專利名稱：：植物耐逆性相關(guān)蛋白TaHSP90-1及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物耐逆性相關(guān)蛋白TaHSP90_l及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：高溫等逆境脅迫是影響小麥生長、發(fā)育的障礙因子。因此，了解小麥對(duì)逆境條件的應(yīng)答與信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，提高小麥品種的抗逆性，成為小麥遺傳研究及小麥品種改良的重要任務(wù)之一。在逆境脅迫下植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生一系列應(yīng)答反應(yīng)，伴隨著許多生理生化及發(fā)育上的變化。明確植物對(duì)逆境的反應(yīng)機(jī)制，將為抗逆基因工程研究和應(yīng)用提供科學(xué)論據(jù)。目前，植物抗逆性研究已逐漸深入到細(xì)胞、分子水平，并與遺傳學(xué)和遺傳工程研究相結(jié)合，探索用生物技術(shù)來改進(jìn)植物生長特性，其目的是提高植物對(duì)逆境的適應(yīng)能力。在高溫脅迫下，植物會(huì)產(chǎn)生各種防御響應(yīng)，其中熱激蛋白(Heatshockprotein,HSP)合成的明顯增加引起了人們的關(guān)注。近年來的研究表明，熱激響應(yīng)蛋白在植物脅迫應(yīng)答的基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用。熱激蛋白又稱為熱休克蛋白，是在受熱、病原體、理化因素等應(yīng)激原刺激后，發(fā)生熱激反應(yīng)時(shí)所產(chǎn)生的一類在生物進(jìn)化中最保守并有熱激基因所編碼的伴隨細(xì)胞蛋白，它存在于細(xì)菌到人類的各個(gè)生物體中。據(jù)報(bào)道，當(dāng)受到高溫脅迫時(shí)，HSP能識(shí)別并參與體內(nèi)蛋白的正確折疊、防止體內(nèi)蛋白聚合(TrentJD1996)。根據(jù)分子量大小，HSP可以分為不同的家族，包括小HSPs、HSP60、HSP70、HSP90和HSPllO等。其中，HSP90的底物蛋白廣泛參與了細(xì)胞信號(hào)的傳遞途徑。HSP90是一種高度保守并普遍存在于原核生物以及真核生物細(xì)胞中的分子伴侶，為真核生物生長發(fā)育所必需。盡管作為一種熱激蛋白，HSP90非應(yīng)激情況下依然是細(xì)胞中最豐富的蛋白質(zhì)之一，約占總蛋白的12%。作為分子伴侶中最特別的一組蛋白，HSP90能輔助蛋白的折疊、激活和成熟并改變和維持參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白構(gòu)象，在細(xì)胞的生長進(jìn)程過程中起著重要的作用。HSP90是一個(gè)受ATP調(diào)節(jié)的二聚體分子伴侶，幾乎所有的的家族成員都共有一個(gè)結(jié)構(gòu)模型。如圖1所示，HSP90包含3個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，一個(gè)約25KD大小的N端結(jié)構(gòu)域、35KD的中間結(jié)構(gòu)域(M)和一個(gè)12KD的C端結(jié)構(gòu)域。在真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，HSP90的N端和中間結(jié)構(gòu)域之間還有一段荷電區(qū)，該區(qū)域的長度和組分因物種不同而異。N端結(jié)構(gòu)域有一個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)，此位點(diǎn)也是HSP90抑制劑的結(jié)合位點(diǎn)，并具內(nèi)源ATPase活性，在ATP存在的情況下，會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，進(jìn)而參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，蛋白折疊以及形態(tài)進(jìn)化等很多細(xì)胞過程。雖然ATPase活性較弱，但突變研究的結(jié)果顯示ATPase活性是HSP90執(zhí)行生物功能所必須的。這個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)的晶體結(jié)構(gòu)與二型拓?fù)洚悩?gòu)酶DNA促旋酶B(GyrB)相同，它們與組氨酸激酶和MutL同屬于GHKL家族。荷電區(qū)是一個(gè)大約50個(gè)氨基酸殘基的片段，其中2030個(gè)氨基酸是荷電氨基酸。荷電區(qū)對(duì)于體內(nèi)HSP90的功能，體外ATPase活性都是可有可無的，主要功能是共價(jià)連接N端結(jié)構(gòu)域和中間結(jié)構(gòu)域，使兩個(gè)結(jié)構(gòu)域很好的協(xié)作，以維持HSP90的ATP結(jié)合狀態(tài)的構(gòu)象。研究表明，單獨(dú)的N端結(jié)構(gòu)域是沒有ATPase活性的，維持其完整活性需要中間結(jié)構(gòu)域的參與，中間結(jié)構(gòu)域有一個(gè)接觸反應(yīng)環(huán)可以感知ATP-γ磷酸鹽的存在并進(jìn)攻它，其內(nèi)側(cè)還有一個(gè)暴露的疏水區(qū)域，根據(jù)實(shí)驗(yàn)推測(cè)此位置可能是HSP90底物蛋白主要的結(jié)合位點(diǎn)。在C端，HSP90通過二聚體結(jié)合區(qū)形成二聚體，這個(gè)二聚體的特性是HSP90執(zhí)行其功能的關(guān)鍵所在，C端的缺失會(huì)造成N端結(jié)合的ATP不能被水解，說明兩個(gè)單體HSP90的N端聯(lián)合是ATP水解的先決條件，而C端的二聚化作用可以加強(qiáng)這一聯(lián)合。同時(shí)，真核生物細(xì)胞質(zhì)HSP90的C端還有一個(gè)保守的五肽結(jié)構(gòu)(MEEVD)，含有IPR結(jié)構(gòu)域的蛋白就是通過這個(gè)五肽結(jié)構(gòu)來識(shí)別HSP90并與之結(jié)合的，從而使HSP90發(fā)揮不同的作用。沒有結(jié)合ATP的HSP90二聚體處于開放狀態(tài)，它可以通過分來的兩個(gè)單體N端結(jié)構(gòu)域來捕獲底物蛋白；相反，當(dāng)N端結(jié)合ATP后蛋白構(gòu)象發(fā)生變化時(shí)，兩個(gè)分開的N端就會(huì)發(fā)生短暫的聯(lián)合，HSP90分子夾閉合，底物蛋白也被包裹在夾內(nèi)(圖2)。HSP90在原核生物和真核生物中高度保守并普遍存在。研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)HSP90定位于細(xì)胞質(zhì)，但也有少部分存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體等亞細(xì)胞器中，在植物中甚至存在于葉綠體。在動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)中的HSP90有兩種亞型HSP90a和HSP90β，在氨基酸水平上具有76%的同源性；一種存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分子量為94KD，受葡萄糖調(diào)節(jié)的蛋白Grp94，它與細(xì)胞質(zhì)HSP90的一致性達(dá)50%；定位于線粒體上的HSP90的遠(yuǎn)緣親屬TRAPl也被分離報(bào)道，它與人類HSP90i3的同源性約為35%。植物中的HSP90家族有多個(gè)成員，擬南芥中存在7個(gè)HSP90成員，分別是AtHSP90-l、AtHSP90-2、AtHSP90_3、AtHSP90_4、AtHSP90_5、AtHSP90_6和AtHSP90_7，它們之間有45%的一致性。AtHSP90-2、AtHSP90_3和AtHSP90_4之間的蛋白序列高度相似，彼此之間同源性高達(dá)96%，說明在功能上可能是冗余的。AtHSP90-l、AtHSP90_2、AtHSP90_3和AtHSP90-4定位于細(xì)胞質(zhì)，在它們的C末端的氨基酸序列末端都含有特異的定位信號(hào)MEEVD；AtHSP90-5和AtHSP90_6的編碼基因中含有1819個(gè)內(nèi)含子，這與細(xì)胞質(zhì)HSP90的基因一般含有23個(gè)內(nèi)含子是不同的，兩者分別定位于葉綠體和線粒體；AtHSP90-7包含1830個(gè)氨基酸組成的N端信號(hào)序列和C端的KDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)序列，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上(。HSP90在細(xì)胞的生長進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用，包括細(xì)胞生長、凋亡、癌變、應(yīng)激反應(yīng)、內(nèi)分泌功能、植物免疫、發(fā)育甚至進(jìn)化。近幾年發(fā)現(xiàn)，HSP90參與了信號(hào)傳遞蛋白的合成、折疊。最近，在擬南芥、煙草和水稻上的研究發(fā)現(xiàn)，HSP90在植物發(fā)育、對(duì)脅迫環(huán)境的應(yīng)答以及抗病性中起著重要作用。擬南芥HSP90復(fù)合物直接調(diào)控了抗病蛋白的活性，在R(Resistance)基因介導(dǎo)的抗病性中起著關(guān)鍵作用；Liu等(2004)報(bào)道，煙草HSP90與RARl和TIR-NB-LRR蛋白互作，賦予植株煙草花葉病毒(TMV)抗性，抑制煙草HSP90基因，導(dǎo)致植株發(fā)育嚴(yán)重畸形。劉大麗等(2006)利用差異顯示法，從水稻中克隆到HSP90基因(rHSP90)，可明顯提高煙草在鹽脅迫下的生長勢(shì)。上述研究表明，植物HSP90在植物適應(yīng)逆境環(huán)境過程中起著重要的作用。因此，深入研究植物HSP90在逆境條件下的功能，對(duì)正確認(rèn)識(shí)脅迫信號(hào)的傳導(dǎo)、抗逆相關(guān)基因的調(diào)控、以及提高作物的抗逆性有重要的指導(dǎo)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種植物耐逆性相關(guān)蛋白TaHSP90_l及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，為熱激響應(yīng)蛋白90，來源于小麥屬小麥(TriticumaestivumL.),是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性和/或生長能力相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。序列表1所示蛋白質(zhì)由700個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端第695位-700位氨基酸殘基序列為保守的細(xì)胞質(zhì)HSP90的五肽結(jié)構(gòu)(MEEVD)。為了使(a)中的TaHSP90_l便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>上述(b)中的TaHSP90_l可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得至IJ。上述(b)中的TaHSP90-l的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼所述蛋白的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因可為如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子1)序列表中序列2自5’端第71至2173位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2自5，端第68至2175位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列2所示的DNA分子；4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼耐逆性和/或生長能力相關(guān)蛋白的DNA分子；5)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐逆性和/或生長能力相關(guān)蛋白的DNA分子。所述嚴(yán)格條件為在0.IXSSPE(或0.1XSSC)、0.1%SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。序列2所示cDNA由2411個(gè)核苷酸組成，該基因的開放閱讀框架為自5'端第71位-2173位核苷酸。含有所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用所述基因構(gòu)建重組植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動(dòng)子或組成型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、玉米的泛素啟動(dòng)子(Ubiquitin)，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。所述重組表達(dá)載體具體可為pBI121-TaHSP90_l；所述pBI121-TaHSP90_l為將權(quán)利要求2所述基因插入pBI121的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒，優(yōu)選為將序列表的序列2自5’端第68位-2175位位核苷酸所示的DNA片段插入pBI121的SmaI和SpeI酶切識(shí)別位點(diǎn)之間得到的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述基因?qū)肽康闹参镏?，得到耐逆性?或生長能力高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。所述基因具體可通過所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中。攜帶有所述基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。所述目的植物既可以是單子葉植物也可以是雙子葉植物，如擬南芥(如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥)。所述耐逆性具體可為耐旱。所述生長能力體現(xiàn)在生長速度和/或生長周期上，所述轉(zhuǎn)基因植物的生長速度高于所述目的植物和/或生長周期長于所述目的植物。擴(kuò)增所述基因的全長或其任意片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的TaHSP90_l在高溫、干旱、鹽、低溫、乙烯(ET)和脫落酸(ABA)的誘導(dǎo)表達(dá)，但對(duì)各種脅迫響應(yīng)的時(shí)間和強(qiáng)度不同，其中，對(duì)高溫、干旱和ET響應(yīng)比較強(qiáng)烈。并且TaHSP90-l-GFP融合蛋白激發(fā)的熒光主要分布在在細(xì)胞質(zhì)中。本發(fā)明的TaHSP90-l為人為控制抗逆和耐逆相關(guān)基因的表達(dá)提供了基礎(chǔ)，將在培育抗逆性和耐逆性增強(qiáng)的植物育種中發(fā)揮重要的作用。圖1為HSP90的結(jié)構(gòu)模型。圖2為ATP驅(qū)動(dòng)的HSP90分子夾；N.HSP90N端結(jié)構(gòu)域；M.HSP90中間結(jié)構(gòu)域；C.HSP90C端結(jié)構(gòu)域。圖3為TaHSP90_l與擬南芥AtHSP90_l氨基酸序列的同源性比對(duì)結(jié)果。圖4為TaHSP90_l受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR圖譜。圖5為重組質(zhì)粒16318hGFP-HSP90_l圖譜。圖6為TaHSP90-l亞細(xì)胞定位結(jié)果；A:HSP90_1定位于細(xì)胞質(zhì)中；B:16318hGFP空載體對(duì)照。圖7為pBI121-TaHSP90_l圖譜。圖8為轉(zhuǎn)pBI121-HSP90-l基因和擬南芥Col-O的表型對(duì)比。具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。下述實(shí)施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例1、TaHSP90_l的克隆一、總RNA提取及cDNA文庫構(gòu)建將普通小麥(TriticumaestivumL.)品種小白麥(國家種質(zhì)資源庫，編號(hào)ZM242)播種在苗床上，2024°C生長IOd左右，從土壤中取出，用蒸餾水沖洗干凈，放在濾紙上干旱處理2h，取葉片立即放入液氮中，并保存在-80°C條件下準(zhǔn)備提取RNA。采用Trizol法(TianGen)提取小麥葉片總RNA，第一鏈cDNA合成用反轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)(TaKaRa)。采用SMART法(BD)進(jìn)行合成dscDNA。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳。二、誘餌載體的構(gòu)建及自激活檢測(cè)根據(jù)W17基因的序列及pGBKT7(Clontech)的克隆位點(diǎn)，在基因的兩端分別引入EcoRI和BamHI(Promaga)酶切位點(diǎn)。酶切、連接(T4連接酶；Promaga)到質(zhì)粒pGBKT7。測(cè)序驗(yàn)證融合質(zhì)粒PGBKT7-W17克隆正確。將pGBKT7-W17、空pGBKT7以及陰性對(duì)照分別與pGADT7共同轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109中，SD/-Trp/-Leu和SD/-Trp/-Leu/-His/_Ade平板篩選培養(yǎng)，驗(yàn)證pGBKT7_W17是否具有自激活活性。三、酵母感受態(tài)的制備、誘餌質(zhì)粒及文庫質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化按照Clontech公司酵母雙雜交系統(tǒng)說明書(MATCHMAK2ERpLexAtwo-HybridUserManual和yeastProtocolsHandbook)制備AH109感受態(tài)細(xì)胞，將pGBKT7_W17質(zhì)粒、PGADT7和小麥文庫混合轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞AH109。四、酵母雙雜交篩選陽性克隆1、誘餌載體BD質(zhì)粒pGBKT7帶有Trp篩選標(biāo)記，AD質(zhì)粒pGADT7帶有Leu篩選標(biāo)記。將pGBKT7-W17、pGADT7和文庫質(zhì)?；旌限D(zhuǎn)化AH109，涂布于SD/_Trp/_Leu(SIGMA)營養(yǎng)缺陷型平板，30°C培養(yǎng)35d，用牙簽挑取直徑大于2mm的陽性克隆，然后在SD/Raf/Gal/x-gal(Sigma)平板上劃線培養(yǎng)，篩選藍(lán)色克隆。2、將篩選出的陽性酵母菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，將插入片段大于500bp的克隆提取質(zhì)粒(TianGen)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α(TransGen)，測(cè)序(SunBiotech)，通過檢索GenBank和利用DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列比較和同源性分析。3、選取插入片段大于SOObp的克隆進(jìn)行測(cè)序，采用雙脫氧核苷酸鏈終止法測(cè)定序列，將得到的全序列與EMBLBank以及GENEBANK等核苷酸數(shù)據(jù)庫比較，用DNASIS軟件進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)有一個(gè)陽性克隆與擬南芥AtHSP90.1有很高同源性，為85.63%，且具有細(xì)胞質(zhì)HSP90保守的五肽結(jié)構(gòu)(MEEVD)結(jié)構(gòu)域。4、通過5，RACE方法從小麥中獲得一個(gè)新的HSP90基因全長序列。將序列表的序列1所示的蛋白命名為TaHSP90_l蛋白，由700個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端第695位-700位氨基酸殘基序列為保守的保守的五肽結(jié)構(gòu)(MEEVD)。同源序列比對(duì)結(jié)果如圖3所示(黑框表示一致的氨基酸部分)，表明TaHSP90-l與已報(bào)道的擬南芥AtHSP90.1有85.63%的同源性，且在小麥中尚未發(fā)現(xiàn)有HSP90研究的報(bào)道，說明TaHSP90_l是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的小麥基因。將TaHSP90-l蛋白的編碼基因命名為TaHSP90_l基因，其開放閱讀框架為自序列表的序列2的5'端第71位至2173位核苷酸。實(shí)施例2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析TaHSP90_l的表達(dá)特性一、進(jìn)行各種脅迫處理苗齡為10天的小白麥幼苗，進(jìn)行以下處理(1)干旱處理將水培的小麥幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的濾紙上，干旱培養(yǎng)30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)后取出材料，用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?2)鹽漬處理將小麥幼苗置于2%的由NaCl和Na2SO4組成的鈉鹽溶液中(NaCl與Na2SO4W質(zhì)量百分比為32)中，光照培養(yǎng)30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)后分別取出材料，用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?3)脫落酸處理將小麥幼苗置于200μM的脫落酸(ABA)溶液中，光照培養(yǎng)30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)后分別取出并用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?4)冷害處理將小麥幼苗置于4°C培養(yǎng)箱，光照培養(yǎng)30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)后取出并用液氮速凍，_80°C保存?zhèn)溆谩?5)茉莉酸甲酯處理將小麥幼苗置于50μM的茉莉酸甲酯(JA)溶液中，光照培養(yǎng)30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)后分別取出并用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?6)乙烯處理小麥幼苗置于含有乙烯的塑料袋中，光照培養(yǎng)30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)后分別取出并用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?7)水楊酸處理將小麥幼苗置于50μM的水楊酸(SA)溶液中，光照培養(yǎng)30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)后分別取出并用液氮速凍，_80°C保存?zhèn)溆谩?8)高溫處理將小麥幼苗置于42°C下，光照培養(yǎng)30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)后分別取出并用液氮速凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?9)對(duì)照的處理直接取未經(jīng)任何處理的小麥幼苗-80°C凍存作為對(duì)照(0小時(shí))。二、mRNA的分離采用QuikprepMicromRNAPurificationKit(Pharmacia)進(jìn)行mRNA的分離。三.反轉(zhuǎn)錄為cDNA采用R103_Quant_Reverse_Transcriptase(TIANGEN)將純化的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR根據(jù)TaHSP90_l序列，在其可變區(qū)設(shè)計(jì)特異引物90RTF和90RTR。以actin為內(nèi)參基因，引物為actin-2F和actin_2R。90RTF5'-TCTGTCAAGGACCTTGTGAT-3，；90RTR5，-ACCATCGAACTTCGACACT-3，。actin-2F:5，-CTCCCTCACAACAACCGC-3，；actin-2R:5，-TACCAGGAACTTCCATACCAAC-3，。TaHSP90-l對(duì)各個(gè)脅迫及激素表現(xiàn)出響應(yīng)，見圖4。實(shí)施例3、亞細(xì)胞定位分析一、載體構(gòu)建PCR擴(kuò)增TaHSP90_l基因全長。將目的片段連接到同樣雙酶切的亞細(xì)胞定位載體163hGFP上，熱激轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)。將陽性克隆測(cè)序。提取質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒16318hGFP-HSP90-l(見圖5)。二、材料準(zhǔn)備3μg重組質(zhì)粒DNA加入直徑為1.0μM的金粉懸液6μ1(50mg/ml),0.IM亞精胺(spermidine)4μ1,2.5ΜCaCl26μ1，將金粉、DNA、亞精胺和氯化鈣先分別振蕩混勻，然后混合振蕩混勻3min后，冰上靜置15min。12000rpm離心IOs(轉(zhuǎn)速達(dá)到12000rpm后IOs)，棄上清。加入140μ1無水乙醇，粗振蕩后(打散金粉)12000rpm離心10s，收集金粉沉淀。20μ1無水乙醇懸浮沉淀，點(diǎn)膜。三、基因槍轟擊受體材料①選用一定壓力的可裂膜(本實(shí)驗(yàn)用llOOpsi)，與轟擊膜一起，在70%的酒精中浸泡12h，取出晾干；②金屬擋板用酒精浸泡，在酒精燈上滅菌，基因槍的超凈工作臺(tái)紫外滅菌；③取20μ1上述制備好的金粉-質(zhì)粒復(fù)合體，均勻涂布于轟擊膜的中間位置上，不要涂于整個(gè)膜上，大小與載體固定圈上的孔徑范圍一致，晾干，然后固定在載體固定圈上；④將上述載體固定圈安裝到發(fā)射裝置上；⑤將可裂膜安裝到氣體加速管下端；⑥將洋蔥表皮培養(yǎng)皿放入真空室內(nèi)，取下培養(yǎng)皿蓋；⑦抽真空指針到26In/Hg；⑧放氦氣于氣體加速管，直到管中壓力達(dá)到可裂膜所能承受的壓力時(shí)，可裂膜破開；⑨氣體沖到轟擊膜上，載體向下運(yùn)動(dòng)，被金屬擋板擋住，而下面的金粉-質(zhì)粒復(fù)合體卻透過金屬擋板的網(wǎng)孔射向靶細(xì)胞；⑩將轟擊好的洋蔥表皮細(xì)胞放入25°C培養(yǎng)箱中，暗培養(yǎng)1624h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察。四、洋蔥表皮細(xì)胞鏡檢將基因槍轟擊、暗培養(yǎng)16_24h之后的洋蔥表皮壓片，然后在激光掃描共聚焦顯微鏡(Bio-RadMicroRadiance)(Laserscanningconfocalmicroscopy,LSMC)觀察GFP(綠色熒光蛋白)熒光，并進(jìn)行掃描照像。結(jié)果表明TaHSP90-l定位到細(xì)胞質(zhì)中。LSCM的工作參數(shù)為Ex=488nm,Em=525士15nm，Power=10%,Zoom7，中速掃描，F(xiàn)rame512X512。軟件為TIME-COURSE和PH0T0SH0P5.O。見圖6。實(shí)施例4、TaHSP90-l提高擬南芥的抗旱性一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建l、TaHSP90_l基因的克隆根據(jù)TaHSP90_l基因的序列設(shè)計(jì)引物對(duì)(TaHSP90_lF和TaHSP90_lR)，引物末端分別引入SmaI和SpeI酶切識(shí)別位點(diǎn)，以小白麥的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增TaHSP90_l。TaHSP90-l-121F:5，-AACCCGGGGCCATGGCGACGGAGACC-3’；TaHSP90-l-121R:5’-AAACTAGTGCTTAGTCGACCTCCTCCATCTTGC-3’。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，采用AgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.O(TaKaRa公司，CodeNo.:DV807A)回收純化2.1Kb左右的條帶。2、重組表達(dá)載體的構(gòu)建①用限制性內(nèi)切酶SmaI和SpeI酶切步驟1回收純化的PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物；②用限制性內(nèi)切酶SmaI和SpeI酶切pBI121(Clontech公司購買)，回收載體骨架；③將步驟①的酶切產(chǎn)物和步驟②的載體骨架連接；④將步驟③的連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化T0P10菌株(天根生化科技(北京)有限公司購買)，37°C過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆進(jìn)行測(cè)序；測(cè)序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒pBI121-TaHSP90-l(在pBI121的SmaI和SpeI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列2自5，端第68位-2175位核苷酸所示的DNA片段；見圖7)。二、轉(zhuǎn)基因植物的獲得1、用重組質(zhì)粒pBI121-TaHSP90-l轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58(北京拜爾迪生物技術(shù)公司購買)，得到重組農(nóng)桿菌。2、將重組農(nóng)桿菌接種于YEP液體培養(yǎng)基中，28°C、3000rpm培養(yǎng)約30小時(shí)；3、將步驟2的菌液轉(zhuǎn)至YEP液體培養(yǎng)基(含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平)中，28°C、300rpm培養(yǎng)約14小時(shí)(菌液0D600達(dá)到1.5-3.0)；4、收集菌體，4°C、4000g離心lOmin，用10%蔗糖(含0.02%silwet)稀釋至0D600約為0.8-1.0；5、將擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型Col-0，SALK公司購買)整株與花盆一起倒扣在盛有步驟4的菌液的容器中，使花浸泡50s左右，浸泡完畢后，取出花盆，側(cè)放于托盤中，蓋上黑色塑料布，24hr后揭開塑料布，直立放置花盆，進(jìn)行正常的光照培養(yǎng)，收獲T1代種子，卡那霉素篩選(濃度為50μg/L卡那霉素)陽性植株(大部分非轉(zhuǎn)基因植株黃化死去，而轉(zhuǎn)基因植株能夠正常生長)。將陽性植株進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果表明，得到的轉(zhuǎn)基因植株(轉(zhuǎn)TaHSP90-l基因植株)。T2代表示T1代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株，T3代表示T2代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株。三、轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植物的獲得用質(zhì)粒PBI121轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，得到重組農(nóng)桿菌，用重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥，得到轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株，方法同步驟二。四、轉(zhuǎn)基因植物的生長能力鑒定分別將T3代轉(zhuǎn)基因植株、T3代轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株和擬南芥Col-O(各60株)進(jìn)行生長能力鑒定。將處于相同生長期的幼苗轉(zhuǎn)入營養(yǎng)土中生長，觀察表型。見圖8;Α:轉(zhuǎn)入營養(yǎng)土中3d后的擬南芥；B轉(zhuǎn)入營養(yǎng)土中兩周后的擬南芥；C轉(zhuǎn)入營養(yǎng)土中兩周后擬南芥的葉形比較；①轉(zhuǎn)基因擬南芥；②非轉(zhuǎn)基因擬南芥。轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株相比生長速度稍快，葉片稍大，并且轉(zhuǎn)基因植株生長周期較長，比野生型植株晚成熟一周左右。轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株的表型與擬南芥Col-O—致。五、轉(zhuǎn)基因植物的耐旱性鑒定分別將T3代轉(zhuǎn)基因植株、Τ3代轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株和擬南芥Col-O(各60株)進(jìn)行耐旱性鑒定。設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。將正常生長15天的幼苗進(jìn)行干旱處理，連續(xù)不澆水直至擬南芥Col-O枯萎(約20天)，然后復(fù)水7天，統(tǒng)計(jì)成活率。擬南芥Col-O全部死亡，但25%轉(zhuǎn)基因植株存活且能正常生長。轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株的表型與擬南芥Col-O—致，存活率與擬南芥Col-O沒有顯著差異。權(quán)利要求一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性和/或生長能力相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因，優(yōu)選為如下1)或2)或3)或4)或5)的DNA分子1)序列表中序列2自5’端第71至2173位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2自5’端第68至2175位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列2所示的DNA分子；4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼耐逆性和/或生長能力相關(guān)蛋白的DNA分子；5)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且編碼耐逆性和/或生長能力相關(guān)蛋白的DNA分子。3.含有權(quán)利要求2所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。4.如權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為pBI121-TaHSP90-l；所述pBI121-TaHSP90_l為將權(quán)利要求2所述基因插入pBI121的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒，優(yōu)選為將序列表的序列2自5’端第68位-2175位位核苷酸所示的DNA片段插入pBI121的SmaI和SpeI酶切識(shí)別位點(diǎn)之間得到的重組質(zhì)粒。5.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2所述基因?qū)肽康闹参镏?，得到耐逆性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2所述基因通過權(quán)利要求3或4所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中；所述耐逆性為耐旱。7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述目的植物為擬南芥，優(yōu)選為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。8.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2所述基因?qū)肽康闹参镏?，得到生長能力優(yōu)于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2所述基因通過權(quán)利要求3或4所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中；所述生長能力體現(xiàn)為生長速度高和/或生長周期長。10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于所述目的植物為擬南芥，優(yōu)選為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。全文摘要本發(fā)明公開了一種植物耐逆性相關(guān)蛋白TaHSP90-1及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的TaHSP90-1在高溫、干旱、鹽、低溫、乙烯(ET)和脫落酸(ABA)的誘導(dǎo)表達(dá)，但對(duì)各種脅迫響應(yīng)的時(shí)間和強(qiáng)度不同，其中，對(duì)高溫、干旱和ET響應(yīng)比較強(qiáng)烈。并且TaHSP90-1-GFP融合蛋白激發(fā)的熒光主要分布在在細(xì)胞質(zhì)中。本發(fā)明的TaHSP90-1為人為控制抗逆和耐逆相關(guān)基因的表達(dá)提供了基礎(chǔ)，將在培育抗逆性和耐逆性增強(qiáng)的植物育種中發(fā)揮重要的作用。文檔編號(hào)C07K14/415GK101805401SQ201010161558公開日2010年8月18日申請(qǐng)日期2010年4月27日優(yōu)先權(quán)日2010年4月27日發(fā)明者徐兆師,李連城,陳明,馬有志申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所