一種硅膠柱色譜分離純化溶血磷脂酰乙醇胺的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用硅膠色譜柱分離純化溶血磷脂酰乙醇胺的方法，屬于分離純化領(lǐng)域。本發(fā)明是以含溶血磷脂酰乙醇胺純度為30％以上的溶血磷脂混合物為原料，以硅膠為固定相，氯仿與甲醇體積比1:2-3:1的溶液作為洗脫劑，收集洗脫有溶血磷脂酰乙醇胺的級(jí)分，去除溶劑，干燥得到高純度溶血磷脂酰乙醇胺產(chǎn)品。本發(fā)明提供的硅膠柱層析法分離純化LPE的方法，工藝簡(jiǎn)單，得到的溶血磷脂酰乙醇胺產(chǎn)品純度為98％以上，能夠?yàn)槲磥?lái)商業(yè)生產(chǎn)高純度LPE提供技術(shù)支持。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種硅膠柱色譜分離純化溶血磷脂酰乙醇胺的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種硅膠柱色譜分離純化溶血磷脂酰乙醇胺的方法，屬于分離純化【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]溶血磷脂酰乙醇胺(Lysophosphatidylethanolamine,LPE)是磷脂酰乙醇胺(PE)在磷脂酶Al的作用下水解失去一分子脂肪酸而生成的產(chǎn)物，其天然存在于動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞中。與PE相比，LPE保留了 PE的兩性分子結(jié)構(gòu)，減少了疏水基團(tuán)和易氧化的不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)，從而大大提高了 LPE的親水性和乳化穩(wěn)定性，使其在高溫、低pH、高離子濃度環(huán)境下都具有優(yōu)良的乳化性和穩(wěn)定性。LPE在食品、化妝品、醫(yī)藥行業(yè)等方面都有很大的應(yīng)用前景，但是由于天然的LPE含量比較少，尚無(wú)高純LPE，所以建立制備高純度的LPE純化技術(shù)具有重要的醫(yī)藥、社會(huì)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
[0003]目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究LPE分離純化的方法主要有:溶劑處理法、薄層色譜法、超臨界流體萃取法等。溶劑處理法是用特定有機(jī)溶劑和水的混合物處理含LPE的溶血磷脂混合物，在_5°C?6°C的低溫范圍下使混合物結(jié)晶，經(jīng)離心去除雜質(zhì)后過(guò)濾上清液，干燥可得到高純度的LPE。這種方法繁瑣，過(guò)程中兩個(gè)重要的工藝參數(shù)，溶劑分級(jí)分離的反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH不易控制，重復(fù)多組試驗(yàn)才能得到比較理想的分離效果。薄層色譜法，簡(jiǎn)稱(chēng)TLC，是一種方便、快捷、直觀經(jīng)典的分離檢測(cè)方法，安永祥等采用氯仿-無(wú)水甲醇-三乙胺-水(10:10:5:3)為展開(kāi)劑，用溴百里酚藍(lán)染液為顯色劑，通過(guò)將樣品與各標(biāo)準(zhǔn)品在薄層板上的遷移值對(duì)照比較，可以很好的分離出LPE，但是這種方法對(duì)LPE的工業(yè)化制備有一定局限性，同時(shí)試驗(yàn)干擾因素多，展開(kāi)劑存在安全性問(wèn)題。超臨界流體萃取對(duì)設(shè)備要求比較高，生產(chǎn)成本大，而且所提磷脂仍需進(jìn)一步分離，純度不高，一般用于粗提。而由于溶血磷脂酰膽堿(Lysophosphatidylcholine, LPC)和LPE遷移率比較相近,娃膠柱色譜純化方法也很難分離出LPE。目前，也沒(méi)有關(guān)于硅膠柱色譜純化制備高純LPE及工藝參數(shù)優(yōu)化的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為克服目前LPE分離純化中存在的純度不高、設(shè)備要求嚴(yán)格、成本大、環(huán)境污染等一系列的問(wèn)題，本發(fā)明提供的硅膠柱層析法分離純化LPE的方法，工藝簡(jiǎn)單，所用原料中幾乎不含LPC，避免了 LPC和LPE難分離的問(wèn)題，且吸附與解析過(guò)程的重復(fù)性好，產(chǎn)品純度高，能夠?yàn)槲磥?lái)商業(yè)生產(chǎn)高純度LPE提供技術(shù)支持。
[0005]本發(fā)明提供的硅膠柱色譜柱分離純化溶血磷脂酰乙醇胺的方法，是以含溶血磷脂酰乙醇胺(純度為30-99%)的溶血磷脂混合物為原料，以硅膠為固定相，氯仿與甲醇體積比為1:2?3:1的混合溶液為洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫有溶血磷脂酰乙醇胺的級(jí)分，去除溶劑，干燥得到溶血磷脂酰乙醇胺產(chǎn)品。
[0006]所述方法主要包括以下步驟:
[0007](I)稱(chēng)取含溶血磷脂酰乙醇胺(純度為30-99% )的溶血磷脂混合物為原料，即上樣樣品；
[0008](2)取與上樣樣品重量比10:1-50:1的硅膠，加入氯仿:甲醇=1:2?3:1 (v/v)的混合溶劑中，攪拌成漿狀，使用常規(guī)方法裝柱；
[0009](3)將步驟I中的樣品加入步驟2的硅膠柱中；
[0010](4)待樣品上液面離開(kāi)柱層液面前，用氯仿:甲醇=1:2?3:l(v/v)的洗脫液進(jìn)行洗脫，同時(shí)控制流速1-3.5mL/min ；
[0011](5)收集洗脫有溶血磷脂酰乙醇胺的級(jí)分，去除溶劑，干燥，得到溶血磷脂酰乙醇胺產(chǎn)品。
[0012]所述步驟I中的上樣樣品,溶于氯仿:甲醇=1:2?3:l(v/v)的溶液中，配制成濃度為10-50mg/mL的溶液。
[0013]所述步驟I中的溶血磷脂混合物原料，是以大豆粉末磷脂中的醇不溶物作為粗磷脂酰乙醇胺(PE)原料，使用硅膠色譜分離粗PE原料得到純度在70%以上的磷脂酰乙醇胺混合物，再將該磷脂酰乙醇胺混合物用磷脂酶Al酶解，即得到純度在30%以上的溶血磷脂混合物原料。
[0014]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟2中的硅膠的規(guī)格為100-200目。
[0015]在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，所述步驟2中的硅膠，使用前經(jīng)預(yù)處理，預(yù)處理方法為:取適量硅膠置于120°C烘箱中活化40-60min。
[0016]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟2中的裝柱所用的硅膠柱長(zhǎng)徑比為18:1的娃膠柱。
[0017]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟2中上樣樣品量與硅膠的質(zhì)量比為1:40-1:30。
[0018]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述步驟4中洗脫液氯仿和甲醇的體積比為1:1-2:1。
[0019]在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述含溶血磷脂酰乙醇胺的溶血磷脂混合物原料中溶血磷脂酰乙醇胺的純度為30-60%。
[0020]本發(fā)明提供的硅膠柱層析法分離純化LPE的方法，工藝簡(jiǎn)單，得到的溶血磷脂酰乙醇胺產(chǎn)品純度為98%以上，能夠?yàn)槲磥?lái)商業(yè)生產(chǎn)高純度LPE提供技術(shù)支持。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1是溶血磷脂酰乙醇胺的分子式；
[0022]圖2是原料樣品的HPLC-ELSD圖；
[0023]圖3 是所得 LPE 的 HPLC-ELSD 圖；
[0024]圖4是不同固定相種類(lèi)對(duì)LPE洗脫效果的影響；
[0025]圖5是不同洗脫液比例對(duì)LPE產(chǎn)品純度的影響，其中(a)為氯仿:甲醇=3:1，(b)為氯仿:甲醇=2:1，(c)氯仿:甲醇=1:1，(d)氯仿:甲醇=1:2。

【具體實(shí)施方式】
[0026]溶血磷脂酰乙醇胺的濃度檢測(cè)方法:取待測(cè)樣品溶于2mL氯仿:甲醇(2:1，V:V)中，經(jīng)渦旋振蕩器混勻，在10000r/min下離心5min，然后取上清液存放在_20°C下的冰箱中，待HPLC-ELSD分析檢測(cè)。具體色譜條件為:硅膠柱，ZORBAXRX-SIL (4.6 X 250mm, 5 μ m)，柱溫35°C，漂移管溫度30°C;進(jìn)樣量20 μ L ;檢測(cè)方法:采用二元梯度洗脫，流動(dòng)相A (甲醇:/JC= 8:1, V:V)，流動(dòng)相B(甲醇)，流速1.0mL/min汸相的梯度，開(kāi)始1min，以40%梯度增加到60%，保持5min，之后3min，以60%梯度降低到40%。
[0027]實(shí)施例1
[0028]用適量無(wú)水乙醇于20°C下浸提食品級(jí)大豆粉末磷脂(磷脂含量為96%，主要成分有30%磷脂酰膽堿(PC)、25%磷脂酰乙醇胺(PE)、25%磷脂酰肌醇(PI)、0.5%溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)，購(gòu)自天津市博帥工貿(mào)有限公司)數(shù)次至浸提液為淺黃色，棄去上清液，將浸提后醇不溶物經(jīng)真空濃縮后得粗PE備用。然后以硅膠為吸附介質(zhì)，粗PE為原料采用氯仿:甲醇(2:1，v:v)進(jìn)行等度洗脫，收集含PE的淋洗液，經(jīng)真空濃縮干燥后得到高純PE (磷脂酰乙醇胺純度為70%以上的混合物)。準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5g的高純PE于50mL圓底燒瓶中，加入一定量的去離子水，在一定溫度的水浴中加熱20min,通過(guò)機(jī)械攪拌(450r/min)混勻,然后快速加入一定量的無(wú)水CaCl2和磷脂酶Al進(jìn)行酶解反應(yīng)，即得到含溶血磷脂酰乙醇胺純度為30%以上的溶血磷脂混合物。
[0029]實(shí)施例2
[0030]稱(chēng)取磷脂酰乙醇胺純度為70%以上的混合物，加入與磷脂酰乙醇胺混合物質(zhì)量比為4:1-14:1的去離子水，30°C -50°C加熱10_20min，然后快速加入與磷脂酰乙醇胺混合物質(zhì)量比為0.004:1-0.1:1的CaCl2和酶活⑶與磷脂酰乙醇胺混合物質(zhì)量(g)比與180-1200的磷脂酶A1JOO -50°C反應(yīng)0.5_2h，濃縮去水，即得到含溶血磷脂酰乙醇胺純度為30%以上的溶血磷脂混合物。
[0031]實(shí)施例3
[0032]稱(chēng)取0.5g磷脂酰乙醇胺純度為70%的混合物，加入3mL的去離子水，50°C下加熱1min,然后快速加入 0.002gCaCl2 和 0.0lmL 磷脂酶 A1 (9500U/mL)，50°C水浴反應(yīng) 30min，然后70°C下真空濃縮去水，即制得含溶血磷脂酰乙醇胺純度為40%的混合物原料。
[0033]實(shí)施例4
[0034]稱(chēng)取1.5g溶血磷脂酰乙醇胺純度為40%的溶血磷脂混合物，溶于氯仿:甲醇體積比為3:1的溶液中，配成濃度為50mg/mL的樣品，備用。取100-200目活化硅膠15g加入氯仿:甲醇=3:1的洗脫液攪拌成衆(zhòng)狀,采用一次性裝柱(規(guī)格Φ15πιπιΧ45α]?),加入氯仿:甲醇=2:1的洗脫劑洗脫2-3次后靜置，使填料充分均勻沉降。將制備好的樣品沿層析柱內(nèi)壁緩慢均勻加入，待樣品液面離柱層液面l_2cm時(shí)，用配置好的洗脫液(氯仿:甲醇=2:1)洗脫，同時(shí)控制流速3.5mL/min,收集含有溶血磷脂酰乙醇胺的級(jí)分，去除溶劑，干燥后得到純度為99.05%的溶血磷脂酰乙醇胺產(chǎn)品。
[0035]實(shí)施例5
[0036]稱(chēng)取1.5g溶血磷脂酰乙醇胺純度為60%的溶血磷脂混合物，溶于乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液中，配成濃度為50mg/mL的樣品，備用。取100-200目活化硅膠15g加入氯仿:甲醇=3:1的洗脫液攪拌成漿狀，采用一次性裝柱，加入氯仿:甲醇=2:1的洗脫劑洗脫2-3次后靜置，使填料充分均勻沉降。將制備好的樣品沿層析柱內(nèi)壁緩慢均勻加入，待樣品液面離柱層液面l_2cm時(shí)，用配置好的洗脫液(氯仿:甲醇=2:1)洗脫，同時(shí)控制流速2mL/min，收集含有溶血磷脂酰乙醇胺的級(jí)分，去除溶劑，干燥后得到純度為98.25%的溶血磷脂酰乙醇胺產(chǎn)品。
[0037]實(shí)施例6
[0038]準(zhǔn)確稱(chēng)取0.3g溶血磷脂酰乙醇胺純度為30%的溶血磷脂混合物，溶于氯仿:甲醇=1:2中，配成濃度為10mg/mL的樣品，備用。取200-300目的活化娃膠15g加入氯仿:甲醇=1:2的洗脫液攪拌成漿狀，采用一次性裝柱，使填料充分均勻沉降。將制備好的樣品沿層析柱內(nèi)壁緩慢均勻加入，待樣品液面離柱層液面l_2cm時(shí)，用配置好的洗脫液(氯仿:甲醇=1:2)洗脫，同時(shí)控制流速1.0mL/min，收集洗脫液，去除溶劑，干燥后得到純度為98.7%的溶血磷脂酰乙醇胺產(chǎn)品。
[0039]實(shí)施例7
[0040]選用硅膠或者氧化鋁作為色譜柱填料。以溶血磷脂酰乙醇胺純度為40%的溶血磷脂混合物為原料，在色譜柱填料15g、洗脫液為氯仿:甲醇=2:1 (v/v)、上樣量為0.5g、上樣濃度為30mg/mL、洗脫液流速2.5mL/min的條件下,所得洗脫效果如圖4所示。從圖4可看出，以硅膠為固定相遠(yuǎn)高于以氧化鋁為固定相所得溶血磷脂酰乙醇胺的純度，而且完全將溶血磷脂酰乙醇胺從硅膠柱上洗脫所需的體積要比從氧化鋁柱用的少。氧化鋁柱色譜存在洗脫時(shí)間長(zhǎng)、所需洗脫液多、洗脫譜帶分布寬，以及最終得率低、柱效低、拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重等問(wèn)題。而硅膠作為固定相能夠很好地分離純化溶血磷脂酰乙醇胺。
[0041]實(shí)施例8
[0042]以溶血磷脂酰乙醇胺純度為40%的溶血磷脂混合物為原料，在色譜柱填料15g、上樣量與硅膠重量比為1:40、上樣濃度為30mg/mL、洗脫液流速2.5mL/min的條件下，分別選用氯仿:甲醇=3:1、氯仿:甲醇=2:1、氯仿:甲醇=1:1、氯仿:甲醇=1:2四種洗脫模式進(jìn)行硅膠柱色譜純化。不同洗脫液比例對(duì)LEP洗脫效果如圖5所示。從圖5可看出，當(dāng)氯仿和甲醇比例為2:1洗脫樣品時(shí)，溶血磷脂酰乙醇胺能夠得到很好的分離，純度達(dá)到98.463 %，所消耗的洗脫體積也比較少。
[0043]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種分離純化溶血磷脂酰乙醇胺的方法，其特征在于，以含溶血磷脂酰乙醇胺純度為30%以上的的溶血磷脂混合物為原料，以硅膠為固定相，氯仿與甲醇體積比1:2-3:1的溶液作為洗脫劑，收集洗脫有溶血磷脂酰乙醇胺的級(jí)分，去除溶劑并干燥。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下具體步驟: (1)稱(chēng)取含溶血磷脂酰乙醇胺純度為30%以上的溶血磷脂混合物為上樣樣品； (2)取與上樣樣品重量比10:1-50:1的硅膠，加到氯仿與甲醇體積比為1:2-3:1的混合溶劑中，攪拌成漿狀，裝柱； (3)將步驟I中的上樣樣品加入步驟2的硅膠柱中； (4)用氯仿與甲醇體積比為1:2-3:1的洗脫液進(jìn)行洗脫，同時(shí)控制流速1-3.5mL/min ； (5)收集洗脫有溶血磷脂酰乙醇胺的級(jí)分，去除溶劑，干燥，得到溶血磷脂酰乙醇胺產(chǎn)品O
3.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述原料所述步驟I中的上樣樣品，溶于氯仿與甲醇體積比為1:2?3:1的溶液中，配制成濃度為10-50mg/mL的溶液。
4.權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述溶血磷脂混合物，是以大豆粉末磷脂中的醇不溶物作為粗磷脂酰乙醇胺原料，使用硅膠色譜分離粗磷脂酰乙醇胺原料得到純度在70%以上的磷脂酰乙醇胺混合物，再將該磷脂酰乙醇胺混合物用磷脂酶Al酶解，即得到含溶血磷脂酰乙醇胺純度在30%以上的溶血磷脂混合物原料。
5.權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述洗脫劑中氯仿與甲醇的體積比為1:1-2:1。
6.權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述硅膠的規(guī)格為100-200目。
7.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟2中上樣樣品與硅膠的質(zhì)量比為1:30-1:40。
8.權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述裝柱選用的硅膠柱的長(zhǎng)徑比為18:1。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法制備的溶血磷脂酰乙醇胺在食品、化妝品、醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07F9/10GK104262387SQ201410481684
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月19日
【發(fā)明者】張康逸, 張薇薇, 宋范范, 何夢(mèng)影, 縱偉 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)科院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所