(2.1g,15.2mmol)和3-羥基苯硼酸(2.27g,13.8mmol)溶于1,4－二氧六環(huán)(20ml)和水(5ml)中，加入碳酸鈉(2.92g,27.6mmol)和四三苯基膦鈀(400mg,0.345mmol)，于90℃反應(yīng)2小時(shí)，減壓蒸除溶劑，加入乙酸乙酯(50ml)和水(40ml)，萃取后有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸除溶劑后柱層析得到化合物5-1(1.5g，產(chǎn)率49％)。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：1hnmr(400mhz,dmso)δ7.52–7.40(m,2h),7.28(t,j＝7.9hz,1h),7.12(s,1h),7.03(s,2h),6.91(dd,j＝8.1,2.4hz,1h).
第二步：
將化合物5-1(0.95g,4.29mmol)溶于n,n-二甲基甲酰胺，依次加入5-(叔丁氧羰基氨基)溴戊烷(1.7g,6.43mmol)和碳酸鉀(1.78g,12.9mmol)，在90℃反應(yīng)6小時(shí)，減壓蒸除溶劑，加入乙酸乙酯(40ml)和水(30ml)，萃取后有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸除溶劑后柱層析得到化合物5-2(1.6g，產(chǎn)率89％)。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.52–7.44(m,2h),7.34(t,j＝7.9hz,1h),7.04–6.96(m,2h),5.55(s,2h),4.65(s,1h),4.00(t,j＝6.3hz,2h),3.14(q,j＝6.5hz,2h),1.86–1.74(m,2h),1.61–1.46(m,4h),1.44(s,9h).ms(esi,m/z):431.1[m+na]+。
第三步：
將化合物5-2(1.7g,4mmol)溶于正丁醇，加入環(huán)丙胺(2.77ml,40mmol)和n,n-二異丙基乙胺(3.57ml,20mmol)，在95℃反應(yīng)24小時(shí)，減壓蒸除溶劑，加入乙酸乙酯(40ml)和水(30ml)，萃取后有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸除溶劑后柱層析得到化合物5-3(1.5g，產(chǎn)率78％)。
產(chǎn)物鑒定結(jié)果：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.55–7.44(m,2h),7.33(t,j＝7.9hz,1h),6.96(dd,j＝8.2,2.5hz,1h),6.50(s,1h),5.24(s,1h),4.84(s,2h),4.60(s,1h),4.03(t,j＝6.3hz,2h),3.14(q,j＝6.5hz,2h),2.65–2.52(m,1h),1.86–1.76(m,2h),1.62–1.47(m,4h),1.44(s,9h),0.88–0.78(m,2h),0.64–0.54(m,2h).ms(esi,m/z):450.2[m+na]+。
第四步：
將化合物5-3(2.5g,6mmol)溶于二氯甲烷(25ml)，加入三氟乙酸(5ml)，常溫下反應(yīng)2小時(shí)，減壓蒸除溶劑，得到棕色油狀物。將油狀物用二氯甲烷(40ml)溶解，依次加入n,n-二異丙基乙胺(2.14ml,12mmol)，反-3(3-吡啶基)烯丙酸(893mg,3mmol)、edci(2.3g,12mmol)、dmap(145mg,0.12mmol)，在常溫反應(yīng)8小時(shí)，加入飽和氯化銨(50ml)，用二氯甲烷萃取(50mlx3)，合并有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸除溶劑后柱層析得到化合物2((e)-n-(5-(3-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)戊基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺)(1.7g，產(chǎn)率60％)。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.71(d,j＝2.2hz,1h),8.54(dd,j＝4.9,1.6hz,1h),7.74(d,j＝8.0hz,1h),7.59(d,j＝15.7hz,1h),7.51(s,1h),7.46(d,j＝7.7hz,1h),7.32(t,j＝7.9hz,1h),7.27(t,j＝4.3hz,1h),6.94(dd,j＝8.2,2.6hz,1h),6.55–6.40(m,2h),6.14(t,j＝5.7hz,1h),5.33(s,1h),4.94(s,2h),4.02(t,j＝6.2hz,2h),3.41(q,j＝6.6hz,2h),2.62–2.51(m,1h),1.88–1.75(m,2h),1.70–1.59(m,2h),1.59–1.47(m,2h),0.86–0.76(m,2h),0.61–0.52(m,2h).ms(esi,m/z):458.2[m+h]+。
實(shí)施例6
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(5-(4-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)戊基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
制備方法同實(shí)施例5。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：1hnmr(400mhz,meod)δ8.69(d,j＝2.2hz,1h),8.50(d,j＝4.8hz,1h),8.03(d,j＝8.1hz,1h),7.74(d,j＝8.4hz,2h),7.54(d,j＝15.8hz,1h),7.46(dd,j＝8.0,4.9hz,1h),7.03(d,j＝8.7hz,2h),6.72(d,j＝15.8hz,1h),6.33(s,1h),4.07(t,j＝6.3hz,2h),3.35(t,j＝6.8hz,2h),2.88–2.65(m,1h),1.91–1.79(m,2h),1.74–1.62(m,2h),1.62–1.52(m,2h),0.90–0.80(m,2h),0.63–0.54(m,2h).
實(shí)施例7
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(5-(2-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)戊基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
制備方法同實(shí)施例5。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：ms(esi,m/z):481.2[m+na]+。
實(shí)施例8
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(5-(3-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)-2,4-二氟苯酚基)戊基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
制備方法同實(shí)施例5。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：ms(esi,m/z):495.3[m+h]+。
實(shí)施例9
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(5-(3-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)-2-氯4-氟苯酚基)戊基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
制備方法同實(shí)施例5。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：ms(esi,m/z):510.0[m+na]+。
實(shí)施例10
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(2-(3-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)乙基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
制備方法同實(shí)施例5。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.70(s,1h),8.53(d,j＝4.7hz,1h),7.74(d,j＝8.1hz,1h),7.60(d,j＝15.7hz,1h),7.54(s,1h),7.46(d,j＝7.7hz,1h),7.32(t,j＝7.9hz,1h),7.29–7.21(m,1h),6.95(d,j＝8.0hz,1h),6.74(t,j＝5.7hz,1h),6.52(d,j＝15.7hz,1h),6.46(s,1h),5.45(s,1h),5.14(s,2h),4.17(t,j＝5.0hz,2h),3.81(q,j＝5.3hz,2h),2.68–2.46(m,1h),0.87–0.73(m,2h),0.65–0.45(m,2h).
實(shí)施例11
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(3-(3-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)丙基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
制備方法同實(shí)施例5。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.72(s,1h),8.54(d,j＝4.7hz,1h),7.75(d,j＝6.4hz,1h),7.58(d,j＝15.7hz,1h),7.54(s,1h),7.47(d,j＝7.7hz,1h),7.34(t,j＝7.9hz,1h),7.30–7.23(m,1h),6.97(d,j＝8.1hz,1h),6.57–6.40(m,3h),5.38(s,1h),5.06(s,2h),4.15(t,j＝6.0hz,2h),3.61(q,j＝6.2hz,2h),2.67–2.52(m,1h),2.18–2.05(m,2h),0.90–0.72(m,2h),0.65–0.47(m,2h).ms(esi,m/z):431.2[m+h]+。
實(shí)施例12
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(7-(3-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)庚基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
制備方法同實(shí)施例5。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.73(s,1h),8.55(d,j＝4.8hz,1h),7.76(d,j＝8.0hz,1h),7.60(d,j＝15.7hz,1h),7.51(s,1h),7.47(d,j＝7.7hz,1h),7.33(t,j＝7.9hz,1h),7.30–7.26(m,1h),6.96(dd,j＝8.1,2.5hz,1h),6.49(s,1h),6.46(d,j＝15.8hz,1h),5.88(t,j＝5.6hz,1h),5.26(s,1h),4.85(s,2h),4.02(t,j＝6.5hz,3h),3.38(q,j＝6.7hz,2h),2.65–2.48(m,1h),1.87–1.71(m,2h),1.63–1.53(m,2h),1.53–1.43(m,2h),1.43–1.31(m,4h),0.87–0.75(m,2h),0.64–0.50(m,2h).
實(shí)施例13
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(6-(3-(2-氨基-6-(甲氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
制備方法同實(shí)施例5。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.70(d,j＝2.2hz,1h),8.53(dd,j＝4.9,1.6hz,1h),7.73(dt,j＝8.0,2.0hz,1h),7.58(d,j＝15.7hz,1h),7.46(s,1h),7.41(d,j＝8.0hz,1h),7.33–7.21(m,2h),6.92(dd,j＝8.2,2.6hz,1h),6.48(d,j＝15.7hz,1h),6.21(t,j＝5.6hz,1h),6.15(s,1h),5.15(s,1h),5.12(s,2h),3.99(t,j＝6.3hz,2h),3.37(q,j＝6.7hz,2h),2.92(d,j＝5.0hz,3h),1.83–1.71(m,2h),1.64–1.53(m,2h),1.53–1.44(m,2h),1.44–1.35(m,2h).ms(esi,m/z):470.1[m+na]+。
實(shí)施例14
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(6-(3-(2-氨基-6-(環(huán)丁氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
制備方法同實(shí)施例5。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：1hnmr(400mhz,meod)δ8.66(s,1h),8.49(d,j＝4.9hz,1h),8.02(d,j＝8.0hz,1h),7.52(d,j＝15.9hz,1h),7.48–7.35(m,2h),7.26(s,2h),7.10(d,j＝8.3hz,1h),6.75(d,j＝15.8hz,1h),6.26(s,1h),4.57(s,1h),4.05(t,j＝6.3hz,2h),3.34(t,j＝7.0hz,2h),2.49–2.27(m,2h),2.13–1.98(m,2h),1.87–1.70(m,4h),1.68–1.57(m,2h),1.57–1.49(m,2h),1.49–1.39(m,2h).ms(esi,m/z):510.0[m+na]+。
實(shí)施例15
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(6-(3-(2-氨基-6-(丙烯氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
制備方法同實(shí)施例5。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：ms(esi,m/z):473.3[m+h]+。
實(shí)施例16
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(6-(3-(2-氨基-6-((3-乙炔苯基)氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
制備方法同實(shí)施例5。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：ms(esi,m/z):533.1[m+h]+。
實(shí)施例17
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(6-((3-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)苯基)氨基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
制備方法同實(shí)施例5。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：ms(esi,m/z):489.6[m+h]+。
實(shí)施例18
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(6-((3-(2-氨基-6-(環(huán)丙氨基)嘧啶-4-基)苯基)巰基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
制備方法同實(shí)施例5。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：ms(esi,m/z):489.6[m+h]+。
實(shí)施例19
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(6-((2-氨基-6-(2,3-二氯苯基)嘧啶-4-基)氨基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
第一步：
將2-氨基-4,6-二氯嘧啶(1g,6.1mmol)和2,3-二氯苯硼酸(1.39g,6.7mmol)溶于1,4－二氧六環(huán)(24ml)和水(6ml)中，加入碳酸鈉(1.3g,12.2mmol)和四三苯基膦鈀(176mg,0.15mmol)，于90℃反應(yīng)2小時(shí)，減壓蒸除溶劑，加入乙酸乙酯(30ml)和水(30ml)，萃取后有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸除溶劑后柱層析得到化合物19-1(0.78g，產(chǎn)率46％)。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：1hnmr(400mhz,meod)δ7.64(dd,j＝7.7and1.9hz,1h),7.47–7.37(m,3h),6.85(s,1h).
第二步：
將化合物19-1(117mg,0.43mmol)溶于正丁醇，加入n-(6-氨基己基)氨基甲酸叔丁酯(184mg,0.85mmol)和n,n-二異丙基乙胺(0.15ml,0.85mmol)，在95℃反應(yīng)24小時(shí)，減壓蒸除溶劑，加入乙酸乙酯(20ml)和水(20ml)，萃取后有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸除溶劑后柱層析得到化合物19-2(160mg，產(chǎn)率82％)。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.44(dd,j＝8.0,1.6hz,1h),7.33(dd,j＝7.7,1.6hz,1h),7.21(t,j＝7.8hz,1h),5.90(s,1h),5.18(s,1h),5.09(s,2h),4.68(s,1h),3.21(d,j＝8.6hz,2h),3.06(d,j＝6.8hz,2h),1.56–1.50(m,2h),1.41(s,11h),1.37–1.26(m,4h).ms(esi,m/z):477.1[m+na]+。
第三步：
將化合物19-2(300mg,0.66mmol)溶于二氯甲烷(5ml)，加入三氟乙酸(1ml)，常溫下反應(yīng)2小時(shí)，減壓蒸除溶劑，得到棕色油狀物。將油狀物用二氯甲烷(5ml)溶解，依次加入n,n-二異丙基乙胺(0.6ml,3.3mmol)，反-3(3-吡啶基)烯丙酸(98mg,0.66mmol)、edci(253mg,1.32mmol)、dmap(16mg,0.132mmol)，在常溫反應(yīng)8小時(shí)，加入飽和氯化銨(50ml)，用二氯甲烷萃取(20mlx3)，合并有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸除溶劑后柱層析得到(e)-n-(6-((2-氨基-6-(2,3-二氯苯基)嘧啶-4-基)氨基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺(245mg，產(chǎn)率76％)。產(chǎn)物鑒定結(jié)果：1hnmr(400mhz,meod)δ8.70(d,j＝2.2hz,1h),8.51(dd,j＝4.8,1.5hz,1h),8.04(d,j＝8.2hz,1h),7.63(t,j＝4.8hz,1h),7.55(d,j＝15.9hz,1h),7.47(dd,j＝8.0,4.9hz,1h),7.39(s,1h),7.38(s,1h),6.73(d,j＝15.8hz,1h),5.97(s,1h),3.41(s,2h),3.36–3.31(m,2h),1.72–1.53(m,4h),1.51–1.38(m,4h).ms(esi,m/z):485.1[m+h]+。
實(shí)施例20
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(5-((2-氨基-6-苯基嘧啶-4-基)氨基)戊基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
制備方法同實(shí)施例19，產(chǎn)物鑒定結(jié)果：ms(esi,m/z):425.1[m+na]+。
實(shí)施例21
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(6-((2-氨基-6-(3-氨基苯基)嘧啶-4-基)氨基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
制備方法同實(shí)施例19，產(chǎn)物鑒定結(jié)果：ms(esi,m/z):432.1[m+na]+。
實(shí)施例22
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(6-((2-氨基-6-(2-甲基苯基)嘧啶-4-基)氨基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
制備方法同實(shí)施例19，產(chǎn)物鑒定結(jié)果：ms(esi,m/z):453.2[m+na]+。
實(shí)施例23
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(6-((2-氨基-6-(4-氰基苯基)嘧啶-4-基)氨基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
制備方法同實(shí)施例19，產(chǎn)物鑒定結(jié)果：ms(esi,m/z):464.4[m+na]+。
實(shí)施例24
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(6-((2-氨基-6-(3-(吡咯-1-基)苯基)嘧啶-4-基)氨基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
制備方法同實(shí)施例19，產(chǎn)物鑒定結(jié)果：ms(esi,m/z):486.3[m+h]+。
實(shí)施例25
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(6-((2-氨基-6-(2-三氟甲基苯基)嘧啶-4-基)氨基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
制備方法同實(shí)施例19，產(chǎn)物鑒定結(jié)果：ms(esi,m/z):485.2[m+h]+。
實(shí)施例26
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(6-((2-氨基-6-(3-乙炔基苯基)嘧啶-4-基)氨基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
制備方法同實(shí)施例19，產(chǎn)物鑒定結(jié)果：ms(esi,m/z):441.1[m+h]+。
實(shí)施例27
本發(fā)明所述嘧啶類化合物之一(e)-n-(6-(3-(2-氨基-6-((5-((e)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺基)戊基)氨基)嘧啶-4-基)苯酚基)己基)-3-(吡啶-3-基)丙烯酰胺的制備：
采用化合物5-2，制備方法同實(shí)施例19，產(chǎn)物鑒定結(jié)果：1hnmr(400mhz,meod)δ8.67(s,2h),8.49(d,j＝4.8hz,2h),8.00(dd,j＝8.0,2.3hz,2h),7.52(dd,j＝15.8,2.4hz,2h),7.44(dd,j＝8.0,4.9hz,2h),7.38–7.22(m,3h),7.05–6.95(m,1h),6.72(d,j＝15.9hz,2h),6.23(s,1h),4.02(t,j＝6.4hz,2h),3.38(t,j＝7.0hz,2h),1.85–1.71(m,2h),1.70–1.36(m,13h).ms(esi,m/z):649.2[m+h]+。
實(shí)施例28
抑制8-羥基鳥嘌呤核苷酸酶(humanmutthomologuemth1；8-oxoguaninenucleosidetriphosphatase)的篩選實(shí)驗(yàn)：
化合物生化活性測(cè)定是用mth1酶來(lái)測(cè)試。主要是根據(jù)化合物抑制mth1酶的作用程度來(lái)確定其活性的。其測(cè)試原理為：用熒光標(biāo)記的mth1酶和化合物作用之后。熒光標(biāo)記底物被胰蛋白酶裂解后，釋放出熒光物質(zhì)，該熒光物質(zhì)在630nm光的激發(fā)下產(chǎn)生發(fā)射光。根據(jù)激發(fā)光的強(qiáng)度來(lái)計(jì)算酶的活性變化。
具體步驟：
1.化合物在96孔板(最好是尖底板)上用dmso稀釋，起始濃度為10mm，3倍梯度稀釋，11個(gè)濃度梯度(最后一個(gè)濃度為0mm，作為max對(duì)照)；
2.取1ul的化合物或者dmso加到96孔檢測(cè)板中；
3.每個(gè)孔中加入50ul酶混合溶液或者1×buffer(min對(duì)照)，離心混勻；
4.然后加入50ul的底物混合溶液，離心混勻，室溫反應(yīng)1h；
5.最后加入25ul的孔雀綠檢測(cè)溶液，離心混勻，反應(yīng)15min，酶標(biāo)儀630nm吸光值讀數(shù)；
6.化合物的終濃度為100um起始，第1列的酶溶液用1×buffer代替作為negativecontrol(min孔對(duì)照)，第2-11列為化合物的濃度梯度，第12列不加抑制劑，作為positivecontrol(max孔對(duì)照)；
7.用prim數(shù)據(jù)分析計(jì)算機(jī)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。化合物的活性測(cè)試結(jié)果如表1所示：
表1：mth1酶活性測(cè)試結(jié)果
由上述活性實(shí)驗(yàn)可知，本發(fā)明的嘧啶類化合物對(duì)8-羥基鳥嘌呤核苷酸酶(humanmutthomologuemth1；8-oxoguaninenucleosidetriphosphatase)具有很好的抑制活性，其中，實(shí)施實(shí)例1、2、5、8、10、11、14、16、17、18、19、21、22、23、24、25、26、和實(shí)施實(shí)例27的ic50值比陽(yáng)性對(duì)照th588更高，尤其是實(shí)施實(shí)例21的化合物對(duì)8-羥基鳥嘌呤核苷酸酶的ic50值最高，達(dá)到0.95nm。因此，本發(fā)明化合物可用于8-羥基鳥嘌呤核苷酸酶活性異常而導(dǎo)致的一系列疾病，如腫瘤。
實(shí)施例29
體外抑制腫瘤細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)：
化合物癌細(xì)胞抑制活性數(shù)據(jù)用mtt方法來(lái)檢測(cè)，mtt法又稱mtt比色法，是一種檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法。mtt(黃色的噻唑蘭)可透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，活細(xì)胞線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性mtt還原為難溶于水的藍(lán)紫色的針狀formazan結(jié)晶并沉積在細(xì)胞中，結(jié)晶能被二甲基亞砜(dmso)溶解，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm/570nm波長(zhǎng)處檢測(cè)其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。所使用的癌細(xì)胞系mcf-7(人乳腺癌細(xì)胞)、k562(人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞)、molt-4(人急性t淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞)、hela(子宮頸癌細(xì)胞)。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：
(1)收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，在96孔板中每孔加入100ul細(xì)胞懸液；每孔細(xì)胞數(shù)量約為7000個(gè)，在5％co2，37℃孵育過(guò)夜至細(xì)胞完全貼壁；
(2)設(shè)置藥物濃度梯度，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，將藥物稀釋到對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基中至所需終濃度，吸出96孔板中原有培養(yǎng)基，加入配好的含所需終濃度藥物的培養(yǎng)基100ul，在5％co2，37℃孵育；并同時(shí)設(shè)置空白組(只含100ul培養(yǎng)基，不含細(xì)胞，后續(xù)處理與其他各孔相同)與對(duì)照組(含有細(xì)胞與培養(yǎng)基)；
(3)藥物處理至44小時(shí)時(shí)每孔加入10ulmtt溶液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h(藥物處理細(xì)胞共48小時(shí))；
(4)吸干凈孔內(nèi)培養(yǎng)液(如細(xì)胞出現(xiàn)懸浮，則先2500rpm離心5min再吸出培養(yǎng)基)。每孔加入150ul二甲基亞砜，振蕩至結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀上檢測(cè)od490nm處各孔的吸光值；
(5)計(jì)算抑制率：抑制率＝1-(加藥組od值-空白組od值)/(對(duì)照組od值-空白組od值)＝(對(duì)照組od值-加藥組od值)/(對(duì)照組od值-空白組的od值)；
(6)按上述實(shí)驗(yàn)步驟重復(fù)三次，得出三次抑制率的平均值，利用ic50計(jì)算器算出藥物的ic50值。
按照mtt法對(duì)k562、mcf-7、molt-4、hela癌細(xì)胞系的半數(shù)致死量測(cè)試結(jié)果如表2所示：
表2：抗腫瘤活性測(cè)試結(jié)果
由表2可以看出，大部分化合物對(duì)k562(人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞)、mcf-7(人乳腺癌細(xì)胞)、molt-4(人急性t淋巴母細(xì)胞白血病細(xì)胞)、hela(子宮頸癌細(xì)胞)都具有優(yōu)秀的抗腫瘤活性，且大都高出陽(yáng)性對(duì)照th588三個(gè)數(shù)量級(jí)，這些化合物有望被開發(fā)成為新的抗腫瘤藥物。
上列詳細(xì)說(shuō)明是針對(duì)本發(fā)明可行實(shí)施例的具體說(shuō)明，該實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明所為的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本案的專利保護(hù)范圍中。