專利名稱：一種固相合成磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有機生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，自主研發(fā)了一種新型的固相合成磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸(PMO)及方法。
背景技術(shù)：
美國專利US5185444主要介紹了人工合成磷酰二胺嗎啉 代寡核苷酸的方法。其最大貢獻是首先完整地提出了人工合成磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸的方法。不足之處在于，這種方法已經(jīng)沿用了二十年，對于固相合成，使用了樹脂LCAA-CPG作為固相載體，這種樹脂極其昂貴，國內(nèi)沒有生產(chǎn)，只有進口，價格在15000元/10克(西格瑪奧德里奇公司價格)，因此合成成本巨大?，F(xiàn)階段，由于磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸在醫(yī)學應用上有了突破性進展，已經(jīng)到了臨床試驗階段，需要合成量較大，所以需要從合成成本上考慮，盡量降低成本。LCAA-CPG 結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.一種固相合成磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸，其特征是采用了王樹脂作為固相載體，末端羥基用叔丁基二甲基硅保護的磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸(PMO)結(jié)構(gòu)
2.如權(quán)利要求I所述的固相合成磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸，其特征是所述PMO-王樹脂結(jié)構(gòu)中，上下兩端的堿基B為相同的或是不同的一種堿基；復單元中的堿基B是這四種堿基的其中一種或者任意的排列組合。
3.如權(quán)利要求I所述的固相合成磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸，其特征是所述的PMO-王樹脂的結(jié)構(gòu)為 n=l，堿基B分別為腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶⑴的PMO (A-T)-王樹脂的結(jié)構(gòu)
4.如權(quán)利要求I所述的固相合成磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸，其特征是所述的PMO-王樹脂的結(jié)構(gòu)為 n=2,堿基B分別為腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的PMO(A-T)-王樹脂的結(jié)構(gòu)
5.如權(quán)利要求I所述的固相合成磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸，其特征是所述的PMO-王樹脂的結(jié)構(gòu)為 n=3, PMO (G-C-A-T)-王樹脂的結(jié)構(gòu)
6.如權(quán)利要求I所述的固相合成磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸的方法，其特征是具體反應步驟如下 I)含有一種堿基基團B的嗎啉代衍生物和叔丁基二甲基氯硅烷的摩爾投料比為.1/1. 3，溶于二氯甲烷中，二氯甲烷用量足夠?qū)徇苌锖褪宥』谆裙柰槿芙饧纯?；在室溫攪拌下加入咪唑，咪唑的加入量和嗎啉代衍生物的摩爾比?/1 ;反應5個小時后反應物用水洗滌，用無水硫酸鈉干燥，去除溶劑后得到粗品產(chǎn)物為無色的油； .2)第一步反應產(chǎn)物無色的油溶于含有乙酸的三氟乙酸中，乙酸和三氟乙酸的體積比為I/50，攪拌4個小時，之后去除溶劑得到白色固體； .3)第二步反應產(chǎn)物白色固體溶于體積比為I: I的水和二氧六環(huán)中,在室溫加入碳酸鈉；反應物攪拌過夜后用水和二氯甲烷洗滌，有機相用無水硫酸鈉干燥，去除溶劑，粗品經(jīng)過柱層析法純化后得到白色固體； .4)王樹脂放入一個固相合成管里，然后加入第三步反應產(chǎn)物白色固體，王樹脂和第三步反應產(chǎn)物白色固體的摩爾投料比為1/1，二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶與第三步反應產(chǎn)物的摩爾投料比分別為I. 3/1和0. 35/1 ;固相合成管放置在搖床上反應12個小時，然后固相樹脂用大量二氯甲烷洗滌，得到產(chǎn)物； .5)向裝有第四步反應產(chǎn)物的固相合成管里加入四丁基氟化銨四氫呋喃溶液，溶液濃度為100毫克/毫升；然后固相合成管放置在搖床上反應4個小時，固相樹脂用四氫呋喃和二氯甲烷洗滌后得到產(chǎn)物； .6)含有一種堿基基團B并且用磷酰二胺活化后的嗎啉代衍生物和第五步反應產(chǎn)物反應，摩爾投料比范圍為2-9/1，溶于濃度為50毫克/毫升的三乙胺二氯甲烷溶液中，放入固相合成管里；過夜反應后用大量二氯甲烷洗滌得到產(chǎn)物； .7)向裝有第六步反應產(chǎn)物的固相合成管里加入濃度為100毫克/毫升的四丁基氟化銨四氫呋喃溶液；然后固相合成管放置在搖床上反應4個小時，固相樹脂用四氫呋喃和二氯甲烷洗滌后得到產(chǎn)物。
7.如權(quán)利要求6所述的固相合成磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸的方法，其特征是根據(jù)不同堿基B的嗎啉代單體個數(shù)(n+1)，重復n次第六步、第七步反應，將(n+1)個不同堿基B(I, 2，3，4)的嗎啉代單體通過磷酰二胺進行連接，最后在氨水條件下將產(chǎn)物從王樹脂這一固相載體上切下來，得到磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸。
8.如權(quán)利要求6或7所述的固相合成磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸的方法，其特征是n=l，第一步反應中堿基基團B為腺嘌呤(A)，第六步反應中堿基基團B為胸腺嘧啶(T)，在氨水條件下將第七步反應產(chǎn)物從王樹脂這一固相載體上切下來，得到磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸(A-T)。
9.如權(quán)利要求6或7所述的固相合成磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸的方法，其特征是n=2，第一步反應中堿基基團B為腺嘌呤(A)，第六步反應中堿基基團B為胸腺嘧啶(T)，含有堿基基團B為胞嘧啶(C)并且用磷酰二胺活化后的嗎啉代衍生物和第七步反應產(chǎn)物，摩爾投料比為9/1，溶于濃度為50毫克/毫升的三乙胺二氯甲烷溶液中放入固相合成管里；過夜反應后用大量二氯甲烷洗滌得到產(chǎn)物；向裝有該產(chǎn)物的固相合成管里加入濃度為100毫克/毫升的四丁基氟化銨四氫呋喃溶液；然后固相合成管放置在搖床上反應4個小時，固相樹脂用四氫呋喃和二氯甲烷洗滌后，在氨水條件下將該產(chǎn)物從王樹脂這一固相載體上切下來，得到磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸(C-A-T)。
10.如權(quán)利要求6或7所述的固相合成磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸的方法，其特征是n=3,第一步反應中堿基基團B為腺嘌呤(A)，第六步反應中堿基基團B為胸腺嘧啶(T);含有堿基基團B為鳥嘌呤(G)并且用磷酰二胺活化后的嗎啉代衍生物和第七步反應產(chǎn)物，該產(chǎn)物仍在固相載體上未被切下，摩爾投料比為2/1，溶于濃度為50毫克/毫升的三乙胺二氯甲烷溶液中放入固相合成管里；過夜反應后用大量二氯甲烷洗滌得到產(chǎn)物；向裝有該產(chǎn)物的固相合成管里加入濃度為100毫克/毫升的四丁基氟化銨四氫呋喃溶液；然后固相合成 管放置在搖床上反應4個小時，固相樹脂用四氫呋喃和二氯甲烷洗滌后，在氨水條件下將該產(chǎn)物從王樹脂這一固相載體上切下來，磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸(G-C-A-T)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種固相合成磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸的方法。采用了一種便宜易得的樹脂王樹脂作為固相載體，末端羥基用叔丁基二甲基硅保護的磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸(PMO)結(jié)構(gòu)；其中堿基B的結(jié)構(gòu)為腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)四種堿基的任意一種。本發(fā)明與現(xiàn)有固相合成技術(shù)相比大大降低了合成成本，適合磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸產(chǎn)品的大量生產(chǎn)。
文檔編號C07F9/6561GK102702265SQ20121014821
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者劉楊, 李茜, 祝士忠, 騰飛, 陳禹全 申請人:天津特安化學科技有限公司