專利名稱：：多管藻中溴酚類化合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及食品添加劑，具體地說是海洋紅藻多管藻中溴酚類化合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：自由基誘導(dǎo)引起的氧化反應(yīng)能導(dǎo)致食品特別是含油食品酸敗變質(zhì)。不僅如此，氧化反應(yīng)還能導(dǎo)致食品退色、褐變等，從而嚴重影響食品的質(zhì)量，降低食品的營養(yǎng)價值。另一方面，自由基引發(fā)的許多氧化產(chǎn)物和中間產(chǎn)物是公認的致癌物，會嚴重損害有機體的生物膜、蛋白質(zhì)、酶及細胞功能，直接或間接引起許多疾病如癌癥、動脈粥樣硬化、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病以及機體老化等的發(fā)生。目前常用的防止食用油脂和含油食品氧化變質(zhì)的主要途徑之一是加入抗氧化劑，以防止或者延緩包括自由基氧化在內(nèi)所引起的氧化反應(yīng)的發(fā)生。其中叔丁基羥基甲苯(BHT)、叔丁基羥基茴香醚(BHA)是較常用的化學(xué)合成抗氧化劑、自由基清除劑。但是隨著生活水平的提高，人類對合成抗氧化劑、自由基清除劑的安全問題越來越關(guān)注，特別是研究發(fā)現(xiàn)BHT、BHA存在一定的毒性(如能引起肝臟擴大并有可能致癌)，天然抗氧化劑、自由基清除劑的研究受到越來越廣泛的重視。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供海洋紅藻多管藻中溴酚類化合物及其制備方法和應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為多管藻中的溴酚類化合物，結(jié)構(gòu)式如(I)或(II)所示，(I)(II)其中R,為:H、Br、0H、0CH3或0CH2CH3,112為H、Br、0H、0CH3或0CH線，R3為H、Br、0H、0CH3或OCH2CH3。制備方法包括如下步驟1)將海洋紅藻多管藻沖洗干凈、陰干、粉碎到60-80目，然后用有機溶液浸取2-5次，合并提取液進行濃縮，得到粗提物；2)取步驟1)中所得粗提物的2-3倍體積的水加入步驟1)的粗提物中，并依次用所述加入水體積2-3倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取各2-4次，萃取物各自濃縮得相應(yīng)的提取物，備用；3)取步驟2)中的乙酸乙酯提取物進行硅膠層析，用有機溶劑進行梯度洗脫，收集洗脫液，洗脫液經(jīng)薄層層析檢測；所述有機溶劑為100:0-0:100梯度的氯仿-甲醇或乙酸乙酯-甲醇；4)將步驟3)中以氯仿-甲醇或乙酸乙酯-甲醇體積比35-40:1梯度洗脫下的組分進行硅膠和葡聚糖凝膠柱層析，收集洗脫液濃縮后得目標化合物(I);或?qū)⒉襟E3)中以氯仿-甲醇或乙酸乙酯-甲醇體積比25-30:1梯度洗脫下的組分進行硅膠和葡聚糖凝膠柱層析，收集洗脫液濃縮后得目標化合物(II)。步驟l)中的有機溶液提取液可為濃度在50-100%的乙醇或甲醇。步驟4)中硅膠層析所用的洗脫液可為40:60到0:100梯度的石油醚-丙酮石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯；葡聚糖凝膠柱層析所用的洗脫液可為甲醇或氯仿—甲醇。化合物的應(yīng)用，所述化合物作為延緩、防止自由基誘導(dǎo)引起的食用油脂氧化變質(zhì)或含油食品添加劑。本發(fā)明具有以下優(yōu)點-.本發(fā)明涉及的化合物為新的溴酚類化合物，屬于小分子天然有機化合物，容易制備獲得；本發(fā)明涉及的溴酚類化合物具有顯著的DPPH自由(cx，a-dipheny卜p—picrylhydrazyl,即，二苯代苦味酰自由基)活性，可作為食品添加劑延緩或防止食用油脂和含油食品因自由基誘導(dǎo)引起的氧化變質(zhì)。本發(fā)明涉及的海洋紅藻多管藻,戸》細faurceoh"Grev.)屬于紅藻門、松節(jié)藻科、多管藻屬海藻，在中國主要分布于黃海海域。本發(fā)明通過對多管蒸經(jīng)提取、分離獲得的溴酚類天然化合物(I)、(II),經(jīng)實驗證明，這些化合物具有顯著的DPPH自由基清除活性，在相同的濃度條件下其作用強度明顯高于化學(xué)合成品BHT,可廣泛應(yīng)用于食用油脂或含油食品中，替代化學(xué)合成抗氧化劑、自由基清除劑，防止或延緩由自由基引起的氧化反應(yīng)的發(fā)生，從而延長保質(zhì)期，提高產(chǎn)品質(zhì)量。具體實施方式-.下面結(jié)合實施實例對本發(fā)明做進一步闡述。實施例1溴酚類化合物的制備方法采集新鮮的多管藻經(jīng)海水清洗，除去表面附著的沙礫及雜藻，陰涼處涼干備用。取涼干后的樣品6.lKg,粉碎到60-80目后用8.5升95%的乙醇在室溫下提取三次，每次三天，合并乙醇提取液，在溫度40。C左右減壓濃縮、回收乙醇，獲得乙醇粗提物。粗提物中加入所得粗提物體積2倍的蒸餾水使之混懸于水中，依次用上述混懸粗提物的蒸餾水的2倍體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取各三次，分別濃縮后獲得相應(yīng)的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物。將乙酸乙酯提取物(60克)進行硅膠柱層析，用氯仿—甲酵以100:0、90:1、85:1，70:1、50:1、40:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1至i」0:100的梯度進行洗脫，分別收集洗脫液，再用薄層層析(TLC)檢測(用三氯化鐵作為顯色劑)，根據(jù)Rf值來判斷、合并相同或類似部分，獲得36個組分。將第18組分，其Rf-O.3-0.4(200毫克)，即以氯仿-甲醇40:1梯度洗脫下的組分再進行葡聚糖凝膠SephadexLH-20柱層析，用l:l的氯仿-甲醇洗脫，洗脫液經(jīng)減壓濃縮獲得純化合物A(3.0毫克)，經(jīng)波譜分析，化合物A的結(jié)構(gòu)確定為7-溴-9，10-二氫菲-2,3,5，6-四醇，英文名為7-b畫o-9，10-dihydrophenanthrene-2，3，5，6-tetrao1，即式(I)中R,、R2、113同時為H時所代表的化合物；將第20組分(2克)，即以氯仿-甲醇30:1梯度洗脫下的組分再進行硅膠柱層析和葡聚糖凝膠S印hadexLH-20柱層析分離，硅膠柱層析時用梯度在40:60到0:100的石油醚-丙酮進行洗脫，葡聚糖凝膠SephadexLH-20柱層析用100%濃度的甲醇洗脫，洗脫液經(jīng)減壓濃縮獲得純化合物B(2.Q亳克)，經(jīng)波譜分析，化合物B的結(jié)構(gòu)確定為4，6-二溴-9，10-二氫菲-2，3，5，7-四醇，英文名為4，6-dibromo-9，10-dihydrophenanthrene-2，3，5,7-tetrao1，即式(II)中R,、R2、R3同時為H時所代表的化合物?；衔顰、B的結(jié)構(gòu)式如下所示?；衔顰、B具有以下理化和波譜特性化合物A:黃色粉末狀固體，熔點147-149。C;核磁共振氫譜CHNMR,acetone-d6，500MHz)5(acetone_cf6，500MHz)6.71(1H，s，H—1)，8.01(1H，s，H-4)，6.88(1H，s，H-8)，2.63(2H,m,H-9)，2.58(2H，m，H-10);核磁共振碳譜("C畫R，acetone-d6,125MHz)5131.3(s,C-la)，115.4(d，C-l)，144.9(s，C-2)，143.6(s,C-3)，116.9(d，C-4)，125.2(s，化合物A化合物B5C-4a)，122.5(s，C-5a)，144.7(s，C-5)，141.9(s，C—6)，107.8(s，C-7),122.4(d，C-8),133.0(s，C-8a),30.6(t，C-9),30.0(t，C-10);低分辨質(zhì)譜EIMS/nA(%)324/322[M]+(90,100)，244(16)，242(37)，226(29)，225(15)，140(10),139(25)，115(11)，113(15)，98(30)，89(8)，84(16)，70(13)，69(10);高分辨質(zhì)譜HRESIMS邁/z322.9915[M+H]+(calcdforC"H1279Br04，322.9919)?；衔顱:黃色粉末狀固體，熔點132-134°C;核磁共振氫譜(，HNMR,acetone-A，500MHz)5(acetone-rf6，500MHz)6.79(1H,s，H-l),6.95(1H，s，H-8),2.42，(2H，d，/=15.9,H-9),2.61(2H,m,H-10);核磁共振碳譜("CNMR,acetone-《125MHz)5113.4(d，C-l),144.3(s,C-2)，141,7(s，C-2)，110.8(s,C-4)，125.4(s,C-4a)，121.8(s，C_5a)142.8(s，C一5)，107,3(s，C-6),142.0(s，C一7)，121.8(d，C-8)，131.3(s,C-la)，133.0(s,C-8a),30.O(t,C-9),31.0(t,C-10);低分辨質(zhì)譜EIMS/n/z(%)404/402/400[M]+(23/45/21)，324(40)，323(49)，322(48)，321(47)，305(96),303(100)，242(36)，214(15)，213(18),139(17);高分辨質(zhì)譜HRESIMS/n/z424.8825[M+Na]+(calcdforC14H1079Br81BrNaO4，424.8823)。實施例2與實施例l不同之處在于將干燥粉碎的多管藻用濃度80%的乙醇提取4次，每次三天，合并提取液，室溫下減壓濃縮獲得粗提物，同時乙醇回收。將粗提物懸浮于粗提物體積3倍的水中，依次用上述混懸粗提物的蒸餾水的2倍體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取三次，分別濃縮后獲得相應(yīng)的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物。將乙酸乙酯提取物進行硅膠柱(220克，200-300目)層析，用梯度為100:O到O:100的梯度的乙酸乙酯-甲醇進行梯度洗脫，分別收集洗脫液，以薄層層析(TLC)檢測(用三氯化鐵作為顯色劑)，根據(jù)Rf值來判斷、合并相同或類似部分；將以乙酸乙酯-甲醇在40:1到30:l梯度洗脫下的洗脫液，其中Rf=0.25-0.4,再進行硅膠柱層析分離和葡聚糖凝膠SephadexLH-20柱層析，硅膠層析采用梯度在20:80到0:100的石油醚-乙酸乙酯進行洗脫；葡聚糖凝膠柱層析所用的洗脫劑為梯度為50:50的氯仿-甲酵進行洗脫，洗脫液減壓濃縮后獲得純化合物，結(jié)構(gòu)式如(I)或(II)所示，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中R,為:H、Br、0H、(03或OCH線,112為H、Br、0H、0CHs或OCH2CH3,l為H、Br、0H、0CH3或OCH2CH3。例如純化合物C和化合物D,經(jīng)波譜分析，化合物C的結(jié)構(gòu)確定為4,7-二溴-9，10-二氫菲-2，3，5,6，8-戊醇，英文名為4，7-dibromo-9，10-dihydrophe謹threne-2，3，5,6,8-pentao1，即式(I)中R,為H、R2為Br、R3為OH時所代表的化合物；化合物B的結(jié)構(gòu)確定為1，4，6-三溴-9,IO-二氫菲-2，3，5，7，8-戊醇，英文名為1，4，6-tribromo-9，10-dihydrophe羅threne-2，3，5，7，8-pentao1，即式(II)中R!為Br、R2為OH時所代表的化合物?；衔顲、D的結(jié)構(gòu)式如下所示。化合物C化合物D同時以上通式化合物均可由化合物A和B進一步衍生而成。實施例3DPPH自由基清除活性實驗DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，在有機溶劑中呈紫色，在517nm附近有強吸收，加入抗氧化劑后，一部分自由基被清除，使吸收減弱，可借此來評價其抗氧化活性、自由基清除活性的強弱。這種方法操作簡便，重現(xiàn)性好。實驗方法在2mL實施例1中所得樣品中加入2mLDPPH(甲醇溶液，0.16mmol/L)混合均勻后，室溫暗處放置50min后，于517nm處測定其吸光度Asample。在2mL實施例1中所得樣品中加入2mL甲醇溶液于517nm處測定其吸Asampleblank。2mLDPPH中加入2mL甲醇氯仿混合溶劑于517nm處測定其吸A,tral。2mL甲醇中加入2mL甲醇氯仿混合溶劑于517nm處測定其吸光'lanko自由基清除率的計算清除率％=100—(A—-A<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>將實施例l得到的樣品在O.l//g/mL、0.25〃g/mL、1.0//g/mL、2.5//g/mL、5.0//g/mL、10.0//g/mL、25.0//g/mL不同濃度下分別測試，每個濃度平行測定三次，取平均值即為樣品清除率，并計算ICs。值。所有測試均以BHT為標準品作為陽性對照。實驗結(jié)果參見表1,數(shù)據(jù)表明上述獲得的溴酚類化合物具有顯著的度度A光光度DPPH清除活性，在低濃度到高濃度下溴酚類化合物的活性強度都明顯高于陽性對照BHT。另外，實驗表明，BHT的ICs。為83.3〃M，而溴酚類化合物A、B的I"分別為6.78和6.13//M,僅為陽性對照BHT的十二分之一或十三分之一，表明化合物A、B的的自由基清除活性顯著高于陽性對照BHT。表l自由基清除活性(清除率，％)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例4溴酚類化合物在食用油脂抗氧化中的應(yīng)用取食用油脂1千克，按照0.02%的重量比加入上述實施例1-2中得到的溴酚類化合物A或B，混合均勻，制得抗自由基氧化的食用油脂。與不含溴酚類化合物的食用油脂相比，含溴酚類化合物的食用油脂其保存期是前者的2-3倍以上。本發(fā)明所涉及的溴酚類化合物可應(yīng)用于任何食用油脂中，以防止或延緩自由基引起的氧化變質(zhì)，延長保質(zhì)期。權(quán)利要求1.多管藻中的溴酚類化合物，其特征在于結(jié)構(gòu)式如(I)或(II)所示，id="icf0001"file="A2007100137300002C1.gif"wi="77"he="46"top="45"left="63"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中R1為H、Br、OH、OCH3或OCH2CH3，R2為H、Br、OH、OCH3或OCH2CH3，R3為H、Br、OH、OCH3或OCH2CH3。2.—種權(quán)利要求1所述的海藻溴酚類化合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟1)將海洋紅藻多管藻沖洗干凈、陰干、粉碎到60-80目，然后用有機溶液浸取2-5次，合并提取液進行濃縮，得到粗提物；2)取步驟1)中所得粗提物的2-3倍體積的水加入步驟1)的粗提物中，并依次用所述加入水體積2-3倍的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取各2-4次，萃取物各自濃縮得相應(yīng)的提取物，備用；3)取步驟2)中的乙酸乙酯提取物進行硅膠層析，用有機溶劑進行梯度洗脫，收集洗脫液，洗脫液經(jīng)薄層層析檢測；所述有機溶劑為100:0-0:100梯度的氯仿-甲醇或乙酸乙酯-甲醇；4)將步驟3)中以氯仿-甲醇或乙酸乙酯-甲醇體積比35-40:1梯度洗脫下的組分進行硅膠和葡聚糖凝膠柱層析，收集洗脫液濃縮后得目標化合物(I);或?qū)⒉襟E3)中以氯仿-甲醇或乙酸乙酯-甲醇體積比25-30:1梯度洗脫下的組分進行硅膠和葡聚糖凝膠柱層析，收集洗脫液濃縮后得目標化合物(II)。3.按權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟l)中的有機溶液提取液可為濃度在50-100%的乙醇或甲醇。4.按權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟4)中硅膠層析所用的洗脫液可為石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯；葡聚糖凝膠柱層析所用的洗脫液可為甲醇或氯仿-甲醇。5.—種權(quán)利要i1所述的海藻溴酚類化合物的應(yīng)用，其特征在于所述化合物作為延緩、防止自由基誘導(dǎo)引起的食用油脂氧化變質(zhì)或含油食品添加劑。全文摘要本發(fā)明涉及食品添加劑領(lǐng)域，具體地說是多管藻中溴酚類化合物及其制備方法和用途。具體是從海洋紅藻多管藻中經(jīng)提取、分離獲得的具有清除自由基活性的溴酚類化合物，結(jié)構(gòu)式(I)或(II)所示，其中R₁為H、Br、OH、OCH₃或OCH₂CH₃，R₂為H、Br、OH、OCH₃或OCH₂CH₃，R₃為H、Br、OH、OCH₃或OCH₂CH₃。具體方法為將多管藻經(jīng)海水沖洗干凈、除去表面附著的沙礫及雜藻，陰干、粉碎后浸取、溶劑分配和反復(fù)的層析分離，得到單體化合物。本發(fā)明所得溴酚類化合物具有顯著的清除DPPH自由基活性，可作為食品添加劑延緩或防止食用油脂或含油食品因自由基誘導(dǎo)引起的氧化變質(zhì)。其中R₁為H、Br、OH、OCH₃或OCH₂CH₃，R₂為H、Br、OH、OCH₃或OCH₂CH₃，R₃為H、Br、OH、OCH₃或OCH₂CH₃。文檔編號C07C39/42GK101177383SQ200710013730公開日2008年5月14日申請日期2007年2月17日優(yōu)先權(quán)日2007年2月17日發(fā)明者可李,李曉明,王斌貴申請人:中國科學(xué)院海洋研究所