專利名稱：高細(xì)胞毒性靶向融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物基因工程中的導(dǎo)向融合蛋白領(lǐng)域，目前癌癥仍然是死亡率位居第二的疾 病，目前人們還沒有特別有效的手段來(lái)進(jìn)行治療，化療仍然是目前最常用的治療方法，雖然 有一定的療效，但是其副作用大，治療效果只有部分理想，治療時(shí)容易產(chǎn)生耐藥林細(xì)胞等缺 點(diǎn)影響了這種方法的療效和有效率。
導(dǎo)向治療是一種有望代替化療的新的治療手段，有多篇文獻(xiàn)和專利(中國(guó)專利應(yīng)用 嵌合毒素診斷癌癥的方法，99806580.3;中國(guó)專利 一種能特異殺死腫瘤細(xì)胞的基因工程重 組蛋白，03137587.1;中國(guó)專利高效低毒的系列功能蛋白，200410033621. 6 )報(bào)道了關(guān)于 使用人促黃體激素釋放因子(GnRH)及其衍生物與假單胞桿菌外毒素A (PE)構(gòu)建乾向融合 蛋白，可以用于腫瘤的乾向治療；另有文獻(xiàn)(Mol Microbiol. 1999 Mar; 31 (5): 1385-93. A deletion within the translocation domain of Pseudomonas exotoxin A enhances translocation efficiency and cytotoxicity concomitantly)報(bào)道了將 PE 毒素的 359-365位氨基酸缺失后，PE毒素的活性會(huì)大幅度提高；還有文獻(xiàn)(US Patent 5602095, Recombinant pseudomonas exotoxin with increased activity)報(bào)道將PE末端5個(gè)#^ 酸REDLK突變?yōu)镵DEL后，PE的活性也會(huì)大幅度提高。基于此并結(jié)合蛋白質(zhì)三維分析，本發(fā) 明為了得到活性更高的靶向融合蛋白，針對(duì)靶向融合蛋白GnRH-PE40 ( SEQ ID NO: 1)進(jìn)行了 如下改構(gòu)
1將PE40的359-365位氨基酸進(jìn)行了缺失(即為PE39 )。
2將PE39的末端5個(gè)氨基酸REDLK突變?yōu)镵DEL (即為PE39KDEL )。
最終我們得到了高活性的靶向融合蛋白GnRH-PE39KDEL，在腫瘤治療方舒有很高的應(yīng)用 價(jià)值。二.
背景技術(shù)：
目前癌癥的治療仍然是一個(gè)難題，人們應(yīng)用的主要的治療手段仍然是手術(shù)，放療和化療， 傳統(tǒng)的治療法在帶來(lái)療效的同時(shí)，副作用也往往很大，并且對(duì)于復(fù)發(fā)的腫瘤治療效果更加有 限。傳統(tǒng)的療法的缺點(diǎn)主要在于其在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也大量地殺死了正常細(xì)胞，導(dǎo)向治 療的出現(xiàn)使我們有可能對(duì)腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)導(dǎo)向治療，即藥品分子可以導(dǎo)向地到達(dá)腫瘤細(xì)胞并發(fā) 揮作用，達(dá)到導(dǎo)向治療的效果。目前免疫毒素或?qū)蚨舅厥沁_(dá)到導(dǎo)向治療的一個(gè)重要的發(fā)展 方向，通過特異性抗體或細(xì)胞因子、激素等與毒素連接，前者作為導(dǎo)向部分，即配體，可以 引導(dǎo)分子到達(dá)腫瘤部位并與腫瘤細(xì)胞表面的過量表達(dá)的該種受體結(jié)合，后者作為毒素部分， 即殺滅腫瘤細(xì)胞的部分。目前以GnRH或其衍生物為導(dǎo)向部分，以PE毒素的截短形式PE40 及PE40衍生物為毒素部分的靶向治療劑已經(jīng)有報(bào)道(中國(guó)專利應(yīng)用嵌合毒素診斷癌癥的 方法，99806580.3;中國(guó)專利 一種能特異殺死腫瘤細(xì)胞的基因工程重組蛋白，03137587. 1; 中國(guó)專利高效低毒的系列功能蛋白，20(M10033621. 6 )，這些融合蛋白的靶向型已得到廣 泛驗(yàn)證，能特異性地識(shí)別目的細(xì)胞并將其殺死，但目前在應(yīng)用中還存在一個(gè)很大的問題，那 就是由于實(shí)體瘤的結(jié)構(gòu)問題，目前的靶向毒性蛋白中PE衍生物對(duì)于動(dòng)物模型中生長(zhǎng)旺盛的 實(shí)體瘤起效不大，于是如何增強(qiáng)靶向毒性蛋白中PE部分的細(xì)胞毒性就成了一個(gè)急待解決的 問題。
三.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種GnRH-PE衍生物，為了進(jìn)一步提高靶向融合蛋白的生物活性，增強(qiáng)其對(duì) 生長(zhǎng)旺盛的腫瘤細(xì)胞的殺傷力，從而更好地將靶向融合蛋白應(yīng)用于治療領(lǐng)域，本發(fā)明人通過 對(duì)已知GnRH-PE融合蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)合文獻(xiàn)，采用基因工程方法對(duì)所述融 合蛋白的毒素部分進(jìn)行缺失和突變，通過大量的篩選，獲得了在活性方面明顯優(yōu)于現(xiàn)有 GnRH-PE衍生物的新的GnRH-PE衍生物。
本發(fā)明中的GnRH-PE衍生物包括將PE40的359-365位氨基酸進(jìn)行了缺失(即為PE39)，并
將PE40的末端5個(gè)氨基酸REDLK突變?yōu)镵DEL，最終我們得到了高活性的靶向融合蛋白
4GnRH-PE39KDEL。
通過上述發(fā)明得到的靶向融合蛋白具有高活性的特點(diǎn)，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的特異性殺 傷作用，是潛在的肺瘤治療藥物。
本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及一種GnRH-PE衍生物GnRH-PE39KDEL,為SEQ ID NO: 2所示的 氨基餅列。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉，所述上述融合蛋白可以通過基因重組表達(dá)的方法或者化學(xué)合 成的方法制備。在本發(fā)明中，所述的GnRH-PE39KDEL是通過基因工程重組表達(dá)的方法獲得的。 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，通過如下方法獲得GnRH-PE39KDEL,包括如下步驟
1) 表達(dá)載體的構(gòu)建
依據(jù)已知氨基酸序列(SEQ ID N0:1)，選用大腸桿菌偏好密碼子全基因合成基因序列， 同時(shí)在相應(yīng)于所編碼的氨基酸序列之N末端和C末端加上限制性酶切位點(diǎn)。
應(yīng)用PCR的方法對(duì)SEQ ID NO: 1的基因序列進(jìn)行操作，達(dá)到將PE40的359-365位氨基酸 進(jìn)行了缺失(即為PE39 ),并將PE40的末端5個(gè)氨基酸REDLK突變?yōu)镵DEL的目的，得到編 碼SEQ ID NO: 2的融合蛋白的核酸序列。
將如上述制備的GnRH-PE衍生物基因序列以及篩選質(zhì)粒pBSK用限制性內(nèi)切酶處理好，經(jīng) 計(jì)算各樣品濃度后按一定摩爾比加入T4連接體系。經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選成功的重組子。
用限制性酶切下融合蛋白基因，再將該基因與用限制性酶處理好的NOVAGEN公司質(zhì)粒 pET21b連接，經(jīng)篩選得到正確地重組子。
2) 重組耙向融合蛋白的表達(dá)及分離純化
將如上述所得重組子轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌，經(jīng)表達(dá)篩選出高表達(dá)基因工程菌，然后經(jīng)發(fā)酵， 得到目的蛋白高表達(dá)的工程菌。使用滲透壓方法破碎細(xì)菌，然后經(jīng)過離心、澄清的步驟，通 過一系列常用的層析方法，如離子交換，凝膠過濾和疏水層析等，純化最終得到純度大于95% 的目的蛋白。
3) 目的蛋白生物活性的測(cè)定用MTT法，首先對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行消化和收集，將細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成6-8 x 104個(gè)/毫升的細(xì)胞懸液，接種于M孔板，lOOul/孔，"度培養(yǎng) 4小時(shí)。對(duì)照加入lOOul培養(yǎng)液。樣品先用RPMI 1M0培養(yǎng)液稀釋成100ul/mL,作為起始孔， 然后按每孔與上孔2. 5倍的關(guān)系稀釋樣品，各加入稀釋的樣品每孔lOOul, 37度，培養(yǎng)24
5小時(shí)，取出，用MTT法染色，用酶標(biāo)儀570nm進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算IC50值。
本發(fā)明的另一方面，涉及一種藥物組合物，其含有本發(fā)明所述的GnRH-PE39KDEL,以及 任選的藥物上可接受的載體。
在本發(fā)明知，術(shù)語(yǔ)"藥物上可接受的"意味著制藥領(lǐng)域公認(rèn)的可用于動(dòng)物，更特別的 是可用于人的。術(shù)語(yǔ)"栽體"指稀釋劑、佐劑(例如(完全或不完全)弗氏佐劑)、賦形劑、 或用于容納或施用治療劑的介質(zhì)。
這些藥用栽體可以是無(wú)菌液體，諸如水和油，包括源自石油、動(dòng)物、植物、或合成的 油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油、諸如此類。靜脈內(nèi)施用藥用組合物時(shí)，水是優(yōu) 選的載體。鹽水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液態(tài)載體，特別是用于可注射溶液。 合適的藥用賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、 硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油、滑石、氯化鈉、奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、諸如此 類。如果需要，組合物還可以包含較少數(shù)量的潤(rùn)濕或乳化劑如透明質(zhì)酸鈉，或是pH緩沖劑。 這些組合物可以采取溶液、懸浮液、乳狀液、片劑、丸劑、膠嚢粉劑、緩釋配方、諸如此類 的形式。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物為凍干注射劑形式，其中含有0. 01°/廣0. 2% 的GnRH-PE39KDEL,以及5%的甘露醇，以及藥物上可接受的載體。
將本發(fā)明的藥用組合物配制成與其意向施用路徑相容。施用路徑的實(shí)例包括但不限于 腸胃外，例如靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、口腔、鼻內(nèi)(例如吸入)、經(jīng)皮(例如局部)、經(jīng)粘膜、 和直腸施用。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，依照常規(guī)流程將組合物配制成適合靜脈內(nèi)、皮下、肌 肉內(nèi)、口腔、鼻內(nèi)、或局部施用于人類的藥用組合物。通常，用于靜脈內(nèi)施用的組合物是無(wú) 菌等滲水性緩沖液中的溶液。如果需要，組合物還可以包含增溶劑和局部麻醉劑諸如麥角胺 以減輕注射部位的疼痛。
若要局部施用本發(fā)明的組合物，則可以將組合物配制成軟膏、乳膏、皮膚貼、洗劑、 凝膠、洗發(fā)劑、噴霧劑、氣霧劑、溶液、乳液的形式或是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的其它形 式。參閱例如《雷明頓氏藥物科學(xué)和藥物劑型導(dǎo)論》(Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms), 第19版，Mack出版公司，伊斯頓， 賓夕法尼亞，1995年。 -
對(duì)于非可噴霧局部劑量形式，通常采用包含與局部應(yīng)用相容的載體或一種或多種賦形 劑且具有優(yōu)選大于水的動(dòng)態(tài)粘滯度的粘性至半固體或固體形式。合適的配方包括但不限于溶液、懸浮液、乳狀液、乳膏、軟膏、粉劑、搽劑、藥膏、諸如此類，如果需要，是無(wú)菌的或 與輔助試劑(例如防腐劑、穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑緩沖劑、或鹽)混和以改變各種特性，諸如例如 滲透壓。其它合適的局部劑量形式包括可噴霧氣霧劑制劑，其中優(yōu)選聯(lián)合固相或液相惰性栽 體的活性成分包裝在含有增壓揮發(fā)物(例如壓縮氣體，諸如氟利昂)的混合物或是擠瓶中。 如果需要，還可以向藥物組合物和劑量形式中添加增濕劑或濕潤(rùn)劑。這些額外成分的實(shí)例在 本領(lǐng)域是眾所周知的。
在本發(fā)明的又一實(shí)施方案中，所述藥物組合物為軟膏形式，其中含有0. 01°/ -0. 2%的 GnRH-PE39KDEL,和藥物上可接受的賦形劑如凡士林。
若本發(fā)明的方法包括組合物的鼻內(nèi)施用，則組合物可以配制成氣霧劑、噴霧劑、輕霧 劑、或滴劑的形式。具體而言，依照本發(fā)明使用的預(yù)防性或治療性試劑可以使用合適的推進(jìn) 劑(例如二氯二氟曱烷、三氯單氟曱烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳、或其它合適其它)以氣 霧劑噴霧呈現(xiàn)的形式由增壓包裝或噴霧器進(jìn)行方便的投遞。在增壓氣霧劑的情況中，可以通 過提供閥門來(lái)確定劑量單位，以投遞計(jì)量數(shù)量。吸入器或吹入器中所使用的膠嚢和藥筒(由 例如明膠構(gòu)成)可以配制成含有化合物及合適粉末基質(zhì)諸如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本發(fā)明的方法還包括配制用于通過注射(例如通過推注或連續(xù)輸液)腸胃外施用的組 合物的施用。用于注射的配方可以以含有額外防腐劑的單位劑量形式(例如在安瓿中或在多 劑量容器中)存在。組合物可以采取諸如油性或水性介質(zhì)中的懸浮液、溶液、或乳狀液等形 式，而且可以含有配制劑，諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑、和/或分散劑。或者，活性成分可以是粉 末形式，在使用前用合適介質(zhì)(例如無(wú)菌、無(wú)熱原水)溶解。
可用于提供本發(fā)明腸胃外劑量形式的合適介質(zhì)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知 的。在某些實(shí)施方案中，適于腸胃外劑量形式的介質(zhì)包括但不限于注射用水USP;水性介質(zhì) 包括但不限于氯化鈉注射液、Ringer氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉注射液、以 及乳酸化Ringer氏注射液；水易混介質(zhì)包括但不限于乙醇、聚乙二醇、和聚丙二醇；以及 非水性介質(zhì)包括但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、 和苯曱酸苯曱酯。
本發(fā)明的再一方面，涉及GnRH-PE39KDEL用于制備治療腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)GnRH受體的癌 癥患者的藥物的用途。
通過實(shí)驗(yàn)證明，在通過模型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究對(duì)腫瘤的體內(nèi)靶向性殺傷的活性方面，本發(fā)明 的GnRH-PE39KDEL具有明顯高于目前已知的GnRH-PE40KDEL ( SEQ ID NO: 3)與GnRH-PE39(SEQ ID NO: 4)活性的特點(diǎn)。
本發(fā)明人研究了 GnRH-PE39KDEL對(duì)體內(nèi)腫瘤殺傷的作用。將120只棵鼠接種上A549肺癌 細(xì)胞，從而得到肺癌棵小鼠模型。隔天注射GnRH-PE39KDEL共10次的棵鼠腫瘤塊減小最明 顯，抑瘤率最高，治療效果明顯優(yōu)于GnRH-PE39以及目前已知的GnRH-PE40KDEL。
上述結(jié)果表明，本發(fā)明的GnRH-PE39KDEL在治療腫瘤方面活性明顯高于GnRH-PE39以及 目前已知的GnRH-PE40KDEL。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉，施用的方式、頻率和劑量將根據(jù)所治療的病癥、病況和個(gè)體 的不同而異。 一般來(lái)說，可以通過注射(例如皮內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)、局部施用(例如 表皮施用)或滴加施用(例如滴眼劑)等方式施用。也可以根據(jù)患者個(gè)體的不同選擇合理的 施用途徑和施用方案。合適的劑量為當(dāng)施用上述的藥物組合物后能夠有效治療腫瘤細(xì)胞表面 表達(dá)GnRH受體的癌癥患者的量。
一般來(lái)說，對(duì)于含有本發(fā)明所述的含有GnRH-PE39KDEL的藥物組合物，存在于每一個(gè)劑 量中的量大約為100pg-5rag。合適的劑量的多少將因患者病癥以及給藥方式而異，但一般大 約范圍為0. 5mg-2mg，優(yōu)選lmg。
四.
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)例目的在于進(jìn)一步闡述本發(fā)明，而不會(huì)構(gòu)成對(duì)本發(fā)明專利待批權(quán)利要求的限制。 實(shí)例一.
根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子的原則，通過全基因合成的方法結(jié)合PCR的方法合成出SEQ ID NO: l所對(duì)應(yīng)的基因序列，然后通過PCR突變?nèi)笔У姆椒ǖ玫絊EQ ID NO: 2-4所對(duì)應(yīng)的基 因序列。經(jīng)過測(cè)序mt后，將目的基因連接入表達(dá)載體，將驗(yàn)證后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入到宿 主菌中，經(jīng)過表達(dá)、發(fā)酵得到目的菌體，然后通過滲透壓法破菌后，離心取上清，通過疏 水層析和離子交換層析的方法純化得到純度大于95%的4種靶向融合蛋白純品，然后分別 同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞活性試驗(yàn)和體內(nèi)藥效學(xué)試驗(yàn)。
實(shí)例二.
取本發(fā)明中的靶向融合蛋白以及三種對(duì)照試驗(yàn)融合蛋白進(jìn)行細(xì)胞活性試驗(yàn)用MTT法，
8首先對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行消化和收集，將細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成6 - 8 x 104個(gè)/毫升的 細(xì)胞懸液，接種于96孔板，100u1/孔，37度培養(yǎng)4小時(shí)。對(duì)照加入100ul培養(yǎng)液。11種 樣品先用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋成100ul/mL,作為起始孔，然后按每孔與上孔2. 5倍的關(guān)系 稀釋樣品，各加入稀釋的樣品每孔100ul， 37度，培養(yǎng)24小時(shí)，取出，用MTT法染色，用 酶標(biāo)儀570nm進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算IC50值?；钚詼y(cè)定的結(jié)果見下表，
-細(xì)胞IC50A549PC國(guó)3MCF-7
融 i^~~~~ s----(ug/mL)(ug/mL)(ug/mL)
GnRH-PE40 (SEQIDNO: 1)30.253.172.12
GnRH-PE40KDEL (SEQIDNO: 3)10.230.980.68
GnRH-PE39 (SEQIDNO: 4)8.660.860.69
GnRH-PE39KDEL (SEQIDNO: 2)1.080.120.14
實(shí)例三:
體內(nèi)的藥效試驗(yàn)120只雄性BALB/C棵鼠(SPF級(jí))接種上A549肺癌細(xì)胞，從而得到 肺癌棵小鼠模型。隨機(jī)分為12組，每組10只棵鼠，分別為生理鹽水組，GnRH-PE衍生物SEQ ID NO: 1-4組，接種后7天起，隔一天靜脈注射75ug/kg，共給藥10次，每4天測(cè)瘤塊的 長(zhǎng)徑(a )、短徑(b )，根據(jù)公式V=ab2/2計(jì)算腫瘤體積(隨3),接種后27天處死動(dòng)物，解剖 取瘤塊，稱瘤重，計(jì)算抑瘤率。
試驗(yàn)結(jié)果:
融合蛋白抑瘤率
GnRH-PE40 (SEQ ID NO:)30.5%
GnRH-PE40KDEL (SEQ ID NO: 3)44.7%
GnRH-PE39 (SEQ ID NO: 4)56.80/o
GnRH-PE39KDEL (SEQ ID NO: 2)81.8%
結(jié)論從以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明中GnRH-PE39KDEL的體外細(xì)胞活性、體內(nèi)抑瘤活性都顯 著高于目前已知的GnRH-PE衍生物GnRH-PE40KDEL (SEQ ID NO: 3)和GnRH-PE39，說明本 發(fā)明通過對(duì)扭向融合蛋白的缺失和突變?cè)鰪?qiáng)了其生物活性和體內(nèi)抑瘤作用。
920
序列表
SEQ ID NO: 1
Met-Glu-His-Trp陽(yáng)Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg墨Pro-Gly-His-Met-Ala-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Leu-Ala-Ala-
Leu隱Thr-Ala-His-Gln-Ala-Cys-His-Leu-Pro-Leu-Glu-Thr-Phe-Thr-Arg-His-Arg-Gln-Pro-Arg-Gly-
Trp-Glu-Gln-Leu-Glu-Gln-Cys-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-
Leu-Ser-Trp-Asn-Gln-Val-Asp-Gln-Val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-Ser陽(yáng)Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-
Leu-Gly-Glu-AIa-Ile-Arg-Glu-Gln-Pro-Glu-Gln-Ala-Arg-Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-Glu-
Ser-Glu-Arg-Phe-Val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-Asp-Glu-Ala-Gly-Ala-Ala陽(yáng)Asn-Ala國(guó)Asp-Val-Val-
Ser-Leu-Thr-Cys-Pro-Val-Ala-Ala-Gly-Glu-Cys-Ala-Gly-Pro-Ala-Asp-Ser-Gly-Asp-Ala-Leu-Leu-
Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-Ala-Glu-Phe陽(yáng)Leu-Gly-Asp陽(yáng)Gly-Gly-Asp陽(yáng)Val-Ser陽(yáng)Phe-Ser-Thr-Arg-
Gly-Thr-Gln-Asn-Trp-Thr-Val-Glu-Arg陽(yáng)Leu-Leu-Gln-Ala-His-Arg-Gln陽(yáng)Leu-Glu-Glu-Arg-Gly-Tyr-
Val-Phe-Val-GIy-Tyr-His-Gly-Thr-Phe-Leu-Glu-AIa-AIa-GIn國(guó)Ser-Ile-Val-Phe-Gly-Gly-VaI-Arg-
Ala-Arg-Ser-Gln-Asp-Leu-Asp-Ala-Ile-Trp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Ile-Ala-Gly-Asp-Pro-Ala-Leu-Ala-
Tyr-Gly-Tyr-Ala-Gln陽(yáng)Asp-Gln-Glu-Pro-Asp-Ala-Arg-Gly-Arg-Ile-Arg-Asn-Gly-Ala-Leu-Leu陽(yáng)Arg國(guó)
Val-Tyr-Val-Pro-Arg-Ser-Ser-Leu-Pro-Gly-Phe-Tyr-Arg-Thr-Ser陽(yáng)Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Pro-Glu-
Ala-Ala-Gly-Glu-Val-Glu-Arg-Leu-Ile-Gly-His-Pro-Leu-Pro-Leu-Arg-Leu-Asp-Ala-Ile-Thr-Gly-
Pro-Glu陽(yáng)Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Leu-Glu-Thr陽(yáng)Ile扁Leu-Gly-Trp-Pro-Leu-Ala-Glu-Arg-Thr-Val-Val-
Ile-Pro-Ser陽(yáng)Ala-Ile-Pro-Thr-Asp-Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Gly-Asp-Leu-Asp-Pro-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp
-Lys-Glu-Gln-Ala-Ile-Ser-Ala-Leu-Pro-Asp-Tyr墨Ala-Ser-Gln-Pro-Gly-Lys-Pro-Pro-Arg-Glu陽(yáng)Asp-
Ixu-Lys
SEQ ID NO: 2
Met-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly陽(yáng)Leu-Arg陽(yáng)Pro-Gly-His-Met-Ala-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser陽(yáng)Leu-Ala陽(yáng)Ala-
Leu-Thr-Ala-His-Gln-Ala-Cys-His-Leu-Pro-Leu-Glu-Thr-Phe-Thr-Arg-His-Arg-Gln隱Pro-Arg-Gly-
Trp-Glu-Gln-Leu-Glu-Gln-Cys-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-
Leu陽(yáng)Ser-Trp-Asn-Gln-Val-Asp-Gln-Val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-Ser-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-
Leu-Gly-Glu-Ala陽(yáng)Ile隱Arg-Glu-Gln-Pro-Glu-Gln-Ala-Arg-Leu-Ala陽(yáng)Leu-Thr-Leu陽(yáng)Ala國(guó)Ala-Ala-Glu國(guó)
Ser-Glu-Arg-Phe-Val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-Asp-Asp-Val-Val-Ser-Leu-Thr陽(yáng)Cys-Pro-Val-Ala國(guó)
Ala-Gly-Glu-Cys-Ala-Gly-Pro-Ala-Asp-Ser墨Gly-Asp-Ala-Leu-Leu-Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-
Ala-Glu-Phe-Leu陽(yáng)Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Val扁Ser-Phe-Ser-Thr-Arg-Gly-Thr-Gln-Asn-Trp,-Thr-Val-
Glu-Arg-Leu隱Leu國(guó)Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg-Gly-Tyr-Val-Phe-Val-Gly-Tyr-His-Gly-
Thr-Phe-Leu-Glu-Ala-Ala隱Gln-Ser-Ile-Val-Phe-Gly-Gly-Val-Arg-Ala-Arg-Ser-Gln-Asp隱Leu-Asp-
Ala-Ile-Trp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Ile-Ala-Gly-Asp-Pro-Ala-Leu-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ala陽(yáng)Gln-Asp-Gln-
10Glu-pro-ASP-Ala-Arg-Gly-A.rg-Ile-A.rg-Asn-Gly-Ala-Leu-Leu-Arg-val-Tyr-val-pro-Arg-ser-ser-
Leu-pro-Gly-phe-Tyr-Arg-Thr-ser-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-pro-Glu-Ala-Ala-Gly-Glu-val-Glu-Arg-
Leu-Ile-Gly-His-pro-Leu-pro-Leu-Arg-Leu-ASP-Ala-Ile-ThT-Gly-pro-Glu,Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-
Leu-Glu-Thr-Ile-Leu,Gly-Trp-pro-Leu-Ala-Glu-Arg-Thr-val-val-Ile-pro-ser-Ala-Ile-pro-Thr-ASP-
pro-Arg-Asn-val-Gly-Gly-ASP-Leu-ASP-pro-ser-ser-Il pro-ASP-Lys-Glu-Gln-Ala-Ile-ser-Ala-
Leu"pro-ASP-Tyr-A.la-ser-Gln-pro-Gly-Lys-pro-pro-Lys-ASP-Glu-Leu
SEQ ID NO: 3
Met-Glu-His-Trp-ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-pr Gly-His-Met-Ala-Glu-Glu-Gly-Gly-ser-Leu-Ala-Ala-
Leu-,ThT-Ala-His-Gln-Ala-門ys-His-Leu-pro-Leu-Glu-Thr-phe-,Thr-Arg-His-Arg-Gln-pro-Arg-Gly-
Trp-Glu-Gln-Leu-Glu-Gln-Cys-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-
Leu-ser,Trp-Asn-Gln-val-ASJ>Gln-val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-Ser-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-
Leu-Gly-Glu-Ala-Ile-Arg-Glu-Gln-Pro-Glu-Gln-Ala-Arg-Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-Glu-
ser-Glu-Arg-phe,val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-ASP-Glu-Ala-Gly-Ala-Ala-Asn-Ala-ASP-val-val-
ser-Leu-Thr-cys-pro-val-Ala-Ala-Gly-Glu-cys-Ala-Gly-pro-Ala-ASP-ser-Gly-ASP-Ala-Leu-Leu-
Glu-Arg-Asn-Tyr-pro-Thr,Gly-Ala-Glu-phe-Leu-Gly-ASP-Gly-Gly-ASP-val-ser-phe-ser-Thr-Arg-
Gly-Thr-Gln-Asn-Ttp-Thr-val-Glu-Arg-Leu-Leu-Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu曙Glu-Glu曙Arg-Gly-Tyr-
val,phe-val-Gly-Tyr-His-Gly-Thr-phe-Leu-Glu-Ala-Ala-Gln-ser-Ile-val-phe-Gly-Gly-val-Arg-
A.la曙ATg-ser-Gln-ASP-Leu-ASJP-A.la-Ile-Trp-Arg-Gly-lphe-Tyr-Ile-Ala-Gly-ASP-pro-Ala-Leu-Ala-
Tyr-Gly-Tyr-Ala-Gln-ASP-Gln-Glu-pro-ASP-Ala-Arg-Gly-Arg-Ile-Arg-Asn-Gly-Ala-Leu-ILeu-Arg-
val-Tyr-val-pro-Arg-ser-ser-Leu-pro-Gly-phe-Tyr-Arg-Thr-ser-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-pro-Glu-
Ala-Ala-Gly-Glu-val-Glu-Arg-Leu-Ile-Gly-His-pro-Leu-pro-Leu-Arg-Leu-ASP-Ala-Ile-Thr-G一y-
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Ile-pro-ser-Ala曙Ile-pro-Thr-ASPHPro-Arg-Asn-val-Gly-Gly-ASPTLeu-ASP-pro-ser-ser-Ile-pro-ASP
-Lys-Glu-Gln-Ala-Ile-ser—Ala-Leu-pro-ASP-Tyr-Ala-ser-Gln-pro-Gly-Lys-pro-pro-Lys-ASP-Glu-
Leu
SEQ ID NO: 4
Met-Glu-His-TTP-ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-pro-Gly-His-Met-Ala-Glu-Glu-Gly曙Gly-ser-Leu-Ala-Ala-
Leu-Thr-Ala-His-Gln-Ala-cys-His-Leu-pro-Leu-Glu-Thr-phe-Thr-Arg-His-Arg-Gln-pro-Arg-Gly-
Ttp-Glu-Gln-Leu-Glu-Gln-cys-Gly-Tyr-pro-val-Gln-Arg-Leu-val-Ala-Leu-Tyr-Leu曙Ala-Ala-Arg-
Leu-ser-Trp-Asn-Gln-val-ASP-Gln-val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-ser-pro-Gly-ser-GlyMGly-ASP-
Leu-Gly-Glu-Ala-Ile-Arg-Glu-Gln-pro-Glu-Gln-Ala-Arg曙L(fēng)eu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-Glu-
ser-Glu-Arg-phe-val-Arg-Gln-Gly-ThT-Gly-Asn-ASP-ASP-val-val-ser-Leu-Thr-cys-pro-val-Ala-Ala-Gly-Glu-Cys-Ala-Gly-Pro-Ala-Asp-Ser-Gly-Asp-Ala-Leu-Leu-Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-
Ala-Glu陽(yáng)Phe-Leu-Gly-Asp-Gly陽(yáng)Gly-Asp陽(yáng)Val-Ser陽(yáng)Phe-Ser陽(yáng)Thr-Arg-Gly-Thr-Gln-Asn-Trp-Thr-Val-
Glu-Arg-Leu-Leu-Gln-Ala隱His-Arg-Gln-Leu-Glu-Glu-Arg-Gly陽(yáng)Tyr-Val-Phe-Val-Gly-Tyr-His-Gly陽(yáng)
Thr-Phe-Leu-Glu-Ala-Ala-Gln-Ser-Ile-Val-Phe-Gly-Gly-Val-Arg-Ala-Arg-Ser-Gln-Asp-Leu-Asp-
Ala-Ile-T卬-Arg-Gly-Phe-Tyr-Ile-Ala-Gly陽(yáng)Asp-Pro-Ala-Leu-Ala-Tyr-Gly陽(yáng)Tyr-Ala-Gln-Asp-Gln-
Glu-Pro-Asp-Ala-Arg-Gly-Arg-IIe-Arg-Asn-Gly-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Tyr-Val-Pro-Arg-Ser-Ser-
Leu-Pro-Gly-Phe-Tyr-Arg-Thr-Ser-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala曙Pro-Glu墨Ala-Ala-Gly-Glu-Val-Glu陽(yáng)Arg-
Leu-Ile-Gly-His-Pro-Leu-Pro-Leu-Arg-Leu-Asp-Ala-IIe-Thr-Gly-Pro-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-
Leu-Glu-Thr-Ile-Leu-Gly-Trp-Pro-Leu-Ala-Glu-Arg-Thr-Val-Val-Ile-Pro-Ser-Ala-Ile-Pro-Thr-Asp-
Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Gly-Asp-Leu-Asp-Pro-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp-Lys-Glu-Gln-Ala-Ile-Ser-Ala-
Leu-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ser-Gln-Pro-Gly-Lys-Pro-Pro-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys
權(quán)利要求
1. 一種由人促黃體生成激素釋放激素衍生物GnRH與假單胞桿菌外毒素A PE衍生物組成的融合蛋白GnRH-PE39KDEL，并以該融合蛋白為藥物的主要成分用于治療細(xì)胞表面過度表達(dá)GnRH受體的腫瘤疾病。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l，所說的融合蛋白的氨基^列為Met陽(yáng)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro隱Gly陽(yáng)His-Met-Ala-Glu-Glu-Gly-Gly-Ser-Leu-Ala陽(yáng)Ala-Leu陽(yáng)Thr-Ala-His-Gln-Ala陽(yáng)Cys-His國(guó)Leu-Pro-Leu-Glu-Thr-Phe-Thr-Arg-His-Arg-Gln-Pro-Arg隱Gly-Trp-Glu-Gln-Leu-Glu-Gln-Cys-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ser-Trp-Asn-Gln-Val-Asp陽(yáng)Gln陽(yáng)Val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-Ser-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-Leu陽(yáng)Gly-Glu-Ala-Ile-Arg-Glu-Gln-Pro-Glu-Gln-Ala-Arg陽(yáng)Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-GIu-Ser-Glu-Arg-Phe-Val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-Asp-Asp-Val-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Pro-Val陽(yáng)Ala-Ala-Gly-Glu-Cys-Ala-Gly-Pro-Ala-Asp-Ser-Gly-Asp-Ala-Leu-Leu-Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-Ala-Glu-Phe-Leu-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Val-Ser-Phe-Ser-Thr曙Arg-Gly-Thr-Gln-Asn-Trp-Thr-Val-Glu-Arg-Leu-Leu陽(yáng)Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu-Glu國(guó)Glu國(guó)Arg-Gly-Tyr-Val-Phe-Val-Gly-Tyr-His-Gly-Thr-Phe-Leu-Glu-Ala-Ala-Gln-Ser-Ile-Val陽(yáng)Phe-Gly陽(yáng)Gly-Val-Arg-Ala-Arg-Ser-Gln-Asp陽(yáng)Leu-Asp-Ala-Ile-Trp-Arg-Gly國(guó)Phe-Tyr陽(yáng)Ile-Ala-Gly-Asp-Pro-Ala-Leu陽(yáng)Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ala-Gln-Asp-Gln-Glu-Pro-Asp-Ala-Arg-Gly-Arg-Ile-Arg-Asn-Gly-Ala-Leu-Leu-Arg隱Val-Tyr-Val-Pro-Arg-Ser-Ser-Leu陽(yáng)Pro-Gly-Phe-Tyr-Arg-Thr-Ser-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Pro-Glu-Ala-Ala-Gly-Glu-Val-Glu-Arg-Leu-Ile-Gly-His-Pro-Leu-Pro-Leu-Arg-Leu-Asp-Ala-Ile-Thr-Gly-Pro-Glu-Glu-Glu-Gly-Gly-Arg-Leu-Glu陽(yáng)Thr-Ile-Leu陽(yáng)Gly-Trp-Pro-Leu陽(yáng)Ala-Glu-Arg-Thr-Val-Val-Ile-Pro-Ser-Ala-Ile-Pro-Thr-Asp-Pro-Arg-Asn-Val陽(yáng)Gly-Gly-Asp-Leu-Asp-Pro-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp-Lys-Glu-Gln-Ala-Ile-Ser-Ala-Leu-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ser-Gln-Pro-Gly-Lys-Pro-Pro-Lys-Asp-Glu-Leu 。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2 ，能表達(dá)出2中氨基酸序列的所有核^列。
4. 權(quán)利要求l中的融合蛋白使用大腸桿菌、酵母或真核細(xì)胞為宿主菌，應(yīng)用基因工程的方法 進(jìn)行表達(dá)、純化獲得。
全文摘要
本發(fā)明是一種高毒性靶向融合蛋白，主要是一種由GnRH與PE衍生物組成的融合蛋白GnRH-PE39KDEL，其與目前的同類靶向藥物相比，具有更高的靶向細(xì)胞毒性活性，從而在腫瘤的治療方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C07K19/00GK101469031SQ20071030131
公開日2009年7月1日 申請(qǐng)日期2007年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月27日
發(fā)明者王桂有, 陸學(xué)山, 陳海軍 申請(qǐng)人:合肥麗湖醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司