專利名稱：將感興趣蛋白靶向宿主細胞包膜的方法和組合物的制作方法
將感興趣蛋白靶向宿主細胞包膜的方法和組合物
背景技術：
已經嘗試在細菌中表達重組真核膜蛋白，但這些方法因包括毒性和不溶性的原因 以及內含體不期望的形成而存在問題(Grisshammer等Biochem. J. 295 :571_576 (1993)； Tucker 禾口 Grisshammer Biochem. J. 317 891-899 (1996) ；Weiss 禾口 GrisshammerEur. J.Biochem. 269 :82-92(2002) ；Yeliseev 等 Protein Sci. 14 :2638_53(2005) ；Krepkiy 等 Protein Expr Purif.49 60-70(2006) ；Yeliseev 等 Protein Expr Purif. 53 153-163(2007))。另外，缺乏在大腸桿菌(E. coli)中重組膜蛋白過表達的可靠的方法。真核膜蛋白通過在N末端信號序列或C末端靶向序列中編碼的地址而靶向真核細 胞中各區(qū)室(Emanuelsson 等 Nature Protocols 2:953-971 (2007))。在生物發(fā)生過程中 通常除去信號序列。在沒有膜區(qū)室化的細菌中，大部分新翻譯的膜蛋白——即使與核糖體相結合 時——被信號識別顆粒(SRP)和SRP受體蛋白識別，以靶向至圍繞細菌細胞的內膜。在 大腸桿菌中研究的大部分內膜蛋白使用SRP通路和Sec移位酶來靶向至膜和膜裝配。 另外，膜蛋白的亞型對YidC具有絕對要求，YidC為輔助膜插入過程的大腸桿菌的多 起源內膜蛋白。YidC對于大腸桿菌細胞生存力是必需的(Samuelson等Nature 406 637-641 (2000) ；Urbanus 等EMB0 Rep. 2 524-529 (2001) ；van Bloois 等 J. Biol. Chem. 280 12996-13003(2005))。蛋白——其依賴二硫鍵獲得其天然結構——的穩(wěn)定表達的選擇方法是將新合成 的蛋白輸出到含有二硫鍵催化酶(SRP-依賴性DsbA、DsbB、DsbC和DsbD)的大腸桿菌周質 中(Bardwell 等Cell 67 581(1991);敘111行&111等￡]\ 0 J. 11 57(1992) ；Novagen (now EMD Chemicals,Inc. ,Gibbstown,NJ)pET system manual (llthed. Jan. 2007) ；Missiakas 等 EMB0 J. 13 2013-2020 (1994)；以及 Zapun 等 Biochemistry34 :5075_5089 (1995))。輸出到周質的候選蛋白可以使用信號肽搜索算法如Phobius(http://phobius. sbc. su. se/) (Kail 等，Nucleic Acids Res. 35 :W429_32 (2007))禾口 Signal P (http: //www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/) (Emanuelsson 等 Nat Protoc. 2 (4) :953_71 (2007))通過 N末端信號肽來鑒定。然而，向周質輸出受到Sec蛋白輸出機器流通容量的限制(P6reZ-P6reZ等 Biotechnology 12(2) 178-80 (1994))，其中Sec轉移酶可以變飽和并且導致天然分 泌蛋白的細胞質積聚和過表達感興趣的蛋白(Wagner等Mo 1. Cell Proteomics6 (9) 1527-50(2007))。當感興趣的蛋白對于大腸桿菌是非天然的和/或不是正常分泌的時，這 更普遍地被觀察到?？蛇x地，非天然蛋白可以在合成期間變得錯誤折疊，從而變得不適于 Sec-介導的跨內膜輸出。發(fā)明概述本發(fā)明的實施方式提供導入具有細胞質區(qū)室(cytoplasmic compartment)和包膜 的原核宿主細胞中的重組DNA。該重組DNA編碼N末端蛋白運載體，所述N末端蛋白運載體 將融合到該運載體的感興趣的蛋白從細胞質區(qū)室運輸?shù)桨?，其中編碼的蛋白運載體包括膜靶向肽、細胞質親和結合結構域和跨膜區(qū)段。編碼蛋白運載體的DNA優(yōu)選與編碼感興趣 蛋白的DNA融合。在一個實施方式中，編碼的膜靶向肽特征是對于21的窗口大小至少1.52的 Goldman-Engelman-Steitz (GES)疏水性分數(shù)。在另外的實施方式中，編碼的膜靶向肽和編 碼的跨膜區(qū)段——它們可以彼此不同——然而具有21個氨基酸的氨基酸窗口，以便在21 個氨基酸窗口內存在缺少Asp、Glu、Arg和Lys的至少9個氨基酸的疏水核心序列。在另外 的實施方式中，膜靶向肽是YidC依賴性的。YidC依賴性肽的實例是PVIII、Pf3外殼和亞基 C變體L31F。在另外的實施方式中，跨膜區(qū)段的21個氨基酸窗口在N末端側翼是這樣的氨 基酸序列，所述氨基序列包含總電荷為至少+1的至少9個氨基酸。另外，跨膜區(qū)段在C末 端側翼可以是氨基酸連接序列，其可以含有信號肽酶切割位點。氨基酸連接序列可以 含有 異源蛋白酶切割位點。編碼的跨膜區(qū)段可以是信號肽酶的TM2。在本發(fā)明的實施方式中，細胞質親和結合結構域是糖結合結構域，例如殼多 糖_結合結構域或His標記和str印標記。在本發(fā)明的實施方式中，提供包含膜靶向肽、細胞質親和結合結構域和跨膜區(qū)段 的融合蛋白。融合蛋白可以另外包含感興趣的蛋白。例如，感興趣的蛋白可以是膜蛋白或 毒蛋白，如重組限制性內切核酸酶，如Sau3AI或其同切點酶。在本發(fā)明的實施方式中，提供在革蘭氏陰性菌宿主細胞中產生重組蛋白的方法， 該方法包括獲得編碼蛋白運載體的重組DNA，所述蛋白運載體特征如上并且融合到編碼感 興趣蛋白的DNA，以及用該DNA轉化宿主細胞。重組蛋白可以通過將細胞質親和結合結構 域結合到親和性底物(基底)從宿主細胞純化。親和性底物可以用于檢測、純化和/或測 定表達的感興趣蛋白的量。也可以測定表達的感興趣蛋白的酶活性。感興趣的蛋白實例包 括Sau3AI和BfuCI。在感興趣的蛋白含有半胱氨酸而不需要二硫橋的情況下，宿主細胞因 dsbA基因中突變而優(yōu)選具有DsbA—表型。在本發(fā)明的實施方式中，提供包含SEQ ID NO 23的核苷酸序列631-1986的DNA。在本發(fā)明的實施方式中，提供在上面所述Sau3AI或其同切點酶的同源甲基化 (cognate methylation)不存在的情況下產生限制性內切核酸酶的方法。另外提供包含上 述重組DNA的載體。也提供用載體轉化的宿主細胞。附圖簡述圖1顯示PhoAl位于細胞質中的pVIII-PhoAl融合蛋白的膜拓撲結構。圖2顯示pVIII-TM2的膜拓撲結構，其中感興趣的蛋白被輸出到周質。(“TM2”是 任何跨膜區(qū)段的縮寫。)圖3顯示pVIII-8His的膜拓撲結構，其中感興趣的蛋白位于pVIII和融合連接 (fution junction)之間。圖4顯示證明各種膜靶向肽表達的抗pVIII免疫印跡。pVIII-P2是對照融合蛋 白，其表達自親代表達克隆PVIII-P2。( “P2”是感興趣的蛋白的縮寫)。pVIII-8His含 有細胞質八個組氨酸親和標記。PVIII-CBD含有細胞質殼多糖-結合結構域(CBD)親和標 記。在不添加IPTG(-)的情況下，檢測不到蛋白，這證實了 IPTG誘導型表達對照具有所有 PMS119衍生質粒。泳道(M)含有生物素化的蛋白梯(CellSignaling Technology#7727S, Beverly, MA)，其通過抗生物素、HRP連接的抗體來檢測。
圖5顯示pVIII-CBD的膜拓撲結構。圖6顯示pVIII-CBD-PhoA9融合蛋白的膜拓撲結構。圖7顯示pVIII-CBD-Oxalp融合蛋白的膜拓撲結構，其中Oxalp是真核膜蛋白。圖8顯示pVIII-CBD-0xa8His融合蛋白的膜拓撲結構。圖9顯示VIII-CBD-Ek_0xa8His融合蛋白的膜拓撲結構。圖10顯示pVIII-CBD-TeV-0Xa8HiS融合蛋白的膜拓撲結構。(“His”是用于親和 結合的組氨酸肽的縮寫。“Tev”是煙草蝕刻病毒的縮寫)。圖11A顯示抗pVIII單克隆抗體用于鑒定純化的pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His融 合蛋白的免疫印跡。這樣來制備用于電泳的所有樣品添加SDS樣品緩沖液(NewEngland Biolabs, Inc. (NEB) #B7703S, Ipswich MA)，然后在 37°C下加熱 5min。泳道(M)含有生物素化的蛋白梯(CellSignaling Technology#7727S,Beverly, MA)，其通過抗生物素、HRP連接的抗體來檢測。泳道(m)加載有在與n-十二烷基-0 -D-麥芽糖苷(DDM)完全溶解之前的膜制備 物樣品。泳道(L)顯示在DDM溶解和通過離心去除不溶性物質后加載樣品的組成。泳道(ft)顯示在與加載樣品溫育后鎳-NTA樹脂上清液(流通)的組成。泳道(el)顯示在添加含400mM咪唑的80 y L洗脫緩沖液后洗脫的蛋白。泳道(e2)顯示第二個80 y L洗脫餾分的組成。箭頭表示純化的 pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His蛋白，其具有62247道爾頓的計算分子量。圖11B顯示抗FLAG單克隆抗體用于證實pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His融合蛋白純化 的免疫印跡。圖11A的泳道描述適用于圖11B。箭頭表示純化的pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His 蛋白，其具有62247道爾頓的計算分子量。圖12A和12B是顯示不同構建物的PhoA活性(圖12A)和每個表達單位的PhoA 活性(圖12B)的表。將DHB4細胞在30°C生長并且用ImM IPTG誘導lhr，以表達示例的融
合蛋白。
圖13顯示融合到真核膜蛋白(Oxalp)的突變體亞基C Foc(L31F)的膜拓撲結構。
圖14顯示 pVIII-PhoAl 序列5606bp(SEQ ID NO :1)。
圖15顯示 pVIII-EcoRI 序列4229bp(SEQ ID NO 2)。
圖16顯示 PVIII-TM2 序列:4415bp(SEQ ID NO 3)。
圖17顯示 pVIII-8His 序列:4415bp(SEQ ID NO :4)。
圖18顯示 pVIII-CBD 序列4580bp(SEQ ID NO 5)。
圖19顯示 pVIII-CBD-PhoA9 序列5957bp(SEQ ID NO 6)。
圖20顯示 pVIII-CBD-Oxalp 序列5662bp(SEQ ID NO 7)。
圖21顯示 pVIII-CBD-0xalp-8His 序列5686bp(SEQ ID NO 8)。
圖22顯示 pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His 序列5716bp(SEQ ID NO :9)。
圖23顯示 pVIII-CBD-Tev-0xalp-8His 序列5710bp(SEQ ID N0:10)。
圖24顯示 F。c(L31F)-PhoA9 序列5657bp(SEQ ID N0:11)。
圖25顯示 F。c(L31F-10His)-PhoA9 序列5687bp(SEQ ID NO: 12)。
圖26顯示用于包膜靶向的不同種類N末端蛋白運載體的圖。(1)相應于膜靶向肽，其延伸穿過膜進入細胞質和任選地進入細胞外空間。(2)相應于細胞質蛋白結構域，其 中蛋白結構域能夠結合親和性底物。(3)相應于跨膜區(qū)段(TM2)，TM2經由抗蛋白酶細胞質 肽⑶連接到親和結合結構域。感興趣的蛋白是(4)。細胞外表位是(5)。(9)是任選含有 信號肽酶(SPase)切割(裂解)位點(7)或異源蛋白酶切割位點(6)的連接序列。圖26A顯示(4)粘連在細胞質外的空間中。圖26B顯示⑷最后可以在位于(5)和⑷之間的切割位點(6)處從(5)體內切 割。這需要以調節(jié)或組成型方式表達分泌到周質中的異源蛋白酶的菌株。靶向周質的異源 蛋白酶進行的體內切割可以涉及例如，腸激酶(Ek)或煙草蝕刻病毒(Tev)。圖26C顯示粘附至(5)的⑷最后可以在(3)和(5)之間的SPase識別序列(7) 處切割，留下連接到感興趣蛋白(4)的細胞外表位。宿主細胞本身含有SPase，因此體內切 割是組成型的。圖26D顯示蛋白融合體，其中SPase在缺乏(5)的情況下在(3)和(4)之間于(7) 處直接切割。圖27A和27B顯示基因融合體，其結合有蛋白跨膜輸出所期望的元件，其中 pVIII-CBD載體可以用于感興趣蛋白的輸出以及通過大腸桿菌SPase的組成型切割而釋放 入周質中。圖27A顯示pVIII構建物的載體圖。其包括選擇的啟動子(Ptac)、編碼膜靶向肽 (pVIII)的DNA、編碼親和結合蛋白(CBD)的DNA、編碼TM2的DNA、任選的SPase位點、任選 的編碼表位(FLAG)的DNA、任選的編碼蛋白酶切割位點(Ek)的DNA和編碼感興趣蛋白的 DNA。圖27B顯示克隆策略的線性圖，其中輸出的蛋白在大腸桿菌SPase體內切割后可 以與N末端FLAG表位一起表達。將pVIII-CBD載體的這種修飾稱為pVIII-CBDspEk。縮寫 “sp”表示SPase位點?？s寫“Ek”表示包含F(xiàn)LAG表位(DYKDDDDK) (SEQ ID NO 13)和相應 的腸激酶蛋白酶切割位點(DDDDK) (SEQID NO 14)。圖28A-C顯示大腸桿菌中Sau3AI的克隆和輸出策略。圖28A 具有圖26C中顯示的構型的SPase切割后的Sau3FLAG(SEQ IDN0 17)。圖28B 具有圖26D中顯示的構型的SPase切割后的Sau3Ala(SEQ ID NO 18)。圖28C 具有圖26D中顯示的構型的SPase切割后的Sau3Met (SEQ ID NO 19)。圖29顯示Sau3AI輸出。在SPase切割后期望的蛋白質量是58656道爾頓。在 SPase切割后，獲得融合至FLAG的Sau3AI蛋白，如使用抗FLAG M2通過FLAG表位免疫印跡 所檢測，其中 N 末端氨基酸是 AYEPFQIPSGSDYKDDDDKGSESYL. ... (SEQ ID NO: 17)。圖30顯示Sau3AI在非甲基化酶保護的大腸桿菌dsbA—宿主MB68中的表達。 DNA底物是T7基因組DNA(6個GATC位點)。在SPase切割后，Sau3AI蛋白的N末端是 AESYL. ... (SEQ ID NO: 18)。重復試驗的結果顯示在所標記的泳道a和b中。左側泳道是 大小標記物，而右側泳道是BfuCI的消化產物，其充當對照。圖31顯示Sau3AI在大腸桿菌dsbA_突變體中的表達。在SPase切割后，蛋白具
有N末端AESYL......(SEQ ID N0:18)。標記泳道并且每個樣品重復四次。從左至右，使
用6個單位的純化酶在37°C下顯示底物切割的結果，并且BfuCI酶充當對照。dsbA—標題表示蛋白表達在菌株MB68中進行而標題dsbA+表示蛋白表達在野生型(wt) dsbA菌株DHB4 (MB68的同基因親代株)中進行。每個泳道顯示用2 μ 1細胞裂解物或 2μ1稀釋的細胞裂解物消化IygA噬菌體基因組DNA的結果。因此4個泳道的每一組表 示2倍連續(xù)稀釋系列。標題中的溫度表示培養(yǎng)物生長暈(outgrowth)溫度，而濃度表示用 于誘導Sau3AI表達的最終IPTG濃度。在Sau3AI誘導期期間將所有培養(yǎng)物變?yōu)?0°C。右 側泳道是BfuCI消化的產物，其充當對照。圖32顯示在dsbA-大腸桿菌菌株MB68中使用pVIII-CBDsp進行的wt Sau3AI輸 出。Sau3AI表達自克隆135D或145A。底物是1 μ g T7基因組DNA(6個GATC位點)。在
SPase切割后，Sau3AI具有MESYL.......(SEQ ID NO 19)的N末端序列。顯示了具有兩種
不同克隆的結果。最左側泳道是Ikb標記物(NEB，Ipswich, ΜΑ)。最右側泳道是BfuCI消 化對照。顯示了每個克隆裂解物的兩倍連續(xù)稀釋。每一系列泳道表示細胞裂解物的2-倍 連續(xù)稀釋(以2 μ 1未稀釋的裂解物開始)所產生的反應。圖33顯示在dsbA-大腸桿菌菌株ΜΒ68中使用pVIII-CBDsp進行的BfuCI輸出。底
物是T7基因組DNA (6個GATC位點)。在SPase切割后，BfuCI的N末端是VFETE.......(SEQ
ID NO 20)。最右側泳道是BfuCI對照消化。圖 34 顯示 pVIII-CBD-Ek-Pho 18DNA 序列(SEQ ID NO :21)。圖 35 顯示 pVIII-CBD-sp-Ek DNA 序列(SEQ ID NO 22)。圖 36 顯示 pVIII-CBD-sp-BfuCI DNA 序列(SEQ ID NO 23)。實施方式詳述本發(fā)明的實施方式提供用于表達異源膜蛋白(感興趣的蛋白)并且將異源膜蛋白 (感興趣的蛋白)運輸?shù)絻饶ひ约皩ǘ镜鞍自趦鹊漠愒纯扇苄缘鞍啄ひ孜坏剿拗骷毎?周質的方法和組合物。該方法包括表達編碼N末端蛋白運載體的DNA，所述DNA融合到編碼 感興趣蛋白的DNA。表達的融合蛋白表達在細胞質中并且以YidC依賴性和/或SRP-依賴 性方式靶向內膜。組合物包括重組DNA，其編碼N末端蛋白運載體和感興趣的蛋白。N末端蛋白運載 體優(yōu)選包括膜靶向肽、細胞質親和結合結構域和跨膜區(qū)段。另外，N末端蛋白運載體可以含 有SPase位點，以便SPase的體內剪切釋放可溶性的感興趣蛋白或釋放融合的感興趣的膜 蛋白。另外地或可選地，N末端蛋白運載體可以包括異源蛋白酶位點如Tev蛋白酶切割位 點或腸激酶切割位點，以體內或體外切割和釋放感興趣的蛋白。基因工程DNA的表達發(fā)生在適于表達感興趣的蛋白的宿主細胞中。例如，毒性可 溶性蛋白優(yōu)選在dsbA_宿主細胞中表達，所述毒性可溶性蛋白含有半胱氨酸并且對于折疊 和活性不需要二硫鍵。使用上述方法的實施方式，毒性限制性內切核酸酶成功地表達并且 以活性形式輸出到周質(不用保護基團如胞嘧啶或腺嘌呤甲基化修飾宿主基因組DNA)而 對宿主細胞沒有毒性作用。感興趣的蛋白“感興趣的蛋白”指用于整合在宿主細菌細胞內膜中或用于跨內膜易位到周質空間中的期望的重組蛋白。感興趣的蛋白實例包括DNA代謝酶，其不利地影響宿主細胞生存力(例如限制性 內切核酸酶)和其它細胞毒蛋白；蛋白酶，其影響宿主細胞生理(例如，ATP-依賴性蛋白 酶)；蛋白質，其正常分泌在自然宿主中，但其中表達和輸出在大腸桿菌中是未知的(例如來自木薯單孢萎蔫病(Xanthomonas manihotis)的α-1，3_半乳糖苷酶)；以及蛋白質，其 當在細胞質中表達時易于形成聚集/包含體(例如，外周膜蛋白和正常存在于多蛋白復合 體中的蛋白)。這些蛋白質常常具有疏水性蛋白-相互作用表面，其當單獨表達蛋白而沒有 其伴侶時引起聚集。當靶向內膜表面時，這些蛋白可以更穩(wěn)定地表達。將這種蛋白錨定于 內膜可以有助于融合蛋白的穩(wěn)定表達。感興趣的蛋白在此實例是Ρ2、多起源(polytopic)整合膜蛋白Oxalp或分泌的蛋 白PhoA以及還有毒性限制性內切核酸酶Sau3AI和BfuCI。宿主細胞
表達融合蛋白的宿主細胞優(yōu)選是革蘭氏陰性菌，如具有包膜的大腸桿菌。(“包膜” 指在細胞質空間和細胞外環(huán)境之間形成屏障的細菌細胞結構。其一般包括細菌的內膜和周 質)。宿主細胞優(yōu)選是DsbA_表型——如果蛋白質具有半胱氨酸但對于折疊和活性不需要 二硫鍵。例如，Sau3AI含有3個半胱氨酸并且當在wt dsbA菌株中表達入周質時無活性， 而當在缺少周質DsbA的菌株(DsbA_)中表達入周質時有活性。限制性內切核酸酶BfuCI (2 個半胱氨酸)當在DsbA_宿主細胞中表達到周質時有活性。盡管不希望受理論的限制，但我們認為pVIIICBD-PhoA膜-靶向肽依賴于大腸桿 菌宿主細胞中的信號識別顆粒。這使用含有wt信號識別顆粒組分Ffh (ffh基因編碼的54 同源物)的細胞或突變Ffh (從ffh77等位基因表達的蛋白突變體Ala37Pro)細胞(Tian等 (J Bacteriol. 184(1) :111_8 (2002))和 Huber 等(J Bacteriol. 187(9) :2983_91(2005) 報道的突變)來證明。我們用ffh77突變構建了 MC1061衍生物，以檢查pVIII_CBD N末 端蛋白運載體的 SRP-依賴性。MC1061(ffh77)使用 Hamilton 等(JBacteriol. 171(9) 4617-22 (1989))描述的等位基因交換方法衍生自MC1061。當pVIII-CBD-Ek-PhoA18使用同 樣的條件在MC106l(wtffh)和MC1061(ffh77)細胞中表達時，ffh77細胞中PhoA活性(1120 單位)發(fā)現(xiàn)僅僅是wt ffh細胞中表達水平(2860單位)的39%，這表明pVIII-CBD-介導 的PhoA輸出利用共翻譯SRP途徑。膜靶向肽如本文所用，“膜靶向肽”指促進重組蛋白靶向內膜進行整合或膜易位的蛋白質、 多肽、肽、區(qū)段或結構域。膜靶向肽可以根據其在膜中的拓撲結構來描述。例如，指原核或真核蛋白拓撲結 構的術語“N-out，，含義是，該蛋白的N末端在含有該蛋白的膜的外部或從含有該蛋白的膜 向外部突出。(細菌中N-out位置是周質空間。)膜靶向肽在共翻譯過程中被信號識別顆粒識別。這避免了向細胞質中釋放易聚集 的疏水區(qū)段。本文使用的膜靶向肽根據下面所限定的疏水性從天然或合成蛋白質選擇。本 文通過 GES 模型(Engelman 等 Annu. Rev. Biophys. Chem. 15 :321_353 (1986))來計算疏水 性。該計算可以使用 TopPred 算法(http://mobyle.pasteur.fr/cgibin/MobylePortal/ portal, py ？ form = toppred) (Claros 等 CABIOS 10 :685_686 (1994))來完成。經發(fā)現(xiàn)， 膜靶向肽特征在于21個氨基酸窗口(amino acid window)，其中存在缺少Asp、Glu、Arg和 Lys的至少9個氨基酸的疏水核心序列。使用該21個氨基酸的窗口，將GES疏水性分數(shù)賦 值給膜靶向肽。GES分數(shù)優(yōu)選大于1.521 (全部窗口大小為21)。如本文所用，“窗口”指可 以通過計算機算法來鑒定的一段連續(xù)的氨基酸序列，該計算機算法被設計來檢索特定長度的序列。這些膜靶向肽的實例是pVIII或在寡聚化中有缺陷的FlFo ATP合成酶亞基C的突 變體(F0c) (Kol 等 J.Biol. Chem. 281 :29762_29768 (2006))或 Pf3 外殼蛋白(Thiaudiere^ Biochemistry 32(45) 12186-96 (1993))。對于膜裝配，這些蛋白依賴于YidC并且形成跨 膜區(qū)段(Chen 等 JBiol Chem 277(10) :7670_5 (2002) ；Samuelson 等 JBiol Chem. 276 (37) 34847-52(2001))。pVIII蛋白是基因Vlll(gVIII)表達的M13噬菌體的主要外殼蛋白。pVIII已經 進化成作為M13噬菌體生物發(fā)生過程的一部分而有效地插入到大腸桿菌的內膜中。pVIII 的前體形式(Procoat) (ThiaudiSre 等 Biochemistry 32(45) 12186-96 (1993))是 73 個氨 基酸，而成熟的外殼蛋白是50個氨基酸。pVIII前體形式在插入到內膜后被細菌的SPase 切割。前體pVIII蛋白優(yōu)選插入在具有N-in、C_in拓撲結構的膜中。(“In”指細胞質 位置，而對于革蘭氏陰性細胞中的這種蛋白，“out”指周質位置?！巴負浣Y構”指組成天然或 合成膜的脂雙層中的取向)。pVIII膜靶向肽或其突變體或衍生物優(yōu)選含有疏水區(qū)(ThiaudiSre等 Biochemistry 32(45) 12186-96 (1993)中所提供的 pVIII 前體形式的殘基 44-64)，所述 疏水區(qū)已經被賦值1. 801的GES疏水性分數(shù)，(對于SRP-依賴性DsbA信號序列，明顯高于
1.52的閾值)。因此，pVIII膜靶向肽被大腸桿菌信號識別顆粒所識別，這促進感興趣的融 合膜蛋白的膜整合或幫助可溶性蛋白的膜易位。本發(fā)明的實施方式優(yōu)選使用具有N-out拓撲結構的感興趣的異源膜蛋白。在這些 情況下，N末端蛋白運載體的C末端優(yōu)選在細胞質外。因此，使用標準技術設計和構建了一 系列靶向膜的構建物，其中使用細菌的SPase蛋白的區(qū)段來延伸pVIII (參見實施例2_4，圖
2、3、5)。該區(qū)段優(yōu)選包括SPase細胞質環(huán)的一部分以及第二TM2加延伸到周質中的多個氨 基酸。在pVIII-CBD-PhoA9融合蛋白的表達時，在實施例5中證明了 SPase TM2為有效的 輸出信號，其中在通過SPase TM2調節(jié)(介導)跨內膜易位后，PhoA結構域是有活性的。C-out修飾的pVIII膜靶向肽命名為pVIII-TM2(圖2)。在SPase切割后，pVIII 的成熟形式在具有N-out、C-in拓撲結構的膜中保持其位置。當感興趣的膜蛋白融合到突入周質中的跨膜區(qū)段的C末端時，感興趣的膜蛋白指 N-out膜蛋白。感興趣的“N-out”蛋白可以通過可讀框(ORF)誘變產生用于表達重組融合 蛋白的、融合到N末端蛋白運載體ORF的突變重組基因來衍生自感興趣的“N-in”蛋白。例 如，可以構建重組融合蛋白0RF，以便感興趣的蛋白的天然信號肽被編碼本文描述的膜靶向 肽之一的ORF所替換。在本發(fā)明的實施方式中，提供產生具有正確拓撲結構的N-out真核 膜蛋白的方法，其通過作為融合蛋白來表達這樣的蛋白進行，其中融合連接位于大腸桿菌 周質中(參見例如，實施例6-9，圖7-10)。這和直接融合到膜靶向肽如pVIII C末端的蛋白或結構域不同(圖1)。在這些 情況下，一旦融合蛋白的膜裝配后，融合連接便在細胞質中。例如，通過將PhoA報道結構域 基因序列連接到pVIII ORF下游的EcoRI位點中來構建pVIII-PhoAl (pVIII細菌堿性磷酸 酶1)。融合蛋白PVIII-PhoAl (圖1)的表達在細菌宿主細胞中是強烈的并且可以通過使 用PhoA單克隆抗體(Sigma，St. Louis,MO)來檢測。發(fā)現(xiàn)這些細胞中PhoA活性是可以忽略的，這證明PhoA結構域如所期望的那樣是在細胞質中。僅當輸出到周質后Dsb系統(tǒng)形成需 要的二硫鍵時，PhoA功能上才有活性。將感興趣的重組真核膜蛋白輸送到宿主細菌內膜的N末端蛋白運載體可以包括 YidC依賴性ATP合成酶亞基C變體(F。c L31F)，其具有C末端突入周質中的兩個跨膜區(qū)段。 C末端可以融合到感興趣的靶標膜蛋白。其任選融合到C末端處的標記。親和標記可以插 入亞基C變體兩個跨膜區(qū)段之間的細胞質區(qū)域中(圖13)。細胞質親和結合結構域N末端融合伴侶中適合的細胞質蛋白-結合結構域包括糖結合結構域如殼多糖_結合結構域、纖維素_結合結構域和麥芽糖_結合結構域 ’聚_組氨酸標記、Strep標 記和適應于細胞質表達的任意其它蛋白標記。我們已經發(fā)現(xiàn)，將親和標記添加到N末端融合伴侶的細胞質環(huán)，不干擾膜裝配(圖 3-6，實施例5-9)。例如，pVIII-TM2中的SPase-細胞質環(huán)部分被任意親和標記或檢測結構域如 CBD(圖5)或His標記(圖3)所替換。在圖3中，pVIII_TM2在SPase的35-42位置處于 被突變從而在細胞質環(huán)中編碼一段八個組氨酸的序列。PVIII-SHiS和pVIII-CBD有效的膜 裝配使用單克隆抗體通過免疫印跡方法來證實，所述抗體在SPase體內膜插入和加工后優(yōu) 選識別PVIII的成熟N末端(圖4)。在另外的實例中，pVIII-CBD顯示，調節(jié)PhoA9蛋白向大腸桿菌周質的易位。融合 蛋白pVIII-PhoA9的表達(圖6)在細菌宿主細胞中是強烈的并且可以通過使用PhoA單克 隆抗體來檢測或通過進行磷酸酶測定來測量(圖12)—一因為二硫鍵形成激活周質PhoA結 構域?？缒そY構域“TM2”是具有限定的拓撲結構的任何跨膜區(qū)段的一般術語。對于21個氨基酸的氨 基酸序列窗口，該區(qū)段優(yōu)選包含缺少Asp、Glu、Arg和Lys的至少約9個氨基酸的核心序列， 并且21個氨基酸窗口在N末端側翼是包含具有至少+1總電荷的至少約9個氨基酸的氨基 酸序列?？缒そY構域的N末端優(yōu)選位于細胞質中并且連接到細胞質親和結合結構域?？缒?結構域的C末端可以在某些情況下具有凈負電荷?？缒^(qū)的C末端可以經由氨基酸連接序 列連接到感興趣的蛋白。連接氨基酸序列可以含有SPases和/或異源蛋白酶的切割位點。 連接體的組成和切割位點顯示在圖26和27中。在一個實例中，使用大腸桿菌SPase識別序 列。大腸桿菌SPase識別依賴于位于內膜中的TM區(qū)段以及也依賴于對于切割點在_3和_1 處的松弛型氨基酸共有序列(Nielsen等Protein Eng. 10(1) 1-6 (1997)) 在-3和-1處 最經常發(fā)現(xiàn)丙氨酸，但可以被其它小的中性側鏈所取代。當脯氨酸存在于+1處時，SPase活 性可能被抑制(Barkocy-Gallagher 等 J Biol Chem. 267 (2) :1231_8 (1992))。然而，根據 對SPase功能的體內研究，在+1處的任意氨基酸均是可接受的(除脯氨酸外)(Dalbey等 Protein Sci.6(6) :1129-38(1997))。如果干擾TM2序列被并入pVIII和感興趣的蛋白之間，則感興趣蛋白的N末端區(qū) 域將易位到周質空間中(圖2)。切割位點在本發(fā)明的實施方式中，切割位點或位點已經被改造入融合蛋白。改造的蛋白酶切割位點此處顯示不干擾膜裝配。證明這的實例包括具有在PVIII細胞質C末端改造的 切割位點的融合蛋白；以及突入周質的第二 TM2的C末端處的位點(Ek、Tev和/或SPase)。 因此，這能夠從膜靶向肽釋放感興趣膜蛋白(被靶向的膜蛋白)的N末端。融合蛋白的蛋 白酶消化可以在體外或體內完成。m^r.為了表達的感興趣蛋白的抗體檢測，可以并入的可能的表位實例很多。例如，可以 使用抗CBD單克隆抗體和抗CBD血清(NEB，Ipswich ΜΑ)來檢測并入的CBD。用于多-His 檢測的抗體產品可以商業(yè)獲得。成熟PVIII融合蛋白的極N末端的識別可以用pVIII單克 隆抗體 B62-FE2 進行(Progen Biotechnik GmbH, Heidelberg Germany)，以評價全長蛋白 的表達(Kneissel等J. Mol. Biol. 288 :21-28 (1999))。適合細胞外表位是抗FLAG抗體可 以識別的 FLAG (Sigma, St. Louis, MO)。N末端蛋白運載體pVIII-CBD融合伴侶對于表達膜蛋白的有效性可以通過在細菌宿主中測定來確 立，該在細菌宿主中內源YidC表達被抑制并且在缺乏補體蛋白的情況下影響生存力(van Bloois 等 J. Biol Chem 280 :12996_13003 (2005))。在測定中，補體蛋白此處由 Oxalp提供， 其作為與pVIII-CBD N末端蛋白運載體的融合體表達。Oxalp是真核膜蛋白，為YidC的功 能同源物以及發(fā)現(xiàn)于真核細胞的線粒體內膜中。只有當Oxalp融合體正確表達和插入細菌 內膜中時，該細菌才可以存活。圖7-10顯示以有功能形式表達并且插入大腸桿菌內膜中的 融合蛋白的圖。這些結果例證了 pVIII-CBD融合伴侶對異源膜蛋白表達的效用。融合蛋白純化可以采用使用親和標記來結合在樹脂、珠(包括磁性珠)或本領域已知的基質上 顯示的固定底物進行融合蛋白純化的方法，以純化表達的膜蛋白。分離感興趣的膜蛋白也可能需要通過蛋白酶消化(例如，腸激酶)來去除pVIII 或亞基C變體膜靶向肽。在偶聯(lián)到不同于第一親和標記的第二親和標記的(PVIII)-(親和 標記)-(蛋白酶底物序列)-(膜蛋白)體外消化后，可以通過將混合物過柱或使用磁性珠 分離消化的融合蛋白。細胞質環(huán)中的親和標記可以用于融合蛋白純化(在缺乏SPase位點的構建物中)。 在表達的TM2后有SPase位點的融合蛋白中，可以使用pVIII序列和TM2之間的細胞質環(huán) 中的親和標記，以去除未加工的融合蛋白。例如，在SPase輸出和釋放感興趣蛋白的應用 中，期望輸出通路和SecYEG蛋白移位酶飽和后，一些未加工的全長融合蛋白可以保留在細 胞質中。在這種情況下，可以采用N末端融合伴侶(例如pVIII-CBD)中的親和標記，以從 復合細胞裂解液中感興趣的可溶性蛋白去除非期望的融合蛋白。pVIII-CBD-sp融合體的輸出通過SDS-PAGE分析容易進行監(jiān)測——因為SPase的體內切割去除19kDa pVIII-CBD N末端伴侶。相反，通過SDS-PAGE監(jiān)測典型的信號肽切 割常常因天然信號肽的較小的大小(例如18-27個氨基酸)而存在問題。使用大腸桿菌 SPase來體內切割過表達的融合蛋白是新穎的并且消除對昂貴的和常常存在問題的體外蛋 白酶加工步驟的需求。蛋白的表達可以使用編碼N末端蛋白運載體，如pVIII-CBD、pVIII-8His和FoC突變體L31F的DNA——其融合到編碼感興趣蛋白DNA，來通過使用本文描述的系統(tǒng)表達許多真核和原核蛋白。


了本發(fā)明實施方式的各個方面。圖1-10描述如下膜靶向肽，其并入到細菌宿主內膜中，其中膜靶向肽和靶標膜蛋白之間的融合連 接位于細胞質中(圖1)；第二蛋白的第二跨膜區(qū)段(TM2)在其C末端處融合到感興趣的膜蛋白或感興趣 的可溶性蛋白，其中膜靶向肽C末端和感興趣的蛋白的N末端之間的融合連接位于周質中 (圖2)。CBD或His標記示例的親和標記可以并入第一和第二 TM區(qū)段之間(圖3、5、6、7、 8、9和10)。另外的親和標記可以在靶標膜蛋白C末端處融合到靶標膜蛋白(圖8、9、10)。表達有膜靶向肽的改造的融合蛋白的實例包括pVIII-PhoAl (細胞質融合)； pVIII-TM2(添加來自SPase的TM2以將C末端延伸到周質)；pVIII-CBD(細胞質CBD)； pVIII-CBD-PhoA9(細胞質 CBD，周質 PhoA) ；pVIII_8His (細胞質 8His) ；pVIII-CBD-Oxalp ； pVIII-CBD-0xalp-8His ；pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His ；pVIII-CBD-Tev-0xalp-8His ；wt C-PhoA9 ；G23D 亞基 C-PhoA9 ；L31F 亞基 C_PhoA9 ；以及 L31F 亞基 C (IOHis) _PhoA9。這些衍 生自表達克隆 pVIII_P2(在 Samuelson 等 J. Biol. Chem. 276 :34847_34852 (2001)中稱為 Procoat-Lep)。存在制備DNA融合體的多種不同方法，所述DNA融合體編碼蛋白表達構建物。此處 描述的方法意圖不受限制。該方法包括介質拷貝PMS119質粒，其含有IPTG可誘導的Ptac 啟動子和IacIq基因(Furste等Gene 48:119—131(1986))。任何可誘導的蛋白表達載體 可以通過并入本文描述的任意N末端蛋白運載體的核苷酸_編碼序列來使用。例如，該方 法可以含有T7啟動子和IacI基因，以用于表達T7RNA聚合酶的許多宿主菌株之一中。這 些表達構建物編碼M13基因VIII 5’非翻譯區(qū)(M13噬菌體基因組的位置1250-1300)，以給 細菌宿主細胞中蛋白表達提供有效的Shine-Delgarno序列。5’ -GTGCCTTCGTAGTGGCATTACGTATTTTACCCGTTTAATGGAAACTTCCTC-3’ (SEQ ID NO: 24)有下劃線的為基因VIII Shine-Delgarno序列。應該注意的是，可以使用具有大 腸桿菌Shine-Delgarno序列的任何5’非翻譯區(qū)，以啟動細菌宿主細胞中pVIII融合或亞 基C融合蛋白表達。本文引用的所有文獻，以及2007年8月21提交的美國臨時申請60/965，649和 2007年8月22提交的60/965，729通過引用而并入。
實施例下列細菌菌株用于本實施例中。質粒DNA的克隆和繁殖發(fā)生在NEB 10_β_感 受態(tài)大腸桿菌中(NEB#C3019H，Ipswich MA)。NEB 10-β菌株的基因型是fhuAmcrA f80dlacZDM15 DlacX74 endAl recAlaraD139 D(ara, leu)7697 galU galK rpsLnupG D(mrr-hsdRMS-mcrBC)。DHB4 用于堿性磷酸酶(PhoA)測定(Jander 等 J. Bacteriol. 178 3049-3058 (1996))。MB68 是具有 dsbA 基因剔除的 DHB4。JS7131 用于 YidC-互補測定(Samuelson 等 Nature 406 :637_641 (2000))。MC1061 用于蛋白表達(Casabadan 和 Cohen J. Mol. Biol. 138 179-207 (1980))
MG1655用作大腸桿菌基因克隆的基因組DNA源(Blattner等Science277 1453-74(1997))。縮寫P2指大腸桿菌SPase的可溶性P2結構域。信號肽酶縮寫為L印或SPase。實施例1 質粒DVIII-PhoAl的構建從質粒pVIII-P2 構建質粒 pVIII-PhoAl (圖 14)。用 EcoRI 消化 pVIII_P2 以切 除 P20RF。剩余的載體片段 pVIII-EcoRI(圖 15)用 Antarctic 磷酸酶(NEB，IpswichMA)處 理，以準備連接PhoA基因片段。引物344-112和344-113用于從MG1655基因組DNA擴增 PhoA報道基因。MfeI克隆位點用下劃線表示引物 344-1135， -CCACCACAATTGGTCCTGTTCTGGAAAACCGGGCTG-3>(SEQ ID NO:25)引物 344-1145，-CCACCACAATTGCCGGCAGCGAAAATTCACTGCC-3，(SEQ ID NO :26)。PhoA基因的PCR擴增根據推薦的熱循環(huán)條件用Phusion高保真性DNA聚合酶 (NEB#F-540S, Ipswich ΜΑ)來完成。PhoA 基因片段用 MfeI (NEB#R0589S, Ipswich ΜΑ) 進行消化并且連接入pVIII載體的EcoRI位點中。對連接克隆進行測序，以確證整個 pVIII-PhoAlORF。在 pVIII_P2 和 pVIII-PhoAl 蛋白融合中，pVIII 氨基酸 73 從 Ser 突 變成 Arg。在 PVIII-P2 融合蛋白中，連接區(qū)是 Arg73-Gly-Ile-Arg(SEQ ID N0:27)，其符 合 Furin 蛋白酶識別序列Arg-X-X-Arg (SEQ ID NO 28) (NEB#P8077S, Ipswich ΜΑ)。在 pVI I I-PhoAl 中，氨基酸連接序列是 Arg73-Gly-Ile-Gly(SEQ ID NO :27)，其就在 PhoA 的 Pro6之前。該連接體可以被改變來包括蛋白酶識別位點。例如，連接序列可以包括Furin 的Arg-X-X-Arg(SEQ ID NO 28)識別序列，以能夠從感興趣的蛋白體外去除pVIII靶向肽。 原則上，任何蛋白酶識別序列可以在C末端連接到pVIII的位置處插入細胞質連接區(qū)域中， 以有助于分離感興趣的蛋白。融合蛋白pVIII-PhoAl的大腸桿菌表達(圖1)在添加IPTG后在菌株 DHB4(AphoA)中是強烈的。通過分析對硝基苯磷酸酯(PNPP)水解使用標準的方法來測量 堿性磷酸酶活性(Michaelis等J. Bacteriol. 154 :366_375 (1983))。這些細胞中報道的活 性是可以忽略的(圖12)，這表明如所期望的那樣PhoA結構域在細胞質中表達。實施例2 表達載體pVIII-TM 2的構建從質粒pVIII-P2構建表達載體pVIII_TM2(圖16)，如下使用Taq DNA聚合酶以 及引物342-239和342-240，從MG1655基因組DNA擴增大腸桿菌1印B基因(編碼SPase) 區(qū)段。有下劃線的是ApoI限制性位點342-2395 ’ -CCACCAGAATTTCGCGTCAGGCAGCGGCGCAGGCGGCT-3 ’ (SEQ ID NO :29)。342-2405 ’ -CCAGAATTCGAGGATCCTGACGGGATCTGGAACGGTTC-3 ’ (SEQ ID NO :30)。將1印B基因片段用ApoI消化并且連接到實施例1中描述的pVIII-EcoRI載體片段的相容性EcoRI位點中。通過用在Ptac啟動子(NEB#sl260s，Ipswich ΜΑ)處退火的 引物對質?？寺∵M行測序，來分析連接克隆的IepB基因片段的適當取向。克隆c含有期 望的0RF，其中pVIII被大腸桿菌SPase蛋白區(qū)段延伸。該區(qū)段(SPase氨基酸34-91)包 括部分SPase細胞質環(huán)和整個第二跨膜區(qū)段(TM2)加推測延伸入周質中的十個氨基酸。 該氨基酸區(qū)段被選擇，是因為SPase TM2的膜拓撲結構被充分證明并且SPase TM2已知是SPase周質催化結構域的有效輸出信號(von Heijne等Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 3363-3366(1988))。1印B基因片段編碼序列的末端通過將引物342-240設計成編碼BamHI 位點和EcoRI位點來進行修飾，以產生PVIII-TM20RF的符合讀框的遺傳融合。遺傳融合序 列設計在PUC19的多連接序列之后，其中BamHI/EcoRI位點編碼氨基酸SGSSNS(SEQ ID NO 31)——一種理想的柔性氨基酸連接序列。構建表達載體PVIII-TM2的最后步驟是除去緊 隨Ptac啟動子之后的BamHI識別序列將克隆c用BamHI進行部分消化，用Klenow片段填 充和被連接來以再閉合載體。具有單一 BamHI位點(在融合連接處)的最后期望的表達載 體稱為 pVIII_TM2(圖 16)。實施例3 表汰載體DVIII-8His的構建從質粒pVIII-TM2構建表達載體pVIII-8HIS(圖17)。pVIII_8HIS在細胞質環(huán)中 含有多-His序列，以能夠進行蛋白純化或免疫檢測。對PVIII-TM2進行突變以在細胞質環(huán) 中編碼一段八個組氨酸的序列(替換氨基酸QAAAQAAA(SEQ IDNO :32)，相當于SPase的位 置35-42)。這種表達的膜靶向肽稱為pVIII-SHis (圖3)，并且有效的膜裝配使用pVIII單 克隆抗體通過免疫印跡方法來證實，所述單克隆抗體優(yōu)選識別膜插入和SPase體內加工后 的PVIII的成熟N末端(圖4)。實施例4 表汰載體dVIII-CBD的構建如下所述證明了，親和性結構域被插入PVIII-TM2的細胞質環(huán)中而不干擾膜裝配。pVIII-CBD(圖5)是由表達克隆pVIII_CBD(圖18)編碼的膜靶向肽，其中CBD從 環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)獲得并且插入在pVIII_TM2的細胞質環(huán)中。使用 Phusion DNA聚合酶(NEB，Ipswich，MA)，通過反向PCR誘變來擴增表達載體pVIII_TM2，以 分離連接到CBD基因片段的載體片段。引物342-890和342-891用于擴增pVIII_TM2載體 片段。使用引物 342-888 和 342-889，從 NEB (Ipswich ΜΑ)載體 pTYBll (位置 5798-5950)擴 增CBD 0RF。兩個片段在適當取向上的平端連接導致產生CBD ORF的51個氨基酸插入在 PVIII-TM2的細胞質QAAAQAAA(SEQ ID NO :32)序列之后。實驗結果顯示，pVIII-CBD靶向蛋 白在添加IPTG后高度過表達并且大部分蛋白位于大腸桿菌膜部分(fraction)。pVIII_CBD 靶向蛋白與殼多糖樹脂(NEB#S6651S，Ipswich ΜΑ)的結合在0. 氚核Χ-100——一種在 膜蛋白純化期間使用的典型濃度的洗滌劑——存在的情況下被證實。弓丨物 342-8905，-GGCAGCCGCCTGCGCCGCTG-3，(SEQ ID NO 33)。引物 342-8915，-GGGGACTCACTGGATAAAGCAACG-3，(SEQ ID NO 34)。弓丨物 342-8885，-ACGACAAATCCTGGTGTATCCGCTTG-3，(SEQ ID NO 35)。弓丨物 342-8895，-ATGGCCACCTTGAAGCTGCCAC-3，(SEQ ID NO 36)。實施例5 :pVIII-CBD-PhoA9 的構建從表達載體pVIII-CBD構建表達克隆pVIII-CBD-PhoA9 (圖19)，以評價膜靶向 肽——pVIII-CBD——的膜拓撲結構。pVIII-CBD-PhoA9融合蛋白被設計來含有氨基酸序列YEPFQIPSGSSNC(SEQ ID NO 37)作為SPase TM2和PhoA報道結構域Pro6之間的周質 連接體。使用Phusion DNA聚合酶(NEB，Ipswich, ΜΑ)以及實施例1中描述的正向引物 344-112和反向引物344-114，UMG1655基因組DNA擴增phoA基因片段。引物 344-1125’ -CCACCACAATTGCCCTGTTCTGGAAAACCGGGCTG-3>(SEQ ID NO :38)。有下劃線的是MfeI位點。PCR擴增的phoA基因片段用MfeI進行消化并且連接到通過EcoRI消化所制備的 載體ρVIII-CBD中。在適當取向上編碼PhoA基因的克隆稱為pVIII_CBD_PhoA9。來自該克隆 的融合蛋白的表達在添加IPTG后是強烈的。用ImM IPTG在30°C下誘導pVIII-CBD-PhoA960 分鐘后，在DHB4 (AphoA)細胞中測量堿性磷酸酶活性。在該實驗中，活性被記錄為2090單 位，比pVIII-PhoAl表達的水平高59倍(圖12)。這顯示，pVIII-CBD-PhoA9融合蛋白被整 合到具有正確C-out拓撲結構的內膜中(如圖6中所顯示)——因為PhoA結構域具有活 性。實施例6 :pVIII-CBD-Oxalp的構津和Oxalp膜蛋白體內功能的證明從pVIII-CBD構建表達克隆pVIII-CBD-Oxalp (圖20)，以證明功能性真核膜蛋白 在大腸桿菌中的表達。Oxalp是自然存在于線粒體內膜中的整合膜蛋白。Oxalp發(fā)揮膜蛋 白插入酶的功能并且對于整合膜呼吸復合物的裝配是必需的(Luirink等FEBS Lett. 13 1-5(2001)。大腸桿菌的YidC整合膜蛋白是Oxalp的同源物并且在細菌膜蛋白生物發(fā)生 中具有類似的功能(van der Laan 等 Proc. Natl. Acad. Sci. USAlOO :5801_5806 (2003))。 vanBloois 等(J. Biol. Chem. 280 12996-13003 (2005))證明了，YidC-Oxalp 嵌合體能夠彌 補大腸桿菌中YidC的損失。我們創(chuàng)建了 pVIII-CBD和成熟Oxalp (缺乏N末端基質靶向 肽)之間的嵌合融合，以測試pVIII-CBD的膜靶向潛力。菌株JS7131的生長依賴于阿拉伯 糖誘導的YidC表達(Samuelson等Nature406 :637_641 (2000))。相反，提供葡萄糖作為碳 源則關閉YidC表達，并導致生存力喪失。因此，通過僅僅將轉化體涂布在含有關閉YidC表 達的葡萄糖和誘導YidC補體蛋白表達的IPTG的LB瓊脂上，來進行YidC互補研究。使用Phusion DNA聚合酶(NEB, Ipswich, ΜΑ)以及正向引物354-1110和反向 引物 354-1098，從釀酒酵母(S. cerevisiae)菌株 BY4734(ATCC#200896)擴增 oxal 基因。 反向引物354-1098含有沉默突變，以破壞oxalORF末端附近天然存在的EcoRI位點。使 用Phusion DNA聚合酶(NEB, Ipswich, ΜΑ)以及實施例2中描述的引物354-1097和引物 342-240，通過反向PCR擴增來制備pVIII-CBD載體。兩個擴增的片段都用EcoRI進行消化 并且被連接起來以創(chuàng)建表達克隆pVIII-CBD-Oxal。該表達克隆表達Oxalp (在Asn43處開 始)為與靶向蛋白pVIII-CBD的融合體，其中融合連接突入周質中(圖7)。將菌株JS7131用表達克隆pVIII-CBD-Oxalp轉化并且涂布在含0. 1 %葡萄糖的 LB瓊脂上。僅當ΙΟμΜ IPTG包括在LB-葡萄糖平板中時，才獲得轉化體。通過將來自10 μ M IPTG板的轉化體劃線到含O或10 μ M IPTG的板上，進行互補的確證。還有，僅在10 μ M IPTG 板上觀察到細胞生長。該結果顯示，JS7131生長需要pVIII-CBD-Oxalp的表達，以及當表 達為與pVIII-CBD的融合體時Oxalp發(fā)揮整合膜蛋白的功能。實施例7 :pVIII-CBD-0xalp-8His的構建和Oxalp膜蛋白體內功能的證明在表達克隆pVIII-CBD-Oxal中存在的Oxalp ORF被修飾來編碼C末端八個組氨酸序列，以有助于蛋白純化。這使用Phusion DNA聚合酶(NEB，Ipswich, ΜΑ)以及引物 358-145和358-154通過反向PCR誘變來完成。引物 358-1455’ -CACCATCACCATTGAATTCAGCTTGGCTGTTTTGGC-3’(SEQ ID NO 39)。引物 358-1545’ -ATGGTGATGGTGTTTTTTGTTATTAATGAAGTTTGATTTGTGAAC-3’(SEQ ID NO :40)。序列證實的表達克隆稱為pVIII-CBD-0Xalp-8His (圖21)。使用實施例6中描述 的YidC-互補測定來測試表達蛋白的體內功能。得出的結論是，pVIII-CBD-0xalp-8His通 過利用圖8中顯示的拓撲結構在體內起作用。實施例8 :pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His的構津和Oxalp膜蛋白體內功能的證明表達克隆pVIII-CBD-0xalp-8His中的融合蛋白ORF被修飾以編碼就在與Oxalp 的融合連接之前的Ek蛋白酶(NEB#P8070S，Ipswich ΜΑ)識別序列。這通過用BamHI消化 質粒表達克隆和連接由寡核苷酸互補對358-155和358-204組成的雙鏈插入物來完成。引物 358-1555 ’ -GATCGGACTACAAAGATGACGATGACAAAG-3’(SEQ ID NO :41)。引物 355-2045 ’ -GATCCTTTGTCATCGTCATCTTTGTAGTCC-3’(SEQ ID NO :42)。該寡核苷酸對的正確連接產生表達克隆pVIII-CBD-Ek-0Xalp-8His(圖22)。將 獨特的BamHI限制性位點保持在DNA融合連接處，以能夠克隆膜蛋白基因代替oxalp基因。 在融合連接處插入的“Ek”氨基酸序列是DYKDDDDKGS(SEQ IDNO :43)。使用實施例6中描述 的YidC-互補測定，測試表達蛋白的體內功能。pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His (圖9)顯示在體 內起作用。注意到，Ek在氨基酸序列DDDDK(SEQ ID NO 14)之后切割。還有，F(xiàn)LAG M2單 克隆抗體(Sigma F1804,St. Louis,MO)特異性識別氨基酸序列 DYKDDDDK (SEQ ID N0:13)。 因此，插入的“Ek”序列能夠進行融合蛋白的特異性免疫檢測以及能夠用腸激酶蛋白酶體內 或體外消化融合蛋白。融合蛋白的體內消化需要將腸激酶蛋白酶表達到大腸桿菌周質中。實施例9 :pVIII-CBD-Tev-0xalp-8His的構建和Oxalp膜蛋白體內功能的證明存在于表達克隆pVIII-CBD-0xalp-8His的融合蛋白ORF被修飾來編碼就在與Oxalp的融合連接之前的Tev蛋白酶識別序列。插入的“Tev”序列ENLYFQGS (SEQID NO 67)能夠用Tev蛋白酶體內或體外消化融合蛋白。融合蛋白的體內切割需要將Tev蛋 白酶表達到大腸桿菌周質中。pVIII-CBD-0xalp-8His表達克隆通過用BamHI消化克隆 pVIII-CBD-0xalp-8His以及連接由寡核苷酸互補對358_307和358-308組成的雙鏈插入 物來構建。弓丨物 358-3075，-GATCGGAGAACCTGTACTTCCAGG-3，(SEQ ID NO 44)。弓丨物 355-3085，-GATCCCTGGAAGTACAGGTTCTCC-3，
(SEQ ID NO :45)。該寡核苷酸對的正確連接產生表達克隆pVIII-CBD-TeV-0Xalp-8His(圖23)。 將獨特的BamHI限制位點保持在DNA融合連接處，以能夠克隆膜蛋白基因代替oxalp基 因。使用實施例6中描述的YidC-互補測定，測試表達蛋白的體內功能。結果顯示， pVIII-CBD-Tev-0xalp-8His融合蛋白通過利用圖10中顯示的拓撲結構在體內起作用。
實施例10 :pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His融合蛋白的表汰和體外純化將表達克隆pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His轉化到大腸桿菌菌株MC1061中。將單個轉 化體于 30°C培養(yǎng)在加 100 μ g/mL氨芐青霉素的 Terrific Broth (Tartof 和Hobbs，Bethesda Res. Lab. Focus 9:12(1987))中，直至達到 0D_ = 0. 4。溫度降至 20°C并且用 100 μ M IPTG 誘導蛋白表達4小時。將細胞收獲并且冷凍。如下制備細胞膜部分將來自250mL培養(yǎng)物 的細胞沉淀(1. 2g)重懸浮在5mL原生質球緩沖液[33mMTris-HCl (pH 8. 0)，20%蔗糖]中。 添加溶菌酶至最終濃度為0. 01mg/mL并且添加ImM的EDTA，通過在4°C下緩慢攪拌30分鐘 來產生原生質球。通過在4°C下12，OOOg離心20min分離原生質球。將原生質球用5mL原 生質球緩沖液再懸浮。以每毫升20單位添加DNaseI (NEB#M0303S，Ipswich MA)，添加2mM MgCl2以及添加蛋白酶抑制劑混合物(Sigma P8849，St. Louis, MO)，然后用French壓碎器 (以8，OOOpsi進行2次)破壞原生質球。將該混合物瞬時在冰上溫育，以使DNase I降低粘 度。通過以24，OOOg于4°C離心15min，除去完整的細胞和任何不溶性蛋白。將該上清液進 行超速離心，以沉淀膜部分。超速離心使用Beckman Τ 70離心機以40，OOOrpm(147, 000g) (Beckman-Cou 11er, Fu 11 erton, CA)進行。將膜沉淀重懸浮于 50mMHEPES-K0H(pH 8. 0)、50mM KCl、10%甘油、0. 05% DDM中。將膜部分等分成100 μ L單位并且在_80°C下快速冷凍。蛋白純化如下進行添加DDM至100 μ L膜部分的等分試樣。在4°C下溫和混合 管形瓶1小時，以溶解整合膜蛋白。添加緩沖液A[10mM Tris-HCl(pH 8. 0) UOOmM KC1U0% 甘油、0. l%DDM、10mM咪唑]，以制作用于鎳螯合色譜的加載樣品。鎳-NTA瓊脂糖樹脂用緩 沖液A預洗滌3次。添加加載樣品(400 μ L)至Eppendorf管中的100 μ L預洗滌鎳-NTA 樹脂并且4°C下溫和混合1小時。除去樹脂空體積并且將樹脂用200 μ L洗滌緩沖液[IOmM Tris-HCKpH 8. 0) UOOmM 1((1、10%甘油、0· 1 % DDM、40mM 咪唑]洗滌 3 次。用兩個 80 μ L 體積的洗脫緩沖液[IOmM Tris-HCl (pH 7. 0)、100KC1、10%甘油、0. 1 % DDM、400mM咪唑]洗 脫組氨酸標記的蛋白。采用抗PVIII和抗FLAG單克隆抗體通過免疫印跡方法，分析洗脫部 分(el和e2)以及整個純化過程中得到的其它樣品以鑒定pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His的存 在性(圖11)。圖11顯示，pVIII-CBD-Ek-0xalp-8His融合蛋白可以使用標準方法從大腸 桿菌轉化體的膜部分純化。而且，圖IlA和IlB中顯示的相同洗脫曲線表明，pVIII-CBD膜 靶向肽不遭受體內或體外蛋白水解降解。得出該結論是因為FLAG抗體檢測到與pVIII抗 體相同的單一蛋白種類，所述PVIII抗體特異性識別pVIII的N末端(Kneissel等J. Mol. Biol. 288 :21-28(1999))。實施例11 使用ATP合成酶亞基C變體L31F將PhoA靶向到周質測試三種F。c蛋白(wt，G23D和L31F)的膜靶向和PhoA結構域易位。制成表的 結果顯示在圖12中。L31F突變體F。c-PhoA9融合表達水平與wt F。c_PhoA9融合蛋白表 達水平相同。然而，F(xiàn)。c(L31F)-PhoA9融合報道高于52%的堿性磷酸酶活性。該結果解釋 如下1)L31F突變體對于C末端融合蛋白的膜靶向和膜易位具有優(yōu)良的特性和/或；2)缺乏亞基C-介導的寡聚作用使C末端融合蛋白更容易裝配成有功能的形式。整合膜蛋白也 可以融合到寡聚作用-缺陷的F。C突變體的C末端并且以功能形式被靶向入細菌膜(參見 假定的實施例12)。而且，親和性和/或檢測表位可以并入F。c突變體膜靶向肽的細胞質 環(huán)中。例如，將10個組氨酸的標記并入F。c(L31F)-PhoA9(圖24)的細胞質環(huán)中，以產生 F。c(L3IF-IOHis)-PhoA9(圖 25)。將 F。c (L31F_10His) _PhoA9 模型蛋白的 10 個組氨酸的標 記放置在F。c氨基酸序列的R41和Q42之間。發(fā)現(xiàn)F。c (L3IF-IOHis)-PhoA9融合體的PhoA 活性是F。c(L31F)-PhoA9(非His標記的蛋白)的PhoA活性的80%。這顯示，親和標記并 入并不嚴重影響膜裝配。結論是本領域中已知的其它親和標記或檢測結構域可以插入亞基 C的細胞質環(huán)中，而不影響融合蛋白的膜裝配。棚列12身表汰艦輕· Rc ■革F,·白麵示膜蛋白表達克隆可以構建成與突變體F。c基因的基因融合體，突變體F。c基因已知 表達缺乏寡聚作用的F。c突變體蛋白?？梢愿鶕嵤├?至9來構建克隆。編碼突變體F。c 的基因可以置換編碼PVIII-TM2的基因。因此，在融合蛋白表達時，融合連接會存在于周質 中。圖13顯示F。c(L31F)融合到Oxalp這樣一個實施例。優(yōu)選地，蛋白酶切割位點如實施 例8、9和10中所述在融合連接處編碼。另外，并入一個或更多個親和性結構域，以在從F0C 突變體靶向蛋白切割后能夠進行膜靶向肽的最終純化。這些融合體的蛋白酶切割可以發(fā)生 在體 內或體外。實施例13 :pVIII-CBD-Ek-PhoA18 和 pVIII-CBD-sp-Ek-PhoA 載體的構津pVIII-CBD-Ek-PhoA18 表達構建物源自 pVIII-CBD_PhoA9 構建物(圖 19)，以便能 夠通過腸激酶進行體內或體外融合蛋白切割?？s寫“Ek”表示包含F(xiàn)LAG表位(DYKDDDDK) (SEQ ID NO 13)和相應的腸激酶(Ek)蛋白酶切割位點(DDDDK) (SEQ ID NO 14)。每一種構 建物中的PhoA基因插入物可以用感興趣的基因置換，所述感興趣的基因編碼預定輸出到 周質的膜蛋白或可溶性蛋白。編碼Ek/FLAG氨基酸序列的DNA插入質粒pVIII-CBD-PhoA9 獨特的BamHI位點中。互補的寡核苷酸358-155和358-204以1微摩爾濃度在NEB T4連 接酶緩沖液(NEB，Ipswich, ΜΑ)中退火。358-155Ek正向寡核苷酸5，P-GATCGGACTACAAAGATGACGATGACAAAG-3，(SEQ ID NO 46)358-204Ek反向寡核苷酸5，P-GATCCTTTGTCATCGTCATCTTTGTAGTCC-3，(SEQ ID NO 47)其中P =磷酸化的核苷酸。將該短寡核苷酸雙鏈體連接到通過BamHI消化和Antarctic磷酸酶處理 (NEB#M0289S)所制備的質粒 pVIII-CBD_PhoA9?？寺?pVIII-CBD-Ek_PhoA18 含有期望的 DNA插入，所述期望的DNA插入導致表達的融合蛋白連接區(qū)域發(fā)生下列改變pVIII-CBD-PhoA9 連接體Y(18CI)EPFQIPSGS (SEQ ID NO :48)，其中“GS”編碼區(qū)是感 興趣基因的克隆位點(BamHI)。pVIII-CBD-Ek-PhoA18連接體:Y_、EPFQIPSGSDYKDDDDKGS(SEQ IDNO :49)，其中最 終的“GS”編碼區(qū)是感興趣基因的克隆位點(BamHI)。有下劃線的是FLAG表位和腸激酶識 別位點。從pVIII-CBD-Ek載體構建pVIII-CBD-sp-Ek表達載體，以能夠通過大腸桿菌SPase進行體內融合蛋白切割(圖26C)。因此，名稱“sp”表示在融合構建物的TM2末 端處包含SPase切割位點以引起組成型體內融合蛋白切割。pVIII-CBD-sp融合蛋白可 以被設計來在SPase識別序列之后的+1處具有除脯氨酸(praline)外的任何氨基酸。 pVIII-CBD-sp-Ek載體被改造來在TM2末端在相對于SPase切割位點的位置_6至-1處編 碼氨基酸 SPSAQA(SEQ ID NO :50)。SPSAQA(SEQ ID NO :50)序列是共有 SPase 識別位點 (Meindl-Beinker等EMBO Rep. 7(11) 1111-6 (2006))和 Nilsson等J Cell Biol. 126(5) 1127-32(1994))；然而，可以有效地加工其它序列。因此，L(173)IVRSFIYE(181) (SEQ ID NO 51) 的pVIII-CBD-Ek-TM2編碼序列被改變來產生氨基酸序列L(173)IVSPSAQA~YE(183)(SEQ ID NO 52)和創(chuàng)建pVIII-CBD-sp-Ek融合載體，其中~表示SPase切割位點。使用反向PCR引物 366-361和366-362通過反向PCR誘變來將編碼序列突變，以用Phusion DNA聚合酶(NEB) 擴增載體。366-361TM2 正向引物5，P-GCACAGGCGGCATATGAACCGTTCCAGATCCCGTC-3，(SEQ ID NO 53)366-362TM2 反向引物5，P-AGACGGGGACACAATCAATACGATAGCCAGTAC-3，(SEQ ID NO 54)在用引物366-361和366-362擴增后，突變的載體通過連接而重新環(huán)化，以獲得感 興趣的pVIII-CBD-sp-Ek載體。(對于spEk連接區(qū)的圖，參見圖27)。來自pVIIICBDspEk 載體的融合蛋白表達在經大腸桿菌SPase體內加工后導致具有N末端FLAG標記的感興趣 的蛋白產生(實施例14，圖28-29)。可以通過擴增pVIII-CBD-sp-Ek載體來創(chuàng)建基因融合體(缺乏Ek/FLAG序列)，以 產生獨特的EagI限制性內切核酸酶克隆位點(實施例15)或下面實施例17和18中所述 的USER (NEB，Ipswich, ΜΑ)相容的單鏈突出端。這樣的融合構建物稱為pVIII-CBD-sp融 合體。EagI基因融合克隆在SPase切割后于感興趣蛋白的+1和+2處產生AE、AD或AG氨 基酸對。當應用克隆的USER 方法(NEB，Ipswich, ΜΑ)時，產生無接縫的pVIII-CBD-sp融 合蛋白，其在感興趣蛋白的+1和+2處具有任何期望的序列(實施例17，圖33)。實施例14.利用N末端FLAG標記熔Sau3AI限制性內切核酸酶輸出到細菌的周質因Sau3AI核酸內切酶的毒性，Sau3AI限制修飾系統(tǒng)在大腸桿菌細胞質中的常規(guī) 表達存在問題。保護性Sau3AI甲基化酶修飾5’ -GATC-3’序列的胞嘧啶殘基(Seeber等 Gene 94(1) :37_43 (1990))。然而，對大腸桿菌基因組DNA的完全Sau3AI保護性甲基化在 指數(shù)生長期間無法實現(xiàn)。為克服這些問題，使用本文描述的方法將Sau3AI輸出到大腸桿菌菌株的周質，而 不需通過Sau3AI甲基化酶修飾基因組DNA。第一次對Sau3AI表達的努力采用pVII I-CBD-sp-Ek載體，以便通過抗FLAG免 疫印跡法監(jiān)測表達和輸出。圖27顯示克隆sau4BE的連接區(qū)。克隆sau4BE表達稱為 pVIII-CBDOsp-Sau3FLAG的融合蛋白。在輸出和SPase切割后，預測該Sau3AI變異體 的N末端顯示FLAG表位以及預測加工的蛋白為58656道爾頓。預測未輸出和未加工的 pVI I I-CBD-sp-Sau3FLAG融合蛋白為77512道爾頓。使用引物370-097和368-219 (參見下 面)從金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)基因組DNA擴增sauBE基因(BE = BamHI 和EcoRI克隆位點)并且連接到用BamHI和EcoRI消化的載體pVII I-CBD-sp-Ek中。注意到BamHI克隆位點(GGATCC)相應于Ek位點之后的Gly和Ser密碼子(參見圖27)。引物 370-097:5’ -CCAGGATCCGAAAGTTATTTGACAAAACAAGCCGTAC-3’ (SEQ IDNO 55)有下劃線的是BamHI限制位點。引物 368-219:5’ -CAAGAATTCACAATAAATCTTCAACTTGCTTTTTTATGTAG-3’(SEQ IDNO 56)有下劃線的是EcoRI限制位點。將sauBE 重組克隆轉化到 C2523 (NEB Express)細胞(NEB，Ipswich, MA)中。將包 括sau4BE的9個單個克隆在加100 μ g/mL氨芐青霉素的LB中37°C下生長至0D600 = 0. 4， 然后用0. ImM IPTG在20°C下誘導3小時。在收獲后，通過0. lmg/mL溶菌酶處理將細胞溶解 并且在超聲處理緩沖液 A[IOmM Tris-HCKpH 7. 5)、50mM KC1、0. ImM EDTA、5mM β -巰基乙 醇]中超聲處理。在λ DNA上測試細胞裂解物的限制性活性。然而，對于限制性活性，包括 sau4BE的所有克隆均是陰性的。通過抗FLAG免疫印跡分析來分析相同誘導的細胞sauBE4 克隆(Sau3FLAG蛋白)表達。圖29顯示正確質量(58656道爾頓)的蛋白在IPTG誘導后被表達。結論是，缺乏限制性活性的原因是3個半胱氨酸在輸出到周質后通過天然Dsb氧 化系統(tǒng)在Sau3AI中形成二硫鍵，所述Dsb氧化系統(tǒng)主要由DsbA氧化還原酶來調節(jié)。對于 細菌細胞質酶來說，具有二硫鍵是不正常的，因此有理由假定天然Sau3AI活性不需要二硫 鍵(或多個)。實際上，確定的是，DsbA-介導的二硫鍵形成可以導致錯誤折疊的無活性的 限制性內切核酸酶。實施例15. Sau3AI限制性內切核酸酶表達到dsbA=菌株的周質菌株MB68是缺乏dsbA基因和缺乏周質DsbA氧化還原酶的大腸桿菌菌株。構建 pVIII-CBD-sp-Sau3AI克隆，其不含Ek/FLAG連接體，在MB68中表達。使用引物368-218和 368-219以及Phusion DNA聚合酶(NEB，Ipswich，MA)，從金黃色葡萄球菌基因組DNA擴增 sau3AI 基因。用引物 368-220 和 365-074 以及 Phusion DNA 聚合酶(NEB，Ipswich, ΜΑ) 擴增pVIII-CBD-sp-Ek載體，以在基因融合連接處創(chuàng)建獨特的EagI限制位點。Sau3AI 正向引物 368-218 5， -CAACAACGGCCGAAAGTTATTTGACAAAACAAGCCGTAC-3’(SEQ ID NO 57)。有下劃線的是EagI位點。Sau3AI 反向引物 368-219 5， -CAAGAATTCACAATAAATCTTCAACTTGCTTTTTTATGTAG-3>(SEQ ID NO 58)。有下劃線的是 EcoRI 位點。spEk 載體 EagI 弓丨物 368-220 5， -CAACAAGCGGCCGCCTGTGCAGACGGGGACACAATC-3’(SEQ ID NO 59)。有下劃線的是EagI位點。spEk 載體 EcoRI 弓丨物 365-074 5’ -CGGGAATTCAGCTTGGCTGTTTTGGC-3 ’ (SEQ ID NO 60)有下劃線的是EcoRI位點。在載體/插入物連接后，表達的感興趣的蛋白(Sau3Ala)期望含有代替天然Sau3AI中發(fā)現(xiàn)的起始Met的丙氨酸。如實施例13中所述和圖28中所示，EagI基因融合克 隆在SPase切割后在Sau3AI的+1和+2處產生丙氨酸(A)和谷氨酸(E)氨基酸。DNA測序 證實，克隆“saul”和“sau4”編碼期望的EagI基因融合體。將含有saul和sau4基因的相 同的克隆轉化到MB68中并且生長、誘導蛋白表達以及如實施例14中所述制備細胞裂解物。 將兩微升細胞裂解物與1微克噬菌體T7基因組DNA —起在1 XNEB緩沖液4 (NEB, Ipswich, ΜΑ)存在的情況下溫育60分鐘(37 °C )。 圖30顯示，當與對照消化相比時，[MB68] sau 1和[MB68] sau4裂解物含有活 性Sau3AI限制性內切核酸酶，所述對照消化使用具有相同GATC特異性的6單位純化的 BfuCI (NEB#R0636S,NEB, Ipswich, ΜΑ)。圖31證明，dsbA-菌株突變對于在大腸桿菌周質中 產生活性Sau3AI是優(yōu)選必需的，因為在相應于wt DsbA宿主細胞的泳道1_8中沒有可測量 的λ DNA底物碎片化作用。實施例16. H有與天然Sau3AI相同的N末端M某酸序歹U的周質Sau3AI表汰
克隆saul (Sau3Ala蛋白)被突變來創(chuàng)建相應于對于SPase切割位點的+1氨基酸 的ATG密碼子。該實施例的目的是產生具有與天然Sau3AI相同N末端的Sau3Met蛋白，所 述天然Sau3AI是根據Seeber等(Gene 94(1) =37-43(1990))中報道的基因序列。使用引 物 372-913 和 372-915 用 Phusion DNA 聚合酶(NEB，Ipswich, ΜΑ)在反向 PCR 反應中擴 增克隆saul以產生Ala+lMet突變SauMet 正向引物 372-913 5，P-ATGGAAAGTTATTTGACAAAACAAGCC-3，(SEQ ID NO 61)SauMet 反向引物 372-915 5，P-CGCCTGTGCAGACGGGGACACAATCAATAC-3，(SEQ ID NO 62)對克隆135D和145A進行測序證實了期望的Ala+lMet密碼子突變。然后將克隆 135D和145A轉化到MB68中以確證Sau3AI限制性內切核酸酶表達和活性。將MB68培養(yǎng) 物在加100 μ g/mL氨芐青霉素的LB中37°C下生長直至0D600 = 0. 4，然后變?yōu)?0°C以用 0. ImM IPTG誘導3小時。通過0. lmg/mL溶菌酶處理，然后在超聲處理緩沖液A中超聲處理 來制備細胞裂解物。圖32顯示，通過在dsbA_菌株中表達Sau3Met(+l)蛋白獲得了 Sau3AI 限制性活性。實施例17.使用與USERn克隆相容的pVIII-CBD-sp載體產生活性BfuCI限制性 內切核酸酶來自梭形芽孢桿菌(Bacillus fusiformis) 1226的BfuCI限制性內切核酸酶在大 腸桿菌中不過表達。BfuCI具有與Sau3AI相同的GATC特異性并且因與實施例14中所述的 相同原因而當表達在大腸桿菌中時被預期是有毒的。在該實施例中，BfuCI表達自用于輸出 到周質的pVIII-CBD-sp USER 載體。擴增pVIII-CBD-sp-Ek載體(不含Ek連接編碼區(qū))， 以創(chuàng)建USER 酶產生的單鏈粘性末端的。pVIII-CBD-sp-Ek用PfuCx聚合酶(Stratagene， LaJo 11 a, CA)以及引物 372-072 和 372-073 進行擴增，然后與 USER 酶(NEB，Ipswich, MA) 一起溫育30分鐘。使用PfuCx聚合酶和引物372-074和372-075從梭形芽孢桿菌1226基 因組DNA擴增bfucl基因，然后與USER 酶一起溫育30分鐘。引物 372-072 :5，-AGGTACC(dU)GAATTCAGCTTGGCTGTTTTGG-3，(SEQID NO 63)引物 372-073 :5，-AGCCTGTGC(dU)GACGGGGACACAATCAATAC-3，(SEQID NO 64)
引物 372-074 :5，-AGCACAGGC(dU)GTTTTTGAAACTGAAGAGGCACTT-3，(SEQ ID NO 65)引物 372-075:5，-AGGTACC(dU)TATTTGACTTCCTTTACTATTTCTGC-3，(SEQ ID NO 66)混合載體和插入物溶液以能夠經由8和10個堿基相容末端進行片段裝配，然后直接轉化入C2523感受態(tài)大腸桿菌細胞中。DNA測序證實，克隆BfuC5編碼在SPase切割位 點之后的期望BfuCI氨基酸序列(VFETE. · ·) (SEQ ID NO 20)(圖33)?？寺fuC5被設計 來以天然蛋白的+2位置開始表達入周質中。進行該作用過程，原因是當在位置+2處編碼 纈氨酸時，期望通過宿主細胞質酶甲硫氨酸氨基肽酶除去天然BfuCI的甲硫氨酸(Meirmel 等 Biochimie. 75(12) 1061-75 (1993))。圖 33 顯示，在菌株 MB68 中活性 BfuCI 表達自克 隆BfuC5。培養(yǎng)物生長、蛋白表達、裂解物制備、反應條件和結果表示與實施例16中所述的 相同。
權利要求
組合物，其包含編碼N末端蛋白運載體的重組DNA，所述N末端蛋白運載體用于將融合到所述運載體的感興趣蛋白從細胞質區(qū)室運輸?shù)皆思毎ぃ痪幋a的蛋白運載體，其包含膜靶向肽、細胞質親和結合結構域和跨膜區(qū)段；編碼蛋白運載體的DNA，其被融合到編碼感興趣蛋白的DNA。
2.根據權利要求1所述的組合物，其中所述編碼的膜靶向肽特征是對于21個氨基酸窗 口大小至少1. 52的Goldman-Engelman-Steitz疏水性分數(shù)。
3.根據權利要求1所述的組合物，其中所述編碼的膜靶向肽具有21個氨基酸的氨基酸 窗口，以便在21個氨基酸窗口內存在缺乏Asp、Glu、Arg和Lys的至少9個氨基酸的疏水核 心序列。
4.根據權利要求1所述的組合物，其中所述編碼的膜靶向肽是YidC依賴性的。
5.根據權利要求4所述的組合物，其中所述編碼的膜靶向肽選自pVIII、Pf3外殼和亞 基C變體L31F。
6.根據權利要求1所述的組合物，其中所述編碼的細胞質親和結合結構域是糖結合結 構域。
7.根據權利要求6所述的組合物，其中所述編碼的細胞質親和結合結構域是殼多 糖-結合結構域。
8.根據權利要求1所述的組合物，其中所述編碼的細胞質親和結合結構域選自His標 記禾口 str印標記。
9.根據權利要求1所述的組合物，其中所述編碼的跨膜區(qū)段具有N末端和C末端，所述 區(qū)段具有21個氨基酸序列窗口，以便在所述21個氨基酸窗口內存在缺乏Asp、GlU、Arg和 Lys的至少9個氨基酸的核心序列，并且所述21個氨基酸窗口在N末端側翼是包含具有至 少+1總電荷的至少9個氨基酸的氨基酸序列。
10.根據權利要求9所述的組合物，其中所述21個氨基酸窗口在C末端側翼是氨基酸 連接序列。
11.根據權利要求10所述的組合物，其中所述連接序列含有信號肽酶切割位點。
12.根據權利要求10所述的組合物，其中所述連接序列含有異源蛋白酶切割位點。
13.根據權利要求9所述的組合物，其中所述編碼的跨膜區(qū)段是信號肽酶的TM2。
14.融合蛋白，其包含膜靶向肽、細胞質親和結合結構域、跨膜區(qū)段和感興趣的蛋白。
15.根據權利要求14所述的融合蛋白，其中所述感興趣的蛋白是毒蛋白。
16.根據權利要求15所述的融合蛋白，其中所述毒蛋白是限制性內切核酸酶。
17.根據權利要求16所述的融合蛋白，其中所述限制性內切核酸酶是Sau3AI或同切點酶。
18.在革蘭氏陰性菌宿主細胞中生產重組蛋白的方法，包括(a)獲得具有權利要求1中所述特征的重組DNA，其融合到編碼感興趣蛋白的DNA;以及(b)轉化所述宿主細胞。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述重組蛋白通過將所述細胞質親和結合結構 域結合到親和性底物而從所述宿主細胞純化。
20.根據權利要求18所述的方法，進一步包括測試所述轉化的宿主細胞，以通過經由所述細胞質親和結合結構域結合親和性底物來檢測所述感興趣的蛋白。
21.根據權利要求18所述的方法，其中所述宿主細胞具有DsbA_表型。
22.根據權利要求21所述的方法，進一步包括測試所述轉化的宿主細胞，以測定所述 感興趣蛋白的酶促活性和結合活性中的至少一種。
23.根據權利要求18所述的方法，其中所述感興趣的蛋白是Sau3AI。
24.根據權利要求18所述的方法，其中所述感興趣的蛋白是BfuCI。
25.DNA，其包含:SEQ ID NO 23中的核苷酸序列631-1986。
26.方法，包括根據權利要求18在同源甲基化不存在的情況下產生限制性內切核酸酶。
27.根據權利要求26所述的方法，其中所述限制性內切核酸酶是Sau3AI或其同切點酶。
28.載體，其包含權利要求1所述的DNA。
29.宿主細胞，其包含權利要求28所述的載體。
全文摘要
提供通過將表達的蛋白靶向宿主細胞包膜從導入原核宿主細胞中的重組DNA產生膜蛋白或毒蛋白的方法和組合物。所述方法和組合物使用融合至感興趣蛋白的蛋白運載體。所述融合蛋白可以含有一個或更多個蛋白酶切割位點以體內或體外從所述蛋白運載體分離所述感興趣的蛋白。所述蛋白運載體的特征是被包含細胞質親和結合結構域的細胞質氨基酸序列分隔的膜靶向肽和跨膜區(qū)段。
文檔編號C07K14/195GK101835798SQ200880112464
公開日2010年9月15日 申請日期2008年8月14日 優(yōu)先權日2007年8月21日
發(fā)明者J·C·塞繆爾森, J·羅 申請人:新英格蘭生物實驗室公司