一種從富硒茶葉片中提取硒蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從富硒茶葉片中提取硒蛋白的方法。本發(fā)明以富硒茶葉片為原料，將富硒茶葉片烘干、粉碎過篩，加入乙醇，在60℃下水浴加熱30min，離心，所得沉淀重復上述步驟，然后烘干粉碎過篩；所得沉淀加入蒸餾水，在低溫冰箱中冰凍3～5h，50～70℃下水浴加熱30min，然后在低溫冰箱中冰凍3～5h，在50～70℃下水浴加熱30min，如此重復三次；加入NaOH溶液，在70～90℃下水浴加熱3～4h，3500rpm離心10min，沉淀重復上述過程一次，上清液調(diào)節(jié)pH至2.5～3.5，靜置，離心，干燥得粗硒蛋白。本發(fā)明制備工藝簡單，操作簡便易行，環(huán)境友好，所得產(chǎn)品硒蛋白含量較高，是有機硒可靠的來源，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種從富硒茶葉片中提取硒蛋白的方法

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于茶葉深加工【技術(shù)領域】，特別涉及一種從富硒茶葉片中提取硒蛋白的方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 硒是人體必需的微量元素之一，現(xiàn)代醫(yī)學研究證明，硒對癌癥、心腦血管疾病、克 山病、大骨節(jié)病等疾病均有防治作用。由于硒在地球上分布不均，目前已知有40多個國家 和地區(qū)不同程度缺硒，我國也有2/3以上地區(qū)缺硒，涉及人口達7億多。直接利用無機硒鹽 補硒具有一定的毒性，通過食物鏈補硒是解決缺硒問題的重要途徑，但天然食物中的硒含 量普遍較低。紫陽富硒茶是天然的補硒飲品，紫陽當?shù)鼐用耧嫺晃铓v史可追朔到唐朝，說 明富硒茶對人體是安全的。但是研究表明富硒茶經(jīng)過兩次沖泡，僅有7%?13%的硒溶解 于水中而被人體吸收利用，與國際硒學會推薦人體日攝入量為60?400 μ g相差甚遠，據(jù)中 國預防醫(yī)科院與第四軍醫(yī)大的檢測推算，欲滿足人體對硒的需求每人每天需飲300g富硒 茶干品，而且富硒茶中有機硒含量變動較大，所以通過沖飲紫陽茶難以滿足缺硒人群定量 補硒需求。因此有必要開發(fā)一種有機硒硒含量更高，含硒量穩(wěn)定的富硒產(chǎn)品以滿足廣大人 群的補硒需求。
[0003] 茶葉中有機砸占砸總量的80 %以上，王要以砸蛋白形態(tài)存在（占有機砸的 79. 56?88. 70% )。茶葉干重的15?30%為茶葉蛋白，它是由單純蛋白和結(jié)合蛋白兩大 類組成。單純蛋白主要由谷蛋白（溶于稀酸、稀堿溶液，受熱不凝固，占總蛋白82. 05%)、 醇溶蛋白（溶于稀酸稀堿溶液中以及70?80%的酒精溶液中，占總蛋白13. 61% )、清蛋白 (溶于水和稀鹽溶液，占總蛋白3. 47% )和球蛋白（溶于稀鹽溶液，占總蛋白〈1 % )組成。 結(jié)合蛋白則由核蛋白、糖蛋白、脂蛋白等組成，數(shù)量少，易溶于稀酸。
[0004] 目前國內(nèi)對茶葉蛋白提取方法研究較多的為堿法提取、酶法提取、鹽法提取[3]、 超生輔助提取和反復凍融法輔助提取。
[0005] 堿液可以破壞茶蛋白之間的某些連接集團，提高茶蛋白的溶解度，實現(xiàn)茶蛋白有 效分離的目的，一般選擇NaOH為堿液。它因工藝簡單、提取率較高、處理量大、易于實現(xiàn)工 廠自動化等特點而被廣泛應用，但是對氨基酸有破壞作用，抽提液固比大，等電沉淀要消耗 大量酸、脫鹽純化難度大、提取時需要消耗大量的堿和水等缺點。
[0006] 近年來，酶法提取植物蛋白的研究較為活躍。常用的酶類有蛋白酶、纖維素酶和果 膠酶等。蛋白酶是在特定的條件下（一般是最適溫度和PH值），將蛋白質(zhì)逐步降解，變成分 子量較小的短肽，從而使其溶解性增強，達到分離提取的效果。纖維素酶和果膠酶則是分別 分解細胞壁中的纖維素和果膠，從而破壞細胞壁，使細胞吸水破裂，提高提取物和提取液的 接觸機會，從而實現(xiàn)提高提取率的目的。酶法提取具有反應條件溫和，反應液固比小，耗能 低，營養(yǎng)物質(zhì)基本不被破壞，提取率高等優(yōu)點。但是目前酶法提取的工藝條件并不成熟，而 且存在對酶活力的要求比較高，酶試劑較為昂貴，不適合規(guī)?；a(chǎn)。
[0007] 超聲輔助提取是利用超聲波的機械作用、空化作用、熱效應和化學效應，破壞細胞 壁，加速目標物的擴散，實現(xiàn)提高提取率的目的。超聲輔助提取具有提取時間短、提取效率 較高、污染少等優(yōu)點，但是根據(jù)提取物的不同有時也會出現(xiàn)與普通法相比提取效果不明顯 的結(jié)果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為解決現(xiàn)有技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種從富硒茶葉片中提取硒蛋白的方法，本 發(fā)明制備工藝簡單，操作簡便易行，環(huán)境友好，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0009] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0010] 一種從富硒茶葉片中提取硒蛋白的方法包括以下步驟：
[0011] ⑴將富硒茶葉片粉碎過80?100目篩得到富硒茶粉，富硒茶粉去除茶多酚后，烘 干、再粉碎、再過80?100目篩，得物質(zhì)A ;
[0012] (2)向步驟⑴所得物質(zhì)A中按照固液比Ig :(5?10)mL加入蒸餾水溶解， 在-30?-18°C中冰凍3?5h，50?70°C下水浴加熱20?40min，重復多次，得到溶液A ;
[0013] (3)按照Ig溶液A加入30?70mL NaOH溶液的比例，向步驟⑵所得溶液A中加 入NaOH溶液，在70?90°C下水浴加熱3?4h，離心分離上清液；
[0014] (4)步驟（3)中離心所得上清液調(diào)節(jié)pH值至2. 5?3. 5,靜置，再離心，得沉淀，沉 淀烘干得到粗硒蛋白。
[0015] 作為本發(fā)明的進一步改進，步驟（1)中去除茶多酚步驟具體操作為：向富硒茶粉 中按照固液比Ig : (20?30)mL加入乙醇，在60°C水浴加熱30min，離心，分離得沉淀，所得 沉淀重復以上步驟。
[0016] 作為本發(fā)明的進一步改進,所述乙醇質(zhì)量濃度為40?60%。
[0017] 作為本發(fā)明的進一步改進，步驟（3)中NaOH溶液濃度為0· 05?0· 15mol/L。
[0018] 作為本發(fā)明的進一步改進，步驟（3)所述的pH值用0· lmol/L HCl調(diào)節(jié)。
[0019] 作為本發(fā)明的進一步改進，所述離心步驟的離心轉(zhuǎn)速為3500rpm，時間為lOmin。
[0020] 相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0021] 本發(fā)明以富硒茶葉片為原料，先去除茶多酚，以反復凍融細胞方式，達到破碎細胞 的效果，以堿提方法提取蛋白質(zhì)，以PH值為2. 5?3. 5來沉淀硒蛋白，制得的硒蛋白粉呈淺 黑色、純度達到75%以上。其中反復凍融法輔助提取是利用低溫冰箱（-30?-18°C )把提 取液冰凍，然后加熱溶化，反復三次，在凍融過程中實現(xiàn)細胞壁破碎的目的，從而提高蛋白 質(zhì)的提取率。
[0022] 進一步，去除茶多酚采用質(zhì)量濃度為40?60 %的乙醇，去除完全，對后期的提取 影響小。
[0023] 本發(fā)明制得的硒蛋白，有機硒含量達到4. 000yg/g以上，可以作為安全、有效補 硒的原料進一步加工成各種補硒功能產(chǎn)品。本發(fā)明制備工藝簡單，操作簡便易行，環(huán)境友 好，無污染。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1為硒標準曲線圖；
[0025] 圖2為不同樣品中硒含量對比圖。

【具體實施方式】
[0026] 本發(fā)明以富硒茶葉片為原料，用40?60%乙醇去除茶多酚，以反復凍融細胞方 式，達到破碎細胞的效果，以堿提方法提取蛋白質(zhì)，以PH2. 5?3. 5來沉淀硒蛋白，本發(fā)明內(nèi) 容包括以下步驟：
[0027] (1)將富硒茶葉片粉碎過80?100目篩，按照1 : (20?30) (g:mL)加入40?60% 乙醇，在60°C下水浴加熱30min，3500rpm離心lOmin，所得沉淀重復步驟（1)后烘干粉碎過 80?100目篩；
[0028] (2)步驟⑴所得沉淀按照料液比1 :(5?10) (g:mL)加入蒸餾水，在低溫 冰箱（-30?-18 °C )中冰凍3?5h，50?70°C下水浴加熱30min，然后在低溫冰箱 (-30?-18°C )中冰凍3?5h，在50?70°C下水浴加熱30min，如此重復三次；
[0029] (3)向步驟（2)中按照料液比 1 : (30 ?70) (g:mL)加入 0· 05 ?0· 15mol/L NaOH 溶液，在70?90°C下水浴加熱3?4h，3500rpm離心IOmin ;
[0030] (4)步驟（3)中離心所得上清液用O.lmol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2. 5?3. 5,靜置 lOmin，3500rpm離心IOmin,所得沉淀烘干得到粗硒蛋白。
[0031] 實施例1
[0032] -種從富硒茶葉片中提取硒蛋白的方法，包括以下步驟：
[0033] (1)將富硒茶葉片粉碎過100目篩，按照I :25(g:mL)加入60%乙醇，在60°C下水 浴加熱30min，3500rpm離心IOmin,所得沉淀重復步驟（1)后烘干粉碎過100目篩；
[0034] (2)步驟（1)所得沉淀按照料液比I :7(g:mL)加入蒸餾水，在低溫冰箱中冰凍4h， 60°C下水浴加熱30min，然后在低溫冰箱中冰凍4h，在60°C下水浴加熱30min，如此重復三 次；
[0035] (3)向步驟（2)中按照料液比I :50(g:mL)加入0· 10mol/L NaOH溶液，在70°C下 水浴加熱3. 5h，3500rpm離心IOmin ;
[0036] (4)步驟（3)中離心所得上清液用0· lmol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3. 5,靜置10min， 3500rpm離心10min，所得沉淀烘干得到粗硒蛋白。
[0037] 實施例2
[0038] -種從富硒茶葉片中提取硒蛋白的方法，包括以下步驟：
[0039] (1)將富硒茶葉片粉碎過80目篩，按照I :20(g:mL)加入60%乙醇，在60°C下水 浴加熱30min，3500rpm離心IOmin,所得沉淀重復步驟（1)后烘干粉碎過80目篩；
[0040] (2)步驟（1)所得沉淀按照料液比I :5(g:mL)加入蒸餾水，在低溫冰箱中冰凍3h， 50°C下水浴加熱30min，然后在低溫冰箱中冰凍3h，在50°C下水浴加熱30min，如此重復三 次；
[0041] (3)向步驟（2)中按照料液比I :50(g:mL)加入0· 10mol/L NaOH溶液，在80°C下 水浴加熱4h，3500rpm離心IOmin ;
[0042] (4)步驟（3)中離心所得上清液用0· lmol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2. 5,靜置10min， 3500rpm離心10min，所得沉淀烘干得到粗硒蛋白。
[0043] 實施例3
[0044] 一種從富硒茶葉片中提取硒蛋白的方法，包括以下步驟：
[0045] (1)將富硒茶葉片粉碎過90目篩，按照I :30(g:mL)加入50%乙醇，在60°C下水 浴加熱30min，3500rpm離心IOmin,所得沉淀重復步驟（1)后烘干粉碎過90目篩；
[0046] (2)步驟（1)所得沉淀按照料液比I :10(g:mL)加入蒸餾水，在低溫冰箱中冰凍 5h，70°C下水浴加熱20min，然后在低溫冰箱中冰凍5h，在70°C下水浴加熱30min，如此重復 三次；
[0047] (3)向步驟（2)中按照料液比I :70(g:mL)加入0· 15mol/L NaOH溶液，在80°C下 水浴加熱4h，3500rpm離心IOmin ;
[0048] (4)步驟（3)中離心所得上清液用0· lmol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3. 0,靜置lOmin， 3500rpm離心lOmin，所得沉淀烘干得到粗硒蛋白。
[0049] 實施例4
[0050] -種從富硒茶葉片中提取硒蛋白的方法，包括以下步驟：
[0051] (1)將富硒茶葉片粉碎過100目篩，按照I :25(g:mL)加入40%乙醇，在60°C下水 浴加熱30min，3500rpm離心IOmin,所得沉淀重復步驟（1)后烘干粉碎過100目篩；
[0052] (2)步驟（1)所得沉淀按照料液比I :10(g:mL)加入蒸餾水，在低溫冰箱中冰凍 4h，60°C下水浴加熱40min，然后在低溫冰箱中冰凍4h，在60°C下水浴加熱30min，如此重復 三次；
[0053] (3)向步驟（2)中按照料液比I :60(g:mL)加入0· 10mol/L NaOH溶液，在90°C下 水浴加熱3h，3500rpm離心IOmin ;
[0054] (4)步驟（3)中離心所得上清液用0· lmol/L HCl調(diào)節(jié)pH至2. 5,靜置10min， 3500rpm離心10min，所得沉淀烘干得到粗硒蛋白。
[0055] 實施例5
[0056] -種從富硒茶葉片中提取硒蛋白的方法，包括以下步驟：
[0057] (1)將富硒茶葉片粉碎過100目篩，按照I :25(g:mL)加入40%乙醇，在60°C下水 浴加熱30min，3500rpm離心IOmin,所得沉淀重復步驟（1)后烘干粉碎過100目篩；
[0058] (2)步驟（1)所得沉淀按照料液比I :10(g:mL)加入蒸餾水，在低溫冰箱中冰凍 5h，70°C下水浴加熱30min，然后在低溫冰箱中冰凍5h，在70°C下水浴加熱30min，如此重復 三次；
[0059] (3)向步驟（2)中按照料液比I :30(g:mL)加入0.05mol/L NaOH溶液，在90°C下 水浴加熱4h，3500rpm離心IOmin ;
[0060] (4)步驟（3)中離心所得上清液用0· lmol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3. 0,靜置10min， 3500rpm離心10min，所得沉淀烘干得到粗硒蛋白。
[0061] 本發(fā)明所用原料為富硒茶葉片，特別是老葉效果更好。
[0062] 測試1 :硒含量檢測
[0063] 1)試驗材料
[0064] 富硒茶粉、未純化硒蛋白（用凍融法提取蛋白質(zhì)）、純化硒蛋白、粗多酚、二次提取 蛋白后茶渣
[0065] 2)試驗方法：利用微波消解-紫外分光光度法測定硒含量
[0066] 3)結(jié)果與分析
[0067] 3. 1硒標準曲線的繪制
[0068] 由圖1可知，硒含量在1-5 μ g時具有線性相關性，其線性方程為y = 0· 0191χ-0· 003,相關系數(shù) R2 = 0· 9994。
[0069] 3. 2各種樣品硒含量檢測
[0070] 由圖2和表1可知，在陜西紫陽縣"硒谷"采集的富硒茶含硒量為2. 110μ g/g ;粗 蛋白質(zhì)中硒含量為4. 002 μ g/g，占樣品總硒的71. 1%，并且經(jīng)純化后蛋白質(zhì)中硒含量可達 5. 174 μ g/g ;二次提取蛋白后茶渣中硒含量為0. 930 μ g/g，這可能是因為茶渣中還存在硒 核酸、部分硒蛋白、硒多糖以及無機態(tài)游離硒；粗多酚中硒含量為〇. 〇53μ g/g，這可能是由 于粗多酚中含有部分硒多糖而使多酚中存在硒。
[0071] 表 1

【權(quán)利要求】
1. 一種從富硒茶葉片中提取硒蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1)將富硒茶葉片粉碎過80?100目篩得到富硒茶粉，富硒茶粉去除茶多酚后，烘干、 再粉碎、再過80?100目篩，得物質(zhì)A ; ⑵向步驟⑴所得物質(zhì)A中按照固液比lg :(5?10)mL加入蒸餾水溶解， 在-30?-18°C中冰凍3?5h，50?70°C下水浴加熱20?40min，重復多次，得到溶液A ; (3) 按照lg溶液A加入30?70mL NaOH溶液的比例，向步驟⑵所得溶液A中加入 NaOH溶液，在70?90°C下水浴加熱3?4h，離心分離上清液； (4) 步驟（3)中離心所得上清液調(diào)節(jié)pH值至2. 5?3. 5,靜置，再離心，得沉淀，沉淀烘 干得到粗硒蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從富硒茶葉片中提取硒蛋白的方法，其特征在于，步驟 (1)中去除茶多酚步驟具體操作為：向富硒茶粉中按照固液比lg:(20?30)mL加入乙醇， 在60°C水浴加熱30min，離心，分離得沉淀，所得沉淀重復以上步驟。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種從富硒茶葉片中提取硒蛋白的方法，其特征在于，所述 乙醇質(zhì)量濃度為40?60%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從富硒茶葉片中提取硒蛋白的方法，其特征在于，步驟 (3)中NaOH溶液濃度為0? 05?0? 15mol/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從富硒茶葉片中提取硒蛋白的方法，其特征在于，步驟 ⑶所述的pH值用0? lmol/L HC1調(diào)節(jié)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種從富硒茶葉片中提取硒蛋白的方法，其特征在于，所 述離心步驟的離心轉(zhuǎn)速為3500rpm，時間為lOmin。
【文檔編號】C07K1/14GK104402966SQ201410650029
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】董文賓, 王洪言, 王珺 申請人:陜西科技大學