專利名稱：桉樹pgef12基因及其植物表達載體、宿主細胞和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物基因及其應用，特別是涉及桉樹PGEF12基因及其植物表達載體、宿主細胞和其在促進植物營養(yǎng)生長和提高植物生長量上的應用。
背景技術：
林木在凈化大氣、防風固沙、保持水土、維持生態(tài)平衡和生物多樣性、提供優(yōu)質木材和高產(chǎn)優(yōu)質林果等方面發(fā)揮著重要的作用，具有巨大的生態(tài)效益、社會效益和經(jīng)濟價值。林木等木本植物基因資源豐富，遺傳多樣性復雜，帶有許多具有潛在應用價值但目前尚未得到充分發(fā)掘和有效分離的基因。近年來隨著分子生物學、分子遺傳學、基因組學和生物信息學等學科的發(fā)展，文庫構建和篩選技術、基因克隆技術和高通量測序技術等技術的建立
和改進，越來越多的林木基因得到分離和鑒定，為林木的分子育種與以及林木優(yōu)良基因的發(fā)掘和應用奠定了基礎(李少鋒等人，植物學報46(1): 79-107(2011))。目前，對已分離的林木基因的功能鑒定主要采用以下方法1)與模式植物的同源基因或功能已經(jīng)過鑒定的基因進行相似性比較，建立進化樹；2)對蛋白質結構與和功能進行預測分析；3)通過轉錄水平或蛋白表達水平的分析方法，例如半定量或定量RT-PCR、Western Blotting等，研究目的基因的時空表達以及對環(huán)境因子的響應；4)把基因的與適當?shù)脑噙B接制作成表達盒，并組裝到相應的植物表達載體，通過遺傳轉化技術將表達盒轉化到模式植物或來源物種中，從而改變目標基因在宿主中的表達量，如因過量表達而表達上調，或因反義抑制或者RNA干擾而表達下調，并而通過觀察轉基因植株的性狀，研究基因的功能(何光源等人，植物基因工程，清華大學出版社(2007);王關林等人，植物基因工程，科學出版社(2009))。對于模式植物，一般選用為擬南芥(Arabidopsis thaliana)或者煙草(Nicotianatabacum)。 Mouradov 等(Proceedings of the National Academy of Sciences 95:6537-6542 (1998))將在輻射松(Pinus radiata)的/^方規(guī)7 OVZ7)，一個與擬南芥的Z說/TUFY) /FLORICAULA基因高度同源的基因轉入擬南芥，發(fā)現(xiàn)轉入的植株可以互補發(fā)育途徑中對應基因的LFY缺失，從而表明NLY與FLY的在功能上的相似性。Sonoda等(Plant Biotechnology 26: 115-120 (2009))將赤桉HD-Zip class II 轉錄因子EcHBl 基因轉入煙草，轉基因植株纖維長度和干重增加，葉片、根和莖的生長量均高于對照。這兩種植物的遺傳背景清楚，遺傳轉化系統(tǒng)也較為成熟，尤其是擬南芥，作為基因組最早被測序的植物，其基因組序列、代謝途徑以及生長發(fā)育的分子機制等方面有大量的研究，能為轉基因后代的性狀和機理分析提供較為完善的參考數(shù)據(jù)。因此，通過遺傳轉化模式植物的方法鑒定基因功能的結果可信性高，所得的結果距離分子育種的應用比較接近。桉樹是桃金娘科(Myrtaceae)桉屬(Eucalyptus)的總稱。作為一種集觀賞、用材、紙漿原料、藥用于一體的優(yōu)良樹種，桉樹由于其生長速度快、移栽成活率高等優(yōu)點，得到廣泛的種植。通過分子生物學及基因組學手段篩選及鑒定桉樹的優(yōu)良基因，并從中發(fā)掘具有能促進植物營養(yǎng)生長和提高植物生物量應用價值的基因，除了可通過基因工程改造獲得高產(chǎn)優(yōu)良桉樹品種奠定基礎外，還可以為其他林木、蔬菜及作物的分子育種提供優(yōu)良的基因資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是，提供一種桉樹PGEF12基因及其植物表達載體、宿主細胞和在促進植物營養(yǎng)生長和提高植物生長量上的應用，以有效促進植物營養(yǎng)生長，提高植物生物量。為解決上述技術問題，第一方面，本發(fā)明提供一種桉樹PGEF12基因，其cDNA序列具有如下特征
核苷酸序列為SEQ ID NO: I所示的DNA序列；或者 編碼氨基酸序列為SEQ ID NO:2的多肽。第二方面，本發(fā)明還提供一種植物表達載體，其包含如上所述的桉樹PGEF12基因 或其片段。進一步地，所述植物表達載體為pCAMBIA1301。優(yōu)選地，所述植物表達載體為重組載體 pCAMBIAl301-PGEFl2。第三方面，本發(fā)明還提供一種宿主細胞，其包含如上所述的桉樹PGEF12基因或其片段或者如上任一項所述的植物表達載體。進一步地，所述宿主細胞選自大腸桿菌、農(nóng)桿菌或植物細胞。在一個優(yōu)選實施方案中，所述宿主細胞選自大腸桿菌Transl-Tl菌株、農(nóng)桿菌GV3101菌株或雙子葉植物的細胞。第四方面，本發(fā)明還提供一種如上所述的基因、植物表達載體或宿主細胞在促進植物營養(yǎng)生長和提高植物生物量方面的應用，具體是將所述基因或其片段和/或植物表達載體轉化入植物，或者用所述宿主細胞感染植物。在一個實施方案中，通過本領域公知的方法，例如根癌農(nóng)桿菌介導的轉化法，基因PGEF12或重組載體pCAMBIAl301-PGEFl2被轉化入植物，該植物的轉化后代與未導入基因PGEF12或重組載體pCAMBIAl301-PGEFl2的對照植物相比，葉片等營養(yǎng)器官的生長得到促進，表現(xiàn)為葉片數(shù)增多，植株直徑增大，同時地上部分生長量得到提高。在第二個實施方案中，通過本領域公知的方法，例如根癌農(nóng)桿菌介導的轉化法，基因PGEF12或重組載體pCAMBIAl301-PGEFl2被轉化入植物，該植物的轉化后代與未導入基因PGEF12或重組載體pCAMBIAl301-PGEFl2的對照植物相比，根的生長得到促進，表現(xiàn)為根的長度增加。在第三個實施方案中，通過本領域公知的方法，例如根癌農(nóng)桿菌介導的轉化法，基因PGEF12或重組載體pCAMBIAl301-PGEFl2被轉化入植物，該植物的轉化后與未導入基因PGEF12或重組載體pCAMBIAl301-PGEFl2的對照植物相比，在組培條件下營養(yǎng)生長得到促進，生長量得到提高。通過采用上述技術方案，本發(fā)明具有以下有益效果通過實驗證實，本發(fā)明提供的源于桉樹的PGEF12基因及其編碼的多肽具有促進植物營養(yǎng)生長和提高植物生物量的功能。具體來說，在植物中提高PGEF12的表達量可以增加植物葉片數(shù)、植株直徑，促進根的生長，以及提高生物量。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的技術方案可應用于提高林木、蔬菜和經(jīng)濟作物的產(chǎn)量。
上述的營養(yǎng)生長是指植物在發(fā)育的營養(yǎng)期(Vegetative Phase of Development)的生長發(fā)育過程。這個過程從胚胎發(fā)生開始，一直延續(xù)至植物的整個生長周期，包括種子萌發(fā)和幼苗形成、根和莖的延長和分支、葉片的形成與延伸，以及根和莖的次生加厚(Taiz等人，Plant Physiology, Sinauer Associates,第三版(2002) ；Leyser 等人，Mechanismsin Plant Development, Blackwell Science Ltd. (2003)X



圖I是PGEF12編碼的多肽的氨基酸序列利用NCBI網(wǎng)站的⑶-Search檢索蛋白保守域數(shù)據(jù)庫(CDD v3. 05 - 42589 PSSMs)輸出的結果。圖2是未轉化的Col-O擬南芥和過表達PGEF12擬南芥植株在移栽后28天的地上部分生長狀況對比照片。圖3是未轉化的Col-O擬南芥和過表達PGEF12擬南芥植株在移栽后28天的蓮座直徑和葉片數(shù)統(tǒng)計柱狀圖。圖4是未轉化的Col-O擬南芥根生長狀況的照片。圖5是過表達PGEF12擬南芥植株根生長狀況的照片。圖6是是未轉化的Col-O擬南芥和過表達PGEF12擬南芥幼苗的根長統(tǒng)計柱狀圖。
具體實施例方式下面通過具體實施例并參照附圖對本發(fā)明進行更詳細的說明。應該理解的是，以下所述的實施例僅是用于說明而不是限制本發(fā)明。一、PGEF12基因的克隆與序列分析
I.桉樹cDNA的制備
選取新鮮的桉樹(Mucalyptus)葉片，例如桉屬尾巨桉品種DH32-29 {EucalyptusurophyllaXgrandis cv DH32-29)葉片,迅速放入液氮中冷凍,然后放入-80° C超低溫冰箱(SANY0，MDF-382E)中保存?zhèn)溆?。根?jù)現(xiàn)有的十六燒基三甲基溴化胺(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide, CTAB)提取法(Chang 等人，Plant Molecular Biology Reporter 11(2): 113-116 (1993))提取桉樹葉片總RNA。使用不含RNA酶的DNA酶(Takara，目錄號D2270A)處理提取的RNA以清除里面混雜的的基因組DNA。取約5 U g的桉樹葉片組織總RNA,采用反轉錄試劑盒，如Invitrogen公司的SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR (目錄號 18080-051),合成桉樹cDNA (DNA序列如SEQ ID NO: I所示)。合成的cDNA于-20° C保存?zhèn)溆谩?.聚合酶鏈式反應法擴增PGEF12基因
根據(jù)聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)方法(Mullis 等人，ColdSpring Harbor symposia on quantitative biology 51: 263-273 (1986)),使用高保真熱聚合酶，如 invitrogen 的 Platinum Pfx DNA Polymerase (目錄號11708-039)或者T0Y0B0的KOD FX (目錄號KFX_101X5)，設計帶有含酶切位點接頭的引物，所述引物對應的序列是SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4，以上述桉樹cDNA為模板，克隆PGEF12基因。PCR產(chǎn)物可在1%瓊脂糖凝膠電泳后切下目的條帶，并使用TaKaRa的MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3. 0 (目錄號D823A)回收純化?；厥盏钠问褂闷侥┒丝寺≡噭┖羞B接到克隆載體，例如pEASY-Blunt Cloning Kit (全式金，目錄號CB101)，轉化大腸桿菌后，將陽性菌落送生工生物工程(上海)有限公司測序。選取測序正確的單菌落保存。3. PGEF12基因保守區(qū)域分析
使用諸如 CD-Search (保守結構域搜索(Conserved Domain Search) ；Marchler-Bauer等人，Nucleic Acids Research 39 (D) : 225-229 (2011);也參見美國國家衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health, NIH)國立醫(yī)學圖書館(National Libraryof Medicine, NLM)的國家生物技術信息中心(National Center for BiotechnologyInformation, NCBI)的萬維網(wǎng)網(wǎng)址上對CD-Search及保守結構域數(shù)據(jù)庫(Conserved DomainDatabase)的解釋)之類的分析工具，對PGEF12編碼的多肽序列(氨基酸序列為SEQ IDNO:2)進行保守結構域分析。圖I展示了利用⑶-Search以一種算法在⑶D數(shù)據(jù)庫里面檢索的結果。
二、PGEF12過表擬南芥植株的獲得及其地面部分營養(yǎng)生長狀態(tài)的觀察
1.重組載體pCAMBIA1301-PGEF12的構建
通過使用工具酶進行質粒雙酶切、目的片段回收和連接，將PGEF12克隆至植物表達載體，如PCAMBIA1301，使得該基因位于啟動子如CaMV 35S啟動子的控制下。按照以下操作方法實施，詳細的步驟可根據(jù)本領域技術人員已知的方法進行修改使用SanPr印柱式質粒小量抽提試劑盒(生工生物工程(上海)有限公司，目錄號SK8192)從上述轉化的大腸桿菌中提取含有PGEF12的重組質粒，使用限制性內(nèi)切酶汝~/11(NEB,目錄號(NEB,目錄號R0532)進行雙酶切;另取pCAMBIA1301質粒，使用BgIll和&7I進行雙酶切。酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，分別切下大小約為800bp的PGEF12和大小約為10000 bp的pCAMBIA1301骨架條帶，并使用MiniBEST AgaroseGel DNA Extraction Kit Ver. 3. 0 (Takara,目錄號D823A)回收。將上述兩個片段按照PGEF12:pCAMBIA1301的摩爾比為3:1混合，使用T4 DNA連接酶(Fermentas，目錄號#EL0011)進行連接后轉化大腸桿菌，將陽性菌落送生工生物工程(上海)有限公司測序。選取測序正確的單菌落使用SanPrep柱式質粒小量抽提試劑盒提取質粒，所得的質粒即為重組載體 pCAMBIAl301-PGEFl2。2.擬南芥的遺傳轉化及轉化后代的篩選
2.I含有重組載體pCAMBIA1301-PGEF12的根癌農(nóng)桿菌GV3101細胞的制備
按照本領域技術人員熟知的方法(Wang等人，Agrobacterium Protocols, HumanPress,第2版(2006))，制備根癌農(nóng)桿菌GV3101的感受態(tài)細胞，并使用熱激轉化法將重組載體pCAMBIAl301-PGEFl2轉化根癌農(nóng)桿菌，制備含有pCAMBIAl301-PGEFl2的根癌農(nóng)桿菌GV3101 細胞。2. 2擬南芥的遺傳轉化及轉化后代的篩選
取擬南芥(Arabidopsis thaliana)生態(tài)型Columbia-O (Col-O)種子，以本領域技術人員熟知的方法(Weigel D 等人，Arabidopsis: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press (2002))將種子播種在培養(yǎng)土進行種植。種植環(huán)境溫度20-23°C，濕度 70-85%，光照 16 h/天，光照強度 4500 Lux。
以現(xiàn)有的蘸花浸染法(Zhang等人，Nature Protocols 1(2): 641-646 (2006))轉化擬南芥及從后代中篩選陽性植株。根據(jù)該方法，轉化后當代收獲的種子為Tl代轉基因種子。取擬南芥Tl代轉基因種子消毒后在含有50 mg/L潮霉素B (Hygromycin B),l%鹿糖和 0. 8 g/L 的 Murashige and Skoog 培養(yǎng)基(MS 培養(yǎng)基；Murashige 等人，PhysiologiapIantarum 15(3) : 473-497 (1962))上篩選培養(yǎng)12天，能正常生長發(fā)育的幼苗即為轉基因陽性Tl代植株。將轉基因陽性Tl代植株幼苗小心轉移到培養(yǎng)土上，于上述培養(yǎng)條件中培養(yǎng)，植株成熟后收獲的種子即為T2代轉基因種子。為了進一步確認陽性轉基因植株，可使用PCR法(Mullis等人，Cold SpringHarbor symposia on quantitative biology 51: 263-273 (1986))對篩選得到的陽性植株進行分子鑒定。在幼苗長出8-10片葉片后，取一片約I cm長的葉片提取基因組DNA作為模板，設計擴增超霉素磷酸轉移酶基因(Hygromycin phosphotransferase, hpt)的特異引物，如hpt-F3 (SEQ ID N0:5WPhpt-R3 (SEQ ID NO:6)對hpt基因進行擴增，能成功擴增出約750 bp條帶的樣品對應的植株可確定為陽性轉基因植株。 3. PGEF12過表擬南芥植株地面部分生長狀態(tài)的觀察
取上述T2代轉基因種子，消毒后在含有25 mg/L潮霉素B，1%蔗糖和0.8 g/L瓊脂的的MS培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)12天，能正常生長發(fā)育的幼苗即為轉基因陽性T2代植株。另取非轉基因Col-O擬南芥種子消毒后在營養(yǎng)成分相同但不含潮霉素B的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)12天，作為對照。選取形態(tài)正常的陽性轉基因幼苗和對照幼苗分別小心轉移到培養(yǎng)土上，于前述的培養(yǎng)條件中培養(yǎng)。移栽28天后統(tǒng)計植株蓮座直徑和葉片數(shù)(樣本量>15)，并拍下生長狀況的照片。根據(jù)統(tǒng)計，過表達PGEF12的擬南芥轉化后代(PGEF12-T2)植株相比起未轉化的Col-O植株，蓮座直徑和葉片數(shù)均有顯著增加，如圖2所示。其中蓮座直徑PGEF12-T2為7. 0±0. 7cm, Col-O 為 5. 2± I. I cm ;葉片數(shù) PGEF12-T2 為 18. 9±2. 6 片，Col-O 為 14. 5±3. 8 片，如圖3所示。在t test中，P值〈O. 01，說明PGEF12-T2植株較未轉化植株在這兩個指標上有明顯提聞。三、PGEF12過表達擬南芥植株根系生長表型
過表達PGEF12的擬南芥轉基因種子可根據(jù)以上所述的方法獲得。并可使用垂直平板檢測分析過表達PGEF12的擬南芥植株根系生長表型。取上述T2代轉基因種子，消毒后點播于有25 mg/L潮霉素B，0. 5%蔗糖和0. 8至1% Phytagel的垂直MS培養(yǎng)基平板上，每個平板點10個種子。另取非轉基因Col-O擬南芥種子消毒后點播于相同營養(yǎng)成分但不含潮霉素B的垂直MS培養(yǎng)基平板上，每個平板點10個種子，作為對照。接種后的平板擺放在溫度20-23°C，濕度70-85%，光照16 h/天，光照強度2000 Lux的環(huán)境中培養(yǎng)。培養(yǎng)12天后統(tǒng)計幼苗的根長(樣本量>15)，并拍下生長狀況的照片。如6所示，根據(jù)統(tǒng)計，PGEF12-T2幼苗根長為4. 6±0. 4 cm, Col-O幼苗根長為3. 2±0. 6 cm。在t test中，P值〈O. 01，說明PGEF12-T2植株較未轉化植株幼苗的根長有顯著增加。四、PGEF12過表達擬南芥植株無菌培養(yǎng)條件下的生長狀態(tài) 過表達PGEF12的擬南芥轉基因種子可根據(jù)以上所述的方法獲得。取上述T2代轉基因種子，消毒后在含有25 mg/L潮霉素B，1%蔗糖和0.8 g/L瓊脂的的MS培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)12天，能正常生長發(fā)育的幼苗即為轉基因陽性T2代植株。另取非轉基因Col-O擬南芥種子消毒后在營養(yǎng)成分相同但不含潮霉素B的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)12天，作為對照。選取形態(tài)正常的陽性轉基因幼苗和對照幼苗分別小心轉移到培養(yǎng)瓶中， 所述的培養(yǎng)瓶為直徑8 cm、高12 cm的玻璃廣口瓶，內(nèi)有60 ml含有1%蔗糖和0. 8 g/L瓊脂的的MS培養(yǎng)基，使用通氣的瓶蓋。培養(yǎng)瓶擺放在溫度20-23°C，濕度70-85%，光照16 h/天，光照強度3500 Lux的環(huán)境中培養(yǎng)。培養(yǎng)35天后統(tǒng)計植株的鮮重(樣本量>15)。根據(jù)統(tǒng)計，？6已卩12-丁2植株鮮重3.44±0.5 g, Col-O植株鮮重2. 88±0. 3 g。在t test中，P值〈O. 01，說明PGEF12-T2植株較未轉化植株在組培條件下，生物量(鮮重)有顯著增加。
權利要求
1.一種桉樹PGEF12基因，其特征在于，其cDNA序列具有如下特征 具有SEQ ID NO: I所示的DNA序列；或者 其編碼具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列的多肽。
2.一種植物表達載體，其特征在于其包含如權利要求I所述的桉樹PGEF12基因或其片段。
3.根據(jù)權利要求2所述的植物表達載體，其特征在于所述植物表達載體為PCAMBIA1301。
4.根據(jù)權利要求3所述的植物表達載體，其特征在于，所述植物表達載體為重組載體pCAMBIAl30I-PGEFl2。
5.一種宿主細胞，其特征在于包含如權利要求I所述的桉樹PGEF12基因或其片段或者如權利要求2 4中任一項所述的植物表達載體。
6.根據(jù)權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于所述宿主細胞選自大腸桿菌、農(nóng)桿菌或植物細胞。
7.—種如權利要求I所述的基因在促進植物營養(yǎng)生長和提高植物生物量方面的應用，其特征在于，將所述基因或其片段轉化入植物。
8.—種如權利要求2或3或4所述的植物表達載體在促進植物營養(yǎng)生長和提高植物生物量方面的應用，其特征在于，將所述植物表達載體轉化入植物。
9.一種如權利要求5或6所述的宿主細胞在促進植物營養(yǎng)生長和提高植物生物量方面的應用，其特征在于，用所述宿主細胞感染植物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種桉樹PGEF12基因，其cDNA序列具有如下特征具有SEQIDNO:1所示的DNA序列；或者其編碼具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明還提供一種植物表達載體，其包含如上所述的桉樹PGEF12基因或其片段。本發(fā)明還提供一種宿主細胞，包含如上所述的桉樹PGEF12基因或其片段或如上所述的植物表達載體。本發(fā)明還提供上述基因、植物表達載體或宿主細胞在促進植物營養(yǎng)生長和提高植物生物量方面的應用，具體是將所述基因或其片段和/或植物表達載體轉化入植物，或者用所述宿主細胞感染植物。通過在植物中提高PGEF12的表達量可增加植物葉片數(shù)、植株直徑，促進根的生長，以及提高生物量。本發(fā)明的技術方案可應用于提高林木、蔬菜和經(jīng)濟作物的產(chǎn)量。
文檔編號C07K14/415GK102757970SQ20121027122
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月31日 優(yōu)先權日2012年7月31日
發(fā)明者孫長斌, 李奕恒, 許文釗 申請人:普羅米綠色能源(深圳)有限公司