專利名稱：用于治療和預防炎性疾病的方法和組合物的制作方法
背景技術(shù)：
細胞因子是由免疫系統(tǒng)細胞產(chǎn)生并作用于免疫系統(tǒng)細胞的肽信使分子。它們在性質(zhì)上為旁分泌或自分泌并且如果它們脫離細胞結(jié)合并通過淋巴或血漿溢出至大循環(huán)中便可以在全身起作用。因為細胞因子作為免疫系統(tǒng)的化學信使起關(guān)鍵作用并且是正常免疫功能所必需的，在某些免疫系統(tǒng)疾病中特定細胞因子的水平是不正常的并加強了該疾病狀態(tài)。
在免疫系統(tǒng)疾病如特應性疾病特別是哮喘中，以及在自身免疫性疾病中，趨化因子(chemokines)即一特定類細胞因子和它們的亞類白細胞介素起重要作用。組織中這些趨化因子的存在和水平誘導了生理學變化，這種變化在患有特定疾病的個體中得以放大和維持以致形成表型，這種表型可認為是疾病狀態(tài)。趨化因子是引發(fā)及維持炎癥的介質(zhì)。用中和性抗趨化因子抗體或用趨化因子受體拮抗劑破壞趨化因子-受體相互作用可減少或抑制炎性反應。對抗趨化因子的自身抗體能夠有效地中和趨化因子，并且它們對免疫系統(tǒng)與疾病具有信號傳導與調(diào)節(jié)作用。通過調(diào)節(jié)患者針對靶標趨化因子的自身抗體水平，治療與趨化因子的異常水平相關(guān)的疾病的原理實際上可以仿效身體自身的病因?qū)W或?qū)膊〉恼{(diào)控。
趨化因子在疾病中的重要調(diào)節(jié)作用已經(jīng)導致了許多產(chǎn)品的開發(fā)，這些產(chǎn)品的作用模式是阻礙趨化因子結(jié)合到它們的受體上。多數(shù)這些產(chǎn)品，其中一些還在臨床試驗中，是基于人源化的單克隆抗體(“mAbs”)、非抗原性受體拮抗劑或可溶性受體分子或類似物；所有這些需要多次重復施用并且它們不能理想地用于長期治療或預防性治療。例如用于風濕性關(guān)節(jié)炎和炎性腸疾病的人源化抗TNFα mAbs，和用于治療哮喘的幾種人源化抗IL-4、抗IL-5、抗IL-8和抗IL-9 mAbs正在開發(fā)中。這些人源化mAbs治療可能在用于急性疾病狀態(tài)的短期治療具有潛力，然而，它們不能理想地適用于長期的持續(xù)治療。結(jié)果，能導致有效利用患者自身的免疫系統(tǒng)來產(chǎn)生對靶標趨化因子水平的基于多克隆自身抗體進行控制的治療，已經(jīng)被認為是一種克服當前臨床試驗中的產(chǎn)品的許多缺點的方法(見如WO00/65058和美國專利號6,093,405)。
中和細胞因子處于研發(fā)的最流行的細胞因子中和方法是通過施用細胞因子受體拮抗劑、通過施用針對細胞因子或細胞因子受體的人源化單克隆抗體、或通過施用受體的截短形式，它們可以結(jié)合細胞因子并中和它。例如，美國專利號5,912,136；5,914,110；5,959,085；6,168,791 B1；和6,171,590 B1都公開了此類方法。另一報導的細胞因子的中和方法是通過使用與細胞因子基因編碼序列互補的反義分子，它的目的是抑制細胞因子基因的表達。
用通過主動免疫產(chǎn)生的自身抗體中和細胞因子現(xiàn)在被認為是一種有前途的治療病理疾病的方法(Zagury等，“Toward a new generation ofvaccinesThe anti-cytokine therapeutic vaccines”，PNAS，2001年7月3日，98卷，14期，8024-8029頁，Svenson等，Journal of ImmunologicalMethods 236(2000))1-8，Richard等，PNAS，2000年1月18日，97卷，2期，767-772頁，Dalum等，Nature Biotechnology，17卷，1999年7月，666-669頁)。用于細胞因子中和的疫苗可以通過滅活細胞因子分子并賦予它免疫原性而產(chǎn)生，見例如Ciapponi等，(“Induction ofinterleukin-6(IL-6)autoantibodies through vaccination with an engineeredIL-6 receptor antagonist.”Nature Biotechnology，15卷，10月1997年，997-1001頁)，他們成功地闡述了在具有高的人IL-6循環(huán)水平的轉(zhuǎn)基因小鼠中用抗原性的、無生物學活性的、改造過的IL-6受體拮抗劑免疫后對IL-6的中和。Ciapponi等推斷對免疫或腫瘤性疾病的這樣一種疫苗接種治療較用單克隆抗體(mAbs)或受體拮抗劑治療的優(yōu)勢，后者需要連續(xù)的腸胃外遞送。備選地，可將細胞因子偶聯(lián)至免疫原性載體上以賦予其免疫性(見如Richard等，PNAS，2000年1月18日，97卷，2期，767-772頁，美國專利號6,482,403，美國專利號6,471,957，美國專利號6,455,504，美國專利號6,420,141，WO 01/43771和WO 00/64397)。已經(jīng)建議將抗細胞因子疫苗方法用于通過控制牽涉到這些疾病狀態(tài)中的白細胞介素水平治療哮喘和變態(tài)反應性疾病(見WO 00/65058，WO 01/62287和美國專利號6,093,405)。
特應性疾病哮喘、變態(tài)反應和變態(tài)反應性疾病哮喘正成為一種最重要的醫(yī)學問題，僅美國約有1千五百萬哮喘患者。哮喘患者數(shù)目在過去10年中已經(jīng)增長了50％，在美國每年出現(xiàn)700,000受害者，大部分為小孩。
雖然所有的人對進入肺部的變態(tài)反應原產(chǎn)生保護性免疫反應，但一些個體通過引起產(chǎn)生變態(tài)反應性免疫抗體即IgE的壓倒性細胞反應起作用，該細胞釋放物質(zhì)包括細胞因子，這引起了哮喘發(fā)作。慢性哮喘，即其中哮喘綜合征一個星期至少出現(xiàn)兩次，當前用兩類藥物治療(1)平息炎癥的藥物如皮質(zhì)類固醇和(2)當發(fā)作時打開收縮的呼吸道并使呼吸流暢的搶救藥物。當前上市的藥物僅有助于減輕哮喘癥狀而不能消除或抑制引起變態(tài)反應及并發(fā)的哮喘的免疫反應。而且，當前大多數(shù)藥物或是必須頻繁服用丸劑，或必須頻繁施用或在發(fā)作時要用吸入器。作為主要地基于類固醇的治療，隨著使用增加或長期使用，它們也可導致不良的副作用和功效降低。抑制或消除導致哮喘發(fā)作的變態(tài)反應樣反應的疫苗類藥物，每幾個月僅施用一次，是十分理想的。
T輔助細胞在免疫反應中行使關(guān)鍵作用通常T輔助前體(Th-p)細胞作為免疫反應的一部分分而分化成T輔助1(Th-1)或T輔助2(Th-2)效應細胞，它們每種具有重要的生物學作用。在對抗進入肺部的抗原的反應中，個體能發(fā)生保護性的Th-1反應或變態(tài)反應性Th-2反應。Th-2反應導致IgE抗體和變態(tài)反應癥狀的產(chǎn)生。變態(tài)反應性和哮喘的個體表現(xiàn)出對吸入的變態(tài)反應原主要呈現(xiàn)Th-2反應，這種反應與IgE上升的水平相關(guān)。
哮喘中的呼吸道炎癥表征為Th2細胞、嗜酸性粒細胞及肥大細胞滲透呼吸道壁。這些細胞中的每種細胞有助于表現(xiàn)為哮喘特點的生理變化，并且每種這些細胞類型產(chǎn)生有限的一組細胞因子并對它們做出反應。
Th-p細胞分化為Th-1或Th-2細胞是通過不同的激素信號傳導途徑介導的，其中所述不同的激素信號傳導途徑主要包含不同組的白細胞介素趨化因子。Th-2途徑通過包含IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13組成的細胞因子介導。這些白細胞介素由Th-2和其它免疫系統(tǒng)細胞產(chǎn)生，并且對抗體的產(chǎn)生以及傳遞信號至參與變態(tài)反應性免疫反應的其它細胞至關(guān)重要。eotaxin是Th-2信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)反應中的另一類白細胞介素，它們調(diào)控嗜酸性粒細胞。eotaxin可影響IgE抗體的產(chǎn)生并且在變態(tài)反應性反應中起重要作用。
當前在新的哮喘治療中有相當多的研究和發(fā)展成果。這些成果包括主要用于eotaxin、IL-4、IL-5及IL-13的趨化因子中和治療，以及著眼于通過用人源化抗IgE mAbs直接阻礙或通過免疫IgE的疫苗來中和IgE抗體的其它策略。其它更常規(guī)的變態(tài)反應性疫苗策略圍繞著用特異性肽變態(tài)反應原如貓毛或豚草花粉來免疫或脫敏。致力于新的遞送方法和應用DNA疫苗技術(shù)到變態(tài)反應原免疫上的研究也在繼續(xù)，然而，變態(tài)反應原特異性策略并沒有提供對哮喘的常規(guī)治療。
也有相當?shù)难芯恐铝τ诔Ｒ?guī)的哮喘疫苗，該疫苗著眼于產(chǎn)生非特異性Th-1免疫反應，或通過用已知的Th-1抗原或能引起Th-1免疫反應的DNA疫苗來免疫而轉(zhuǎn)變患者的Th-2反應為Th-1反應(見如美國專利號6,086,898)。這種已經(jīng)被提出作為治療變態(tài)反應和自身免疫性疾病的主動免疫方法已經(jīng)集中于控制白細胞介素IL-4和IL-5上。美國專利號6,093，405公開了通過用免疫原性IL-4或IL-5細胞因子組合物主動免疫來誘導對抗IL-4或IL-5的免疫反應以便分別治療變態(tài)反應或自身免疫疾病。WO 00/65058公開了抗IL-5免疫原的構(gòu)建及其在一種方法中的用途，該方法用來在一種控制哮喘和其它慢性變態(tài)反應性疾病的建議方法中下調(diào)IL-5。
關(guān)于研發(fā)牽涉到變態(tài)反應性疾病的嗜酸性粒細胞增多這一領(lǐng)域的當前狀態(tài)考慮了每一Th-2趨化因子的主要功能，它們是復雜的并且與該途徑中其它趨化因子的功能整體相關(guān)。例如eotaxin被認為能促進組織中嗜酸性粒細胞的積聚，而IL-5增加了血液中嗜酸性粒細胞的誘導。eotaxin產(chǎn)生接下來可以通過IL-13調(diào)節(jié)并且IL-13能不依賴IL-5而調(diào)節(jié)嗜酸性粒細胞遷移。據(jù)報道，在小鼠中IL-5、eotaxin或兩者的產(chǎn)生缺陷，使小鼠傾向于T-細胞的固有缺陷，這隨后削弱了CD4+T細胞產(chǎn)生IL-13的能力(見Mattes等，J.Exp.Med.，195卷，11期，2002年6月3日，1433-1444頁)。
eotaxineotaxin是嗜酸性粒細胞特異性趨化因子，它們刺激嗜酸性粒細胞積聚或吸引嗜酸性粒細胞。eotaxin誘導嗜酸性粒細胞的趨化現(xiàn)象但不能顯著地誘導嗜中性粒細胞、單核細胞或T細胞的趨化現(xiàn)象。eotaxin是趨化因子CC亞家族的成員，CC亞家族也包括單核細胞趨化因子(MCPs)和巨噬細胞炎性蛋白質(zhì)(MIPs)在內(nèi)的一類趨化因子，見Van Coillie等，Cytokine & Growth Factor Reviews，10(1999)61-86；Garcia-Zepeda等，(1996)Nat.Med.，2449-456。
目前至少有三種分類為eotaxin的分子；首先確定的是eotaxin-1并仍然稱為eotaxin(見Kitaura，M.等，J.Biol.Chem.，1996，271；7725-30和Ponath等，J.Clin.Invest.1996年，97604-12)及以后發(fā)現(xiàn)的eotaxin-2和eotaxin-3，(見Conroy等，Respir Res 2001年，2150-156；Guiterrez-Ramos等Immunology Today，1999年11月，20卷，11期，500-504頁)。eotaxin以相對高的親和性結(jié)合至趨化因子受體3即CCR3，并通過它起作用來誘導嗜酸性粒細胞的募集。eotaxin的結(jié)構(gòu)和肽序列以及編碼它的基因是已知的，并且它與受體的結(jié)合已經(jīng)得以研究和描述(見Garcia-Zepeda等，Nature Medicine，2卷，4期，1996年4月，449-456；Ye等，The Journal of Biological Chemistry，275卷，35期，2000年9月1日，27250-27257；Mayer和Stone，The Journal of Biological Chemistry，276卷，17期，2001年4月27日，13911-1391頁)。
嗜酸性粒細胞是身體的Th-2-型免疫防御蠕蟲寄生感染的其中一種主要成分之一并且在受感染個體的血液和組織中積聚。嗜酸性粒細胞包含陽離子蛋白質(zhì)顆粒，這種顆粒在細胞脫顆粒時釋放至細胞的環(huán)境中并損傷入侵蠕蟲。特應性疾病如哮喘和慢性變態(tài)反應性疾病表征為對變態(tài)反應性非蠕蟲刺激的主要的Th-2型免疫反應。在患有哮喘和慢性變態(tài)反應性疾病的患者中肺部的炎癥表征為肺部以及特別是支氣管粘膜中嗜酸性粒細胞的侵潤和積聚。這些疾病中當沒有蠕蟲感染時，細胞脫顆粒時嗜酸性粒細胞的陽離子蛋白質(zhì)的釋放損害周圍的細胞。因此，已經(jīng)公認為eotaxin是治療和預防特應性疾病并且特別是哮喘和變態(tài)反應性疾病的治療的潛在靶標。美國專利號5,993,814和6,031,080以及PCT公開號WO 95/07985、WO97/00960、WO 97/12914和WO 99/10534提出了將多種eotaxin激動劑和拮抗劑包括對抗eotaxin的抗體用于治療。WO 01/66754公開了在被動免疫法中用于治療eotaxin介導的疾病的抗eotaxin人抗體CAT212和213及其片段的生產(chǎn)和用途。
eotaxin作用的受體，即CC、CKR3或CXCR3受體，已經(jīng)得以描述，(見WO 97/41154和美國專利號6,171,590 B1)并且這種受體的激動劑和拮抗劑也已經(jīng)建議用于治療(見美國專利6,271,347)。美國專利6,171,590B1提出源于所述受體的免疫原性寡肽可用于主動免疫對抗受體來達到治療效果。然而，上面提到的出版物或?qū)＠紱]有提出針對eotaxin自身的主動免疫作為治療方法或公開用于這樣一種主動免疫療法的免疫原性組合物。
本發(fā)明提供用于治療表征為嗜酸性粒細胞積聚的疾病的組合物。這些特應性疾病，其中哮喘和慢性變態(tài)反應性疾病是最普遍，包括特應性皮膚病如銀屑病和其它疾病如嗜酸性潰瘍性結(jié)腸炎。每種這些疾病中通過eotaxin誘導的嗜酸性粒細胞募集嗜酸性粒細胞在受感染的組織中大量積聚。受感染組織中高水平的嗜酸性粒細胞的持續(xù)存在導致顯著的隨著時間發(fā)展的組織破壞并且可能變得不可逆轉(zhuǎn)。為其他人所追求的細胞因子中和治療在極大程度上是針對阻礙僅一種趨化因子如IL-4、IL-5、IL-9、IL-13或eotaxin的作用或趨化因子對其受體的作用如eotaxin對CCR3受體的作用。這些治療利用小分子拮抗劑、使用人單克隆抗體或人源化單克隆抗體的被動免疫、對抗一種細胞因子的主動免疫或?qū)故荏w自身的被動或主動免疫。小分子和被動免疫方法要求重復的施用并且受到患者順應性的限制。而且，作為重復治療的結(jié)果，施用的mAbs誘導的中和抗體能嚴重地抵消使用mAbs長期治療慢性疾病的被動免疫療法的效果(Adair，F(xiàn).，DrugDiscovery World，2002年夏，53-59頁)。另一方面，對抗受體自身的主動免疫可干擾其他趨化因子結(jié)合至受體上并可能具有不可預見的和非目的性的生物學后果。
發(fā)明概述本發(fā)明提供用于治療細胞因子介導的疾病的方法和組合物，其涉及多于一種細胞因子的免疫調(diào)控途徑。這類疾病包括涉及Th1及Th2細胞因子途徑的自身免疫疾病和特應性疾病如哮喘和變態(tài)反應性疾病。本發(fā)明方法用于阻礙兩種或多種其功能與此途徑相關(guān)的細胞因子的活性。細胞因子阻礙的總的效果是下調(diào)細胞因子的整體水平及相關(guān)的免疫反應并因此改善了所治疾病。
本發(fā)明的方法考慮了免疫受試者，以在受試者中產(chǎn)生免疫反應，即對目的細胞因子途徑中的兩種或多種細胞因子產(chǎn)生自身抗體。本發(fā)明的免疫原性組合物可以用于在經(jīng)免疫受試者中產(chǎn)生特異于靶標細胞因子的有效免疫反應。該方法可以包括單獨施用多種免疫原，其中所述多種免疫原中的每種著眼于產(chǎn)生僅對抗一種細胞因子靶標的免疫反應，或施用能對兩種或多種細胞因子靶標產(chǎn)生免疫反應的多價免疫原。
根據(jù)本發(fā)明，Th-2免疫反應相關(guān)的疾病可以通過調(diào)節(jié)Th-2趨化因子水平并阻礙受試者中趨化因子的作用來治療或預防。這可以在一種方法達到，即通過主動免疫受試者對抗一種或多種可能對疾病有影響的Th-2趨化因子。例如可以主動免疫受試者對抗eotaxin，而同時阻礙至少一種Th-2途徑中的其它細胞因子如IL-4、IL-5、IL-9或IL-13。通過任何下列方法可獲得同時發(fā)生的阻礙作用對抗靶標細胞因子的主動免疫；使用抗體的被動免疫；施用阻止靶標細胞因子結(jié)合至它們的受體上的拮抗劑；施用細胞因子誘捕劑如結(jié)合至自由循環(huán)的細胞因子上并中和它們活性的受體片段；或通過任意這些方法或組合物的組合。例如嗜酸性粒細胞增多癥的治療可以通過同時阻礙eotaxin和IL-5；eotaxin和IL-13；eotaxin、IL-5和IL-13；eotaxin和IL-9，或eotaxin和IL-4而達到。在本發(fā)明的其他實施方案中除了阻礙eotaxin，也可以阻礙eotaxin 2和/或eotaxin 3。通過用抗細胞因子免疫原主動免疫受試動物，包括人，能有效地阻礙多種靶標細胞因子。
在本發(fā)明的一個特定實施方案中，eotaxin的阻礙通過主動免疫對抗eotaxin達到。額外的一種細胞因子或多種細胞因子的阻礙可以通過包括主動免疫在內(nèi)的任何方法達到。通過施用單獨的其中每種針對一種靶標細胞因子的治療性疫苗產(chǎn)品，或備選地通過施用一種能誘導對抗所有靶標細胞因子的主動免疫反應的多價治療性疫苗產(chǎn)品。通過包括抗原性肽免疫原性蛋白質(zhì)綴合物或DNA疫苗的任何疫苗接種方法能完成主動免疫。
本發(fā)明特定的實施方案涉及瞄準牽涉Th-2免疫反應的多于一種細胞因子的多價疫苗產(chǎn)品。例如，在一實施方案中本發(fā)明提供了通過主動免疫患者對抗兩種涉及Th-2途徑的細胞因子即IL-5和eotaxin來治療變態(tài)反應性疾病和哮喘的方法。在一相關(guān)實施方案中，本發(fā)明提供了能在受試者中引起對抗細胞因子IL-5和eotaxin的自身抗體的多價免疫原以及這種多價免疫原治療涉及嗜酸性粒細胞積聚的炎性疾病如哮喘和變態(tài)反應性疾病和其它特應性疾病的用途。多價疫苗或免疫原性產(chǎn)品可以采用不同形式的免疫原和本技術(shù)領(lǐng)域已知的遞送方法并可單獨使用或與其它治療劑組合使用。
免疫原性組合物可以用于在患者中產(chǎn)生針對IL-5和eotaxin的自身抗體反應，其達到的水平足夠用于免疫調(diào)節(jié)或免疫中和并因此下調(diào)這些細胞因子的活性以及導致嗜酸性粒細胞積聚的減少以至改善炎性疾病。免疫原可包括包含部分eotaxin和IL-5序列的結(jié)合肽免疫原或偶聯(lián)至免疫原性載體的模擬物或編碼這類結(jié)合肽免疫原的DNA疫苗。
本發(fā)明也涉及用于治療與嗜酸性粒細胞過多或嗜酸性粒細胞積聚相關(guān)的疾病的方法，包括用本發(fā)明免疫原組合物主動免疫受試者對抗eotaxin和IL-5。本發(fā)明的治療方法除了用多價抗eotaxin和抗IL-5疫苗來主動免疫外，還包括涉及用其它藥劑治療受試者的治療。
本發(fā)明的某些實施方案中涉及下調(diào)受試動物包括人中的Th-2細胞因子的疫苗組合物。這些疫苗組合物用于在受試者中產(chǎn)生主動免疫反應，其包含產(chǎn)生針對兩種或多種Th-2細胞因子如eotaxin-1、eotaxin 2、eotaxin 3、IL-5、IL-9、IL-13和IL-4的自身抗體。多價疫苗產(chǎn)品可以用于治療由eotaxin介導的嗜酸性粒細胞積聚而產(chǎn)生的炎性疾病如哮喘和變態(tài)反應性疾病和其它特應性疾病。該疫苗或免疫原性產(chǎn)品采用不同免疫原類型及遞送方法并能單獨使用或和其它治療劑聯(lián)合使用。而且多價免疫原可包含針對每種不同的靶標趨化因子的多種不同的肽表位。
使用經(jīng)失活處理并具有免疫原性的經(jīng)改良趨化因子可以配制成基于抗原性肽的產(chǎn)品，這種趨化因子進行了。在某些實施方案中免疫原包含至少一種趨化因子受體拮抗劑或激動劑，或一種連接至免疫原性載體上的源于趨化因子的表位。源于靶標趨化因子的免疫原或趨化因子模擬物能用本領(lǐng)域熟知的方法構(gòu)建并用來在實驗室動物如小鼠或兔中引起免疫反應。得到的抗體可以根據(jù)它們在體內(nèi)和/或體外中和靶標趨化因子結(jié)合至其受體上的能力來篩選，以作為選擇最合適的用于臨床開發(fā)的表位的開始?；贒NA的產(chǎn)品包括在受治受試者體內(nèi)編碼并產(chǎn)生抗原性肽產(chǎn)物的DNA疫苗產(chǎn)品，這種抗原性肽將在受免疫的受試者體內(nèi)引起針對抗靶標趨化因子的免疫反應。任何特定產(chǎn)品的設(shè)計依賴于主要免疫反應發(fā)生所在的靶標組織和將主要產(chǎn)生的免疫反應的類型。
為了構(gòu)建本發(fā)明的免疫原，將特定的肽表位序列偶聯(lián)至免疫原性載體。當將得到的抗原施用至受試動物時，它將引起在受試動物中產(chǎn)生自身抗體的體液免疫反應，這種抗體能結(jié)合并中和靶標趨化因子如IL-5或eotaxin的生物學作用。這種免疫反應可以通過強化施用免疫原維持一段持續(xù)的時期。合適的免疫原性原載體可以包括蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)類毒素如白喉類毒素(DT)或破傷風類毒素(TT)、鑰孔血藍蛋白質(zhì)(KLH)、流感病毒血凝素等。通過用雙功能交聯(lián)劑連接將特定的肽序列偶聯(lián)至免疫原性載體。備選地，可將特定的肽偶聯(lián)至膠態(tài)金屬粒子以賦予其免疫原性，或可將它與合適的T細胞表位序列串聯(lián)合成為合成的異功能免疫原性肽，它攜帶特異的B-細胞表位和T細胞表位以引起對抗目標趨化因子如eotaxin和IL-5、靶標片段的持續(xù)的免疫原性反應。
本發(fā)明也涉及用于治療與eotaxin介導的嗜酸粒細胞積聚相關(guān)的疾病，該方法包括用本發(fā)明的免疫原性組合物主動免疫受試者而對抗Th-2趨化因子。本發(fā)明的治療方法除了包括用抗趨化因子疫苗進行主動免疫的療法外，還涉及用其它藥物制劑治療受試者的療法。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供用于在受試動物包括哺乳動物和人中治療細胞因子介導的疾病的方法和組合物。本發(fā)明的一個特別的著重點是治療涉及由多種細胞因子如Th-1和Th-2 T細胞途徑的細胞因子組成的免疫調(diào)節(jié)途徑的疾病。根據(jù)本發(fā)明，主動免疫需要治療的受試者以對抗牽涉到所治疾病的途徑中的兩種或多種細胞因子。用多種獨立的每種針對一種單一細胞因子的單價組合物或備選地，用能在受試者上引起包含對抗兩種或多種細胞因子的自身抗體的免疫反應的多價免疫原性組合物，可以免疫受試者。
本發(fā)明的一個特定實施方案提供用于治療涉及Th-2免疫調(diào)節(jié)途徑的疾病以及特別是變態(tài)反應性疾病和哮喘的方法和組合物。這些疾病中的一些表征為嗜酸性粒細胞募集至特定的組織如肺部組織中并導致組織炎癥。本發(fā)明方法提供對受試者的主動免疫以對抗多種涉及Th-2免疫反應的細胞因子，并且在一特定的實施方案中為對抗兩種涉及Th-2免疫反應的細胞因子，即IL-5和eotaxin，以便控制嗜酸性粒細胞的產(chǎn)生和募集，并致使減輕組織中的炎癥。
本發(fā)明提供對主動免疫有用，并且設(shè)計用來誘導持續(xù)的免疫反應對抗涉及牽涉到疾病的免疫調(diào)節(jié)途徑中的多種細胞因子的免疫原性組合物。在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種設(shè)計用來在動物和人中誘導對抗eotaxin和IL-5的特異性免疫反應的免疫原，其中所述eotaxin和IL-5涉及TH-2途徑并且和牽涉到變態(tài)反應性疾病和哮喘中的嗜酸粒細胞積聚相關(guān)。根據(jù)本發(fā)明的多種免疫原可以在用于目標疾病或炎性疾病的合適動物模型中產(chǎn)生并分析，以篩選出能最理想的用于治療特定疾病的特定免疫原。用于哮喘和其它變態(tài)反應性疾病的合適動物模型為本領(lǐng)域所熟知(見Humbles等，J.Exp.Med.，186卷，4期，1997年8月18日，601-612頁，Corry等，J.Exp.Med.，183卷，19961月，109-117頁，F(xiàn)oster等，J.Exp.Med.，183卷，1996年1月，195-201頁，Lukacs等，Am.J.Respir.Cell Mol.Bio.，10卷，526-532頁，1994年)。
本發(fā)明的免疫原應該能在受試者中誘導免疫反應，該免疫反應中產(chǎn)生的抗體對靶標細胞因子有足夠高的特異性和結(jié)合親和性以致能中和/或調(diào)節(jié)靶標細胞因子的生物學活性。在用于治療與嗜酸性粒細胞水平升高相關(guān)的疾病的治療性組合物中，誘導產(chǎn)生的抗細胞因子抗體的滴定應該足夠?qū)е率茉囌咧衑otaxin上升的水平降低并減少嗜酸性粒細胞向受特應性疾病感染組織的募集。通過用本發(fā)明的免疫原性組合物主動免疫受試者或患者，與eotaxin及至少一種影響eotaxin水平或影響Th-2介導的變態(tài)反應性反應的其他細胞因子如IL-5、IL-13或IL-4作用的不同自身抗體的總體水平在受試者中維持，以在發(fā)生變態(tài)反應性反應時防止或改善嗜酸性粒細胞募集。這種抗細胞因子自身抗體水平能通過加強施用本發(fā)明的免疫原性組合物得以維持，并因此與小分子趨化因子拮抗劑或表現(xiàn)出相當大的治療劑水平波動且受到患者順應性的不利影響的被動抗趨化因子免疫所提供的治療相比，應該對慢性疾病狀態(tài)提供更好的保護。而且隨著重復給藥，使用mAbs的被動免疫受到產(chǎn)生的對抗靶標-mAbs的中和抗體的影響，從而限制了它們用于長期治療的效果。
通常的非免疫原性趨化因子如eotaxin或它們的片段也能通過以熟知的方法將肽或片段偶聯(lián)至免疫原性載體蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)類毒素如白喉類毒素(DT)或破傷風類毒素(TT)、鑰孔血藍蛋白質(zhì)(KLH)、BCG、OVA或其它物質(zhì)上而賦予其免疫原性而生物學失活性(見如美國專利號6,217,881；6,132,720；5,891,992；5,609,870；5,607,676；5,468,494；5,023,077；和4,201,770和Richard等，PNAS，2000年1月18日，97卷，2期，767-772頁；Svenson等，Journal of Immunological Methods，236(2000)，1-8；Dalum等，Nature Biotechnology，17卷，1999年1月，666-669頁；Gonzalez等，Annals of Oncology，9；431-435，1998；以及Dalum等，The Journalof Immunology，1996，1574796-4804)。備選地，可將趨化因子連接至膠態(tài)金屬上以賦予它們免疫原性，見美國專利號5,112,606、6,274,552和6,528,051或失活但仍具有免疫原性的改良趨化因子變體或形式能通過使用在WO 00/65058和WO 95/05849中公開的方法并聯(lián)引入T輔助表位與eotaxin序列而產(chǎn)生。
許多化學、物理和免疫學的治療是已知的，它們可以用于產(chǎn)生無活性而有免疫原性形式的靶標趨化因子或它們的片段，(見如美國專利號6,093,405；Zagury等，PNAS，2001年1月3日，98卷，14期，8024-8029；Gringeri等，Journal of Acquired Immune Deficiency Syndrome andHuman Retrovirology，20卷，4期，1999年4月1日；Ciapponi等，NatureBiotechnology，1997年10月，15卷，997-1001頁；Raaberg等PediatricResearch，37卷，2期，1995年，169-174頁；Raaberg等，Pediatric Research，37卷，2期，1995年，175-181；Gringeri等，Journal of Acquired ImmuneDeficiency Syndromes，7卷，7期，1994，978-988；Zagury等，Journal ofAcquired Immune Deficiency Syndromes，5卷，7期，1992，676-681)。
本發(fā)明的一個實施方案涉及結(jié)合免疫原，它們包含來自同一靶標趨化因子的數(shù)種肽片段，這些片段對應于趨化因子分子上的目標表位，并被連接至免疫原性蛋白質(zhì)載體如DT或TT上，因而提供了非種系選擇性的T細胞表位并使得對長期的抗體反應產(chǎn)生免疫記憶。這種免疫原可以施用給人或受試動物以產(chǎn)生對抗趨化因子的主動體液免疫反應。本發(fā)明的一個實施方案包括將全長的趨化因子如人eotaxin連接至免疫原性載體蛋白質(zhì)如DT上以賦予其免疫原性。本發(fā)明其它實施方案包括多種連接至免疫原性載體蛋白質(zhì)上的較短的趨化因子肽片段。
使用包含一個表位或多個表位的大約4至50個氨基酸殘基的肽可以構(gòu)建偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物將在受試者中誘導出抗體，這些抗體將與存在于受試者中的趨化因子分子上呈現(xiàn)的表位交叉作用。隨后在一定的肽與載體蛋白質(zhì)摩爾比范圍內(nèi)將包含表位的一個肽或多個肽連接至蛋白質(zhì)載體上。肽可直接連接至免疫原性蛋白質(zhì)或者可摻入間隔肽序列自載體分子延伸目的表位，從而增強目的表位呈遞至抗原呈遞細胞并因此增強目的表位的免疫原性?？蓪㈤g隔肽連接至肽片段的氨基端或羧基端的任一端，并且接下來將間隔肽連接至免疫原性載體。用相同型雙功能的或異型雙功能的交聯(lián)劑，將含有表位的目的肽連接至載體蛋白質(zhì)上，能完成肽與載體的連接。雙功能交連劑的選擇依賴肽上官能分子的可用性。這些偶聯(lián)的化學方法為本領(lǐng)域熟知并在美國專利號6,132,720；609,870；和5,468,494，以及Chemistryof Protein Conjugation and Cross-linking，S.S.Wong(1991)CRC Press，Inc公開的內(nèi)容中給出。
備選地，免疫原性的趨化因子肽可通過合成肽化學構(gòu)建，以串聯(lián)產(chǎn)生所選擇的趨化因子表位片段和T細胞表位，由此將所選擇的B細胞表位(來自趨化因子)與非種系選擇性T細胞表位一起呈遞，以在受免疫的受試者中提供持續(xù)的免疫反應。
本發(fā)明的偶聯(lián)免疫原可以與可藥用載體中的佐劑或其他免疫調(diào)節(jié)劑配制成制劑，其組分和所用方法為本領(lǐng)域熟知(見Vaccine Design，TheSubunit and Adjuvant Approach，(1995)Powell and Newman Eds.，Plenum Press(紐約)，Aucouturier等，Vaccine 19(2001)2666-2672)。
免疫原性趨化因子肽也可以通過重組DNA技術(shù)構(gòu)建，即產(chǎn)生一質(zhì)粒載體，在其中，來自相同或不同趨化因子的趨化因子片段或多個片段對應的目的DNA序列與T細胞表位的DNA序列串聯(lián)編碼表達，從而產(chǎn)生包含具有選定的β細胞表位(源于趨化因子)和T細胞表位的融合蛋白質(zhì)。使用細胞培養(yǎng)/發(fā)酵技術(shù)，該融合蛋白質(zhì)能在體外表達并能從培養(yǎng)物中純化出來，或能呈現(xiàn)在質(zhì)粒表面上，或該質(zhì)粒DNA構(gòu)建體可以用作DNA疫苗。任何這些方法能提供這樣的制品，所述制品適于在經(jīng)各制品免疫的受試者中引起趨化因子特異性的且持續(xù)的免疫反應。
實施例1抗eotaxin免疫原成熟的人eotaxin-1源于97個氨基酸殘基的前體蛋白質(zhì)，該前體蛋白質(zhì)包含23個氨基酸親水性氨基末端序列，它們從該蛋白質(zhì)上切除而得到74個氨基酸的成熟蛋白質(zhì)，大概的分子量為8.4kDa(見美國專利號6,403,782，WO 99/10534；WO 97/00960；Ye等，Journal of BiologicalChemistry，275卷，35期，2000年9月1日，27250-27257頁；Garcia-Zepeda等，Nature Medicine，2卷，4期，1996年4月，449-45頁；Ponath等，J.Clin.Invest.，97卷，3期，1996年2月，604-612年；Mayer等，JournalBiological Chemistry，278卷，17期，2001年4月27日，13911-13916頁)。成熟的人eotaxin氨基酸序列(SEQ ID NO 1)如下(用單字母代碼代表每個氨基酸殘基)GPASVPTTCC10FNLANRKIPL20QRLESYRRIT30SGKCPQKAVI40FKTKLAKDIC50ADPKKKWVQD60SMKYLDQKSP70TPKP74eotaxin通常無免疫原性。肽本身或相當于目的表位的肽片段能通過本領(lǐng)域熟知的方法賦予其免疫原性?？梢允褂玫囊环N方法是來產(chǎn)生已經(jīng)失去了eotaxin生物學活性的失活eotaxin或失活eotaxin片段但為免疫原性形式并能在動物或人受試者中引起抗eotaxin中和抗體。許多可用于產(chǎn)生失活的但具有免疫原性的eotaxin或其片段的化學、物理和免疫學處理方法是已知的，(見例如美國專利號6,093,405；Zagury等，PNAS，2001年7月3日，98卷，14期，8024-8029頁；Gringeri等，Journal of AcquiredImmune Deficiency Syndrome and Human Retrovirology，20卷，4期，1999年4月1日；Ciapponi等，Nature Biotechnology，1997年10月，15卷，997-1001頁；Raaberg等，Pediatric Research，37卷，2期，1995年，169-174頁；Raaberg等，Pediatric Research，37卷，2期，1995年，175-181頁；Gringeri等，Journal of Acquired Immune DeficiencySyndromes，7卷，7期，1994年，978-988頁；Zagury等，Journal of AcquiredImmune Deficiency Syndromes，5卷，7期，1992年，676-681頁)。
談及成熟的人eotaxin序列時，在本發(fā)明的某些實施方案中，該分子的氨基端的1-45位-氨基酸殘基的肽片段和構(gòu)成羧基端的54到74位殘基片段，可用于構(gòu)建本發(fā)明的免疫原性偶聯(lián)物。免疫原性偶聯(lián)物可以包含一個或多個不同的eotaxin表位，這些表位可以存在于連接在同一免疫原性載體上的同一肽片段或不同的肽片段上。在構(gòu)建本發(fā)明免疫原中有用的一些eotaxin肽片段如下GPASVP(SEQ ID NO 2)；GPASVPT(SEQ ID NO3)；GPASVPTT(SEQ ID NO 4)；GPASVPTTC(SEQ ID NO 5)；GPASVPTTCC(SEQ ID NO 6)；GPASVPTTCCF(SEQ ID NO 7)；GPASVPTTCCFN(SEQ ID NO 8)；GPASVPTTCCFNL(SEQ ID NO 9)；GPASVPTTCCFNLA(SEQ ID NO 10)；GPASVPTTCCFNLAN(SEQ IDNO 11)；GPASVPTTCCFNLANR(SEQ ID NO 12)；GPASVPTTCCFNLANRK(SEQ ID NO 13)；GPASVPTTCCFNLANRKI(SEQ ID NO 14)；GPASVPTTCCFNLANRKIP(SEQ ID NO 15)；GPASVPTTCCFNLANRKIPL(SEQ ID NO 16)；GPASVPTTCCFNLANRKIPLQ(SEQ ID NO 17)；FNLANR(SEQ ID NO18)；FNLANRK(SEQ ID NO 19)；FNLANRKI(SEQ ID NO 20)；FNLANRKIP(SEQ ID NO 21)；FNLANRKIPL(SEQ ID NO 22)；KKKWVQDSMKYLDQKSPTPKP(SEQ ID NO 23)；KKWVQDSMKYLDQKSPTPKP(SEQ ID NO 24)；KWVQDSMKYLDQKSPTPKP(SEQ ID NO 25)；WVQDSMKYLDQKSPTPKP(SEQ ID NO 26)；VQDSMKYLDQKSPTPKP(SEQ ID NO 27)；QDSMKYLDQKSPTPKP(SEQ ID NO 28)；DSMKYLDQKSPTPKP(SEQ ID NO 29)；SMKYLDQKSPTPKP(SEQ ID NO 30)；MKYLDQKSPTPKP(SEQ IDNO 31)；KYLDQKSPTPKP(SEQ ID NO 32)；YLDQKSPTPKP(SEQID NO 33)；LDQKSPTPKP(SEQ ID NO 34)；DQKSPTPKP(SEQ IDNO 35)；QKSPTPKP(SEQ ID NO 36)；KSPTPKTP(SEQ ID NO 37)；SPTPKP(SEQ ID NO 38)；ASVPTTSSFN(SEQ ID NO 117)；ANRKIPLQRL(SEQ ID NO 118)；和ASVPTTCCFN(SEQ ID NO 119)。該肽可以通過合成或重組的方法產(chǎn)生，這些方法為本領(lǐng)域熟知。本領(lǐng)域技術(shù)人員也能理解，任何肽片段的氨基酸序列可以通過修飾以增加其免疫原性或用來賦予或增強該片段的一些其它性質(zhì)例如電荷、電荷密度、疏水性，以此來改變?nèi)芙庑曰蚪档凸丫圩饔煤头e聚的潛能，這種修飾包括替代半胱氨酸殘基來消除通過二硫鍵的寡聚化，同時保留其有助于在受試者中誘導對抗eotaxin的免疫反應的能力。此類修飾可以例如通過衍生氨基殘基或通過替換一特定氨基酸為另一氨基酸或通過本領(lǐng)域中已知的一些其它方法進行。
不能在特定受試動物中表現(xiàn)eotaxin生物學活性的擬肽(Peptidomimetics)或擬免疫原(immunomimics)也可以用來構(gòu)建偶聯(lián)免疫原。擬肽可能自身沒有免疫原性但能通過偶聯(lián)至免疫原性肽上而獲得免疫原性。在某些實施方案中擬肽可以源于其它哺乳動物eotaxin分子如小鼠或豚鼠eotaxin(見美國專利號6,031,080和5,993,814)。
eotaxin肽片段或擬免疫原可以直接連接至免疫原性蛋白質(zhì)載體上或備選地可以摻入間隔肽序列而自載體分子延伸目的表位，從而增強目的表位呈遞至抗原呈遞細胞并因此增強目的表位的免疫原性。多種間隔肽可供使用。美國專利號5,609,870和5,468,494公開了間隔肽以及將間隔肽連接至目的肽，并隨后連接至可用于構(gòu)建本發(fā)明的偶聯(lián)免疫原的免疫原性蛋白質(zhì)載體如DT或TT的方法。間隔肽SSPPPPC(SEQ ID NO 39)，RPPPPC(SEQ ID NO 40)和LPPPPC(SEQ ID NO 41)可以用于本發(fā)明的eotaxin肽片段。間隔肽可以摻入eotaxin肽片段的氨基端或羧基端以產(chǎn)生偶聯(lián)至免疫原性蛋白質(zhì)的肽如SSPPPPCKKKWVQDSMKYLDQKSPTPKP(SEQ ID NO 42)，KKKWVQDSMKYLDQKSPTPKPSSPPPPC(SEQ ID NO 43)，CPPPPSSKKKWVQDSMKYLDQKSPTPKP(SEQ ID NO 44)，KKKWVQDSMKYLDQKSPTPKPCPPPPSS(SEQ ID NO 45)，GPASVPTTCCFNLANRKIPLSSPPPPC(SEQ ID NO 46)，SSPPPPCGPASVPTTCCFNLANRKIPL(SEQ ID NO 47)，CPPPPSSGPASVPTTCCFNLANRKIPL(SEQ ID NO 48)，以及GPASVPTTCCFNLANRKIPLSSPPPPC(SEQ ID NO 49)。
一般地，在制備包含eotaxin表位的肽片段時，通過合成肽化學將間隔肽序列摻入特定的eotaxin序列中。特別地，包含具有多個親水性殘基的序列并更可能出現(xiàn)在分子表面的eotaxin片段是對本發(fā)明特別有用的。這包括如SGKCPQKAVISSPPPPC(SEQ ID NO 50)，CPPPPSSSGKCPQKAVI(SEQ ID NO 51)，F(xiàn)KTKLAKDICSSPPPPC(SEQ ID NO 52)，CPPPPSSFKTKLAKDIC(SEQ ID NO 53)，ADPKKKWVQDSSPPPPC(SEQ ID NO 54)，及CPPPPSSADPKKKWVQD(SEQ ID NO 55)。
在一個實施方案中，為了有助于用交聯(lián)劑將特定的eotaxin片段連接至載體蛋白質(zhì)如DT和TT上，通過用蘇氨酸、絲氨酸或丙氨酸殘基替代將半胱氨酸從其天然序列上除去是合適的。這種用氨基酸替代從肽片段中除去半胱氨酸的方法可應用于任何本發(fā)明的免疫原以及針對任何靶標趨化因子的情況。因此，肽片段的流體動力學性質(zhì)得以保留的同時除去了在交聯(lián)階段潛在的有害副反應。實例包括SGKTPQKAVISSPPPPC(SEQ IDNO 56)，CPPPPSSSGKTPQKAVI(SEQ ID NO 57)，F(xiàn)KTKLAKDITSSPPPPC(SEQ ID NO 58)，CPPPPSSFKTKLAKDIT(SEQ ID NO 59)，ADPKKKWVQDSSPPPPC(SEQ ID NO 60)，CPPPPSSADPKKKWVQD(SEQ ID NO 61)，ASVPTTAAFN(SEQ IDNO 120)，ASVPTTSAFN(SEQ ID NO 121)，SYRRITSGKSPQ(SEQID NO 130)，SYRRITSGKAPQ(SEQ ID NO 131)和SYRRITSGKTPQ(SEQ ID NO 132)。
抗eotaxin免疫原可以包含一種連接至免疫原性載體上的肽片段，如連接在DT上的一個或多個拷貝的序列為GPASVPTTCCFNLANRKIPL(SEQ ID NO 16)的肽片段。在另外的實施方案中，兩種或多種不同的肽片段可以連接至同一免疫原性載體上以在受試者中誘導主動免疫反應，即產(chǎn)生針對eotaxin上的兩個或多個表位的抗體。這樣的免疫原可以例如包含多拷貝的連接在DT上的每-肽序列即GPASVPTTCCFNLANRKIPL(SEQ ID NO 16)和KKKWVQDSMKYLDQKSPTPKP(SEQ ID NO 23)。
在另一實施方案中，可用兩種或多種不同的肽免疫原性載體偶聯(lián)物制備制劑，以在受試者中誘導主動免疫即產(chǎn)生針對eotaxin上的兩個或多個表位的抗體。例如施用的組合物可以是兩種不同的免疫原性構(gòu)建體的共制劑混合物，第一個構(gòu)建體包含連接于載體上的一個特定表位，第二個構(gòu)建體包含連接在其他載體分子上的另一不同表位。這樣一種免疫原性制劑可以例如包含多拷貝的每種肽序列DT連接物，即多拷貝的與DT連接的GPASVPTTCCFNLANRKIPL(SEQ ID NO 16)；以及多拷貝的與DT連接的KKKWVQDSMKYLDQKSPTPKP(SEQ ID NO 23)。
eotaxin-類毒素偶聯(lián)物可以制備為單個實體，其適用于單獨配制成制劑或適用于混合以在最終的制劑中提供具有兩個或多個表位特異性偶聯(lián)物。備選地，兩種或多種eotaxin特異性肽能通過將它們的末端巰基基團偶聯(lián)至單個馬來酰亞胺基-類毒素制劑上而連接。這通過將馬來酰亞胺基-類毒素與eotaxin-特異性肽的1∶1混合物反應得以完成，混合肽以混合的1.1摩爾過剩于活化-類毒素的可利用馬來酰亞胺基部分。因而，攜帶多種eotaxin特異性表位的單一類毒素偶聯(lián)物得以完成。
在某些實施方案中，可以在經(jīng)免疫受試者中誘導對抗eotaxin上的多個表位的免疫反應以導致潛在的與靶標eotaxin的協(xié)同結(jié)合并中和該靶標eotaxin。適合的表位肽序列選自那些在靶標分子上相互足夠離開的序列，以減少抗體結(jié)合至它們的特異性eotaxin表位之間沖突的可能性。這樣一種eotaxin表位的組合的一個實施方案包括下列eotaxin和eotaxin類似物序列SGKTPQKAVISSPPPPC(SEQ ID NO 56)或CPPPPSSSGKTPQKAVI(SEQ ID NO 57)與ADPKKKWVQDSSPPPPC(SEQ ID NO 60)或CPPPPSSADPKKKWVQD(SEQ ID NO 61)。
實施例2抗IL-5免疫原用于在哺乳動物和人中產(chǎn)生對抗IL-5的主動免疫反應的免疫原為本領(lǐng)域熟知。WO 00/65058公開了抗IL-5免疫原性組合物以及用于制備和施用該組合物的方法。在WO 00/65058公開的抗IL-5免疫原在本發(fā)明方法中是有用的并且WO 00/65058的公開內(nèi)容在這里全文引用作為參考。
用于構(gòu)建本發(fā)明免疫原的IL-5肽片段是KCGEERRRV(SEQ ID NO122)和EERRRVNQF(SEQ ID NO 123)。
實施例3抗IL-9免疫原用于在哺乳動物和人中產(chǎn)生對抗IL-9的主動免疫反應的免疫原為本領(lǐng)域所知。Richard等，PNAS，2000年1月18日，97卷，2期，767-772頁，公開了抗IL-9免疫原性組合物以及用于制備和施用該組合物的方法(也見專利號6,645,486)。在Richard等，PNAS，2000年1月18日，97卷，2期，767-772頁公開的抗IL-9免疫原在本發(fā)明方法中有用并且Richard等，PNAS，2000年1月18日，97卷，2期，767-772頁的公開內(nèi)容在這里全文引用作為參考。
實施例4抗IL-13免疫原用于在哺乳動物和人中產(chǎn)生對抗IL-13的主動免疫反應的免疫原為本領(lǐng)域所知。WO 02/070711公開了抗IL-13免疫原性組合物以及用于制備和施用該組合物的方法。在WO 02/070711公開的抗IL-13免疫原在本發(fā)明的方法中是有用的并且WO 02/070711的公開內(nèi)容在這里全文引用作為參考。
實施例5抗IL-4免疫原用于在哺乳動物和人中產(chǎn)生對抗IL-4的主動免疫反應的免疫原為本領(lǐng)域所知。WO 02/070711公開了抗IL-4免疫原性組合物以及用于制備和施用該組合物的方法。在WO 02/070711公開的抗IL-4免疫原在本發(fā)明的方法中是有用的并且WO 02/070711的公開內(nèi)容在這里全文引用作為參考。
實施例6抗eotaxin-2免疫原eotaxin-2的氨基酸序列是已知的，見Grzegorewski等，(2001)Cytokine 13；209-219頁和Mayer和Stone(2000)Biochemistry，39，8382-8395。根據(jù)本發(fā)明，肽片段VVIPSPSSMF(SEQ ID NO 124)，MFFVSKRIPE、VSKRIPENRV(SEQ ID NO 126)，SYQLSSRSTSLK(SEQ ID NO 133)，SYQLSSRSTTLK(SEQ ID NO 134)和SYQLSSRSTALK(SEQ ID NO 135)可以用于構(gòu)建抗eotaxin-2免疫原。
實施例7抗eotaxin-3免疫原eotaxin-3的氨基酸序列公開在Mayer和Stone，(2003)Proteins 50184-191中。根據(jù)本發(fā)明，肽片段SDISKTSSFQ(SEQ ID NO 127)、FQYSHKPLPW(SEQ ID NO 128)，SHKPLPWTWV(SEQ ID NO129)，SYEFTSNSSSQE(SEQ ID NO 136)，SYEFTSNSTSQE(SEQID NO 137)和SYEFTSNSASQE(SEQ ID NO 138)可以用于構(gòu)建抗eotaxin-2免疫原。
實施例8二價抗eotaxin-3和抗IL-5免疫原根據(jù)本發(fā)明，可以構(gòu)建用于產(chǎn)生對抗eotaxin和IL-5的主動免疫反應的免疫原并將其用于通過施用一種免疫原性治療性疫苗組合物治療嗜酸性粒細胞增多癥。在一特定的本發(fā)明實施方案中，該二價免疫原性組合物包含eotaxin表位和IL-5表位特異性抗原性肽決定簇，其作為半抗原連接至同一免疫原性蛋白質(zhì)載體分子上。
用作eotaxin特異性表位的抗原性肽決定簇可以選自SEQ ID NO1-38、117-119和42-61中任意肽或任意它們的組合。
可以用作IL-5表位半抗原的抗原性肽決定簇包括IPTEIPT(SEQ IDNO 62)；IPTEIPTS(SEQ ID NO 63)；IPTEIPTSA(SEQ ID NO 64)；IPTEIPTSAL(SEQ ID NO 65)；IPTEIPTSALV(SEQ ID NO 66)；IPTEIPTSALVK(SE Q ID NO 67)；IPTEIPTSALVKE(SE Q ID NO68)；IPTEIPTSALVKET(SEQ ID NO 69)；IPTEIPTSALVKETL(SEQID NO 70)；IPTEIPTSALVKETLA(SEQ ID NO 71)；IPTEIPTSALVKETLAL(SEQ ID NO 72)；IPTEIPTSALVKETLALL(SEQ ID NO 73)；IPTEIPTSALVKETLALLS(SEQ ID NO 74)；IPTEIPTSALVKETLALLST(SEQ ID NO 75)；IPTEIPTSALVKETLALLSTH(SEQ ID NO 76)；IPTEIPTSALVKETLALLSTHR(SEQ ID NO 77)；IPTEIPTSALVKETLALLSTHRT(SEQ ID NO 78)；IPTEIPTSALVKETLALLSTHRTL(SEQ ID NO 79)；IPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLL(SEQ ID NO 80)；IPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLI(SEQ ID NO 81)；IPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIA(SEQ ID NO 82)；IPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIAN(SEQ ID NO 83)；IPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANE(SEQ ID NO 84)；IPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANET(SEQ ID NO 85)；IPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETL(SEQ ID NO 86)；IPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETLR(SEQ ID NO 87)；IPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETLRI(SEQ ID NO 88)；IPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIP(SEQ ID NO 89)；IPTEIPTSALVKETLALLSTHRTLLIANETLRIPV(SEQ ID NO 90)；QLCTEEIFQGIGTLESQTV(SEQ ID NO 91)；LCTEEIFQGIGTLESQTV(SEQ ID NO 92)；CTEEIFQGIGTLESQTV(SEQ ID NO 93)；CTEEIFQGIGTLESQT(SEQ ID NO 94)；CTEEIFQGIGTLESQ(SEQ ID NO 95)；CTEEIFQGIGTLES(SEQ IDNO 96)；TVERLFKNLSLIKKYIDGQKKK(SEQ ID NO 97)；VERLFKNLSLIKKYIDGQKKK(SEQ ID NO 98)；VERLFKNLSLIKKYIDGQKK(SEQ ID NO 99)；RVNQFLDYLQEFLGVMNTEWIIES(SEQ ID NO 100)；VNQFLDYLQEFLGVMNTEWIIES(SEQ ID NO 101)；PVHKNHQLCTEEIFQGIGTLESQTVQGGTV(SEQ ID NO 102)；ERLFKNLSLIKKYIDGQKKKCGEERRRVNQ(SEQ ID NO 103)；FLDYLQEFLGVMNTEWIIES(SEQ ID NO 104)；RIPVPVHKNHQLC(SEQ ID NO 105)；QTVQGGT(SEQ ID NO 106)；KCGEERRR(SEQ ID NO 107)；TEEIFQG(SEQ ID NO 108)，EWIIES(SEQID NO 109)和SEQ ID NO 122-123。
SEQ ID NO 62-109的抗原決定簇可以在其氨基端或羧基端偶聯(lián)至間隔肽序列如SEQ ID NO 39-41并通過間隔肽作為鏈接物結(jié)合至免疫原性載體如DT或TT上。對應于抗原性肽決定簇的IL-5片段的天然序列也可以通過修飾或改變來產(chǎn)生用于抗IL-5免疫原性表位的構(gòu)建的擬免疫原。在本發(fā)明的一個特定實施方案中，半胱氨酸殘基可轉(zhuǎn)換為蘇氨酸，盡管也可用絲氨酸或丙氨酸而不是蘇氨酸來替代半胱氨酸。這種修飾過的肽序列的例子為PVHKNHQLT(SEQ ID NO 110)；KKYIDGQKKKT(SEQ IDNO 111)；KKKTGEER(SEQ ID NO 112)；TGEERRRVNQ(SEQID NO 113)；PVHKNHQLTLPPPPC(SEQ ID NO 114)；KKYIDGQKKKTSSPPPPC(SEQ ID NO 115)；和CPPPPLKKKTGEER(SEQ ID NO 116)。
二價免疫原可以包含數(shù)種抗原性肽決定簇，它們是eotaxin和IL-5表位的任意組合并連接至一個免疫原性載體如類毒素肽上。例如，用于在人受試者中產(chǎn)生主動免疫反應對抗eotaxin和IL-5的二價免疫原可以通過將數(shù)種SEQ ID NO 56-61和114-116、118、119、122以及123的抗原性肽決定簇連接至免疫原性載體如DT上而得以構(gòu)建。
實施例9肽抗原性決定簇與免疫原性載體的連接將肽連接至免疫原性蛋白質(zhì)載體的方法為本領(lǐng)域熟知(見例如WO02/066056)。例如蘇氨酸替代的eotaxin表位片段SGKTPQKAVISSPPPPC(SEQ ID NO 56)、FKTKLAKDITSSPPPPC(SEQ ID NO 58)、ADPKKKWVQDSSPPPPC(SEQ ID NO 60)，可以經(jīng)由異型雙功能交聯(lián)劑連接至DT或TT載體蛋白質(zhì)上。一種或多種這些eotaxin片段通過與異型雙功能交聯(lián)劑如N-(ε-馬來酰亞胺己酰氧基)-琥珀酰亞胺酯(EMCS)或其水溶性類似物硫代-EMCS反應與DT或TT交聯(lián)。在該實施方案中，DT或TT首先通過琥珀酰亞胺酯在類毒素的氨基上反應從而與異型雙功能交聯(lián)劑反應。該反應優(yōu)選在室溫下pH6.5±0.3時進行大約1到3小時。通過將類毒素(DT或其它載體蛋白質(zhì))與適當過量的交聯(lián)劑反應可達到馬來酰亞胺基基團對載體蛋白質(zhì)的比率為如5∶1、10∶1、15∶1。交聯(lián)劑的實際過量的摩爾量可以通過滴定測定。在滴定期間每摩爾類毒素結(jié)合的馬來酰亞胺的摩爾數(shù)可以通過隨后的馬來酰亞胺-類毒素與巰基化合物如半胱氨酸或β-巰基乙醇的反應測定。與馬來酰亞胺基-類毒素反應的巰基化合物的量是十分容易通過將剩余的巰基化合物與雙-二硫-硝基苯甲酸反應間接測定。通過過濾或凝膠色譜除去過量的交聯(lián)劑后，馬來酰亞胺基-類毒素通過其末端巰基與對活化的類毒素的馬來酰亞胺基部分1∶1摩爾過量的eotaxin間隔肽反應。所述將肽連接至類毒素上可以優(yōu)選地在室溫下pH6.0±0.3時經(jīng)過大約3到6小時完成。備選地，這種肽對馬來酰亞胺基-類毒素的連接反應可以通過室溫下過夜完成?？梢詢?yōu)選在容器中用含有馬來酰亞胺基團的交聯(lián)劑進行該連接反應。與肽反應后，將過量的肽在pH7.2±0.2的磷酸鹽緩沖液中通過滲濾或凝膠色譜移除。
實施例10多價抗趨化因子免疫原根據(jù)本發(fā)明的免疫原能通過使用實施例9的連接方法或本領(lǐng)域中已知的其它方法，以多種不同的組合連接上面列出的實施例1-8中即SEQ IDNO 1-129中的任意數(shù)量的不同肽表位得以構(gòu)建。以這種方式，可以構(gòu)建一種免疫原，其針對靶標趨化因子和特別是選自eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、IL-4、IL-5、IL-9或IL-13的Th-2趨化因子以及其組合的Th-2趨化因子。例如多價免疫原可以構(gòu)建來對抗a)eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3或b)eotaxin、IL-5、IL-13或Th-2趨化因子的任意其它組合。選擇用于構(gòu)建免疫原的特定靶標趨化因子可因待治療的免疫疾病的類型及其相關(guān)的細胞因子性質(zhì)而不同。
實施例11免疫原性疫苗組合物的劑型適用于抗原決定簇類毒素偶聯(lián)物的免疫原性呈遞的劑型包括但不限于通過吸附于鋁或alhydrogel上、包含于脂質(zhì)體、微粒體或類似的微球體中，包括微粒和納米粒、水包油或油包水乳劑，包括多相型乳劑，以及微型乳劑(見如WO 02/066056)。其它潛在合適的劑型包括含有具有佐劑性質(zhì)的嵌段共聚物的制劑，其能刺激針對所包括抗原的免疫反應，在該情況下優(yōu)選的為eotaxin特異性類毒素偶聯(lián)物。本發(fā)明的偶聯(lián)免疫原可以與可藥物用載體中的佐劑或其它免疫調(diào)節(jié)劑配制，其組分和使用的方法為本領(lǐng)域熟知，(見Vaccine Design，The Subunit and Adjuvant Approach，(1995)Powell和Newman編著，Plenum Press(New York)，Aucouturier等，Vaccine 19(2001)2666-2672)。
本發(fā)明的一特定實施方案中包括將抗原決定簇肽類毒素偶聯(lián)物制劑入油包水乳劑的液相中。將滅菌過濾的(0.1到0.2μm)肽類毒素偶聯(lián)物的水溶液與合適的滅菌過濾的(0.2μm)含有足夠用來在勻漿水油混合物后提供穩(wěn)定的油包水乳狀液的乳化劑的油混合物組合。乳化過程為在層流通風廚或合適的無菌隔離裝置中的無菌操作過程，其中所述的層流通風廚或合適的無菌隔離裝置用于對不能通過最終的過濾、熱滅菌或輻射處理而滅菌的藥物制劑包括無菌乳劑進行無菌制劑和填充。
該水-對-油混合物可以在50∶50到10∶90的范圍內(nèi)變化，但更優(yōu)選地是在40∶60到20∶80水-對-油的范圍內(nèi)。用于此目的來產(chǎn)生優(yōu)選的油包水乳劑的合適油/乳化劑混合物可獲自Montanide，該Montanide產(chǎn)品可自法國巴黎的SEPPIC，SA獲得。而且，進一步在乳化過程中將水溶性佐劑混合進最終乳劑的液相中是適當?shù)?Adams，A.Synthetic Adjuvants.1985John Wiley & Sons，紐約)。適合的佐劑的實例包括Quill A、QS21、或胞壁酰二肽(nor-MDP)。
治療炎性疾病的方法本發(fā)明的免疫原也可以在治療方案中與其它藥物或抗炎性劑施用。例如在哮喘或特應性慢性變態(tài)反應性疾病的情況下，可以用本發(fā)明的抗eotaxin疫苗主動免疫患者以便控制和下調(diào)eotaxin水平和嗜酸性粒細胞在受感染組織中的積聚，而同時施用搶救藥物或抗哮喘或抗變態(tài)反應劑以針對由如強烈變態(tài)反應性刺激引起的急性發(fā)作。用于聯(lián)合治療的這些額外的藥劑可以包括皮質(zhì)類固醇、cromoglyate、抗炎劑、COX-2抑制劑、白三烯(受體)拮抗劑、黃嘌呤類藥、抗組織胺類藥和支氣管擴張類藥。
DNA疫苗在一備選的本發(fā)明實施方案中，包含編碼上面描述的eotaxin肽片段或其它細胞因子抗原決定簇的核酸序列和進一步包含編碼T輔助細胞表位的核酸序列的DNA構(gòu)建體可用作DNA疫苗。構(gòu)建、配制和施用此類DNA疫苗的方法為本領(lǐng)域已知并且適用于本發(fā)明的趨化因子肽表位，見WO00/65058，WO 98/31398，Donnelly等，1997，Annu.Rev.Immunol.15617-648和Donnelly等，1997，Life Sciences 60163-172。
參考引用本申請參考了多種出版物和專利文獻。每一這些參考文獻即出版物和專利的公開文中全文引用作為本申請說明書的一部分，就像這些出版物和專利依次在文中引用一樣。
序列表<110>莫西亞藥物公司<120>用于治療和預防炎性疾病的方法和組合物申請項目--------------------<130>申請文件參考MERPH.002<140>當前申請?zhí)?amp;lt;141>當前申請日＿＿-＿-＿早先申請--------------------<150>優(yōu)先權(quán)號US 60/457,137<151>優(yōu)先權(quán)日2003-03-24序列--------<213>生物名稱人(Homo sapiens)<400>前序列串GPASVPTTCC FNLANRKIPL QRLESYRRIT SGKCPQKAVI FKTKLAKDIC ADPKKKWVQD60SMKYLDQKSP TPKP 74<212>類型PRT<211>長度74序列名稱SEQ ID NO 1序列描述序列--------<213>生物名稱人工的<400>前序列串GPASVP 6<212>類型PRT<211>長度6序列名稱SEQ ID NO 2序列描述序列--------<213>生物名稱人工的<400>前序列串GPASVPT 7<212>類型PRT
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GPASVPTTCC FNLANR 16<212>類型PRT<211>長度16序列名稱SEQ ID NO 12序列描述序列--------<213>生物名稱人工的<400>前序列串GPASVPTTCC FNLANRK17<212>類型PRT<211>長度17序列名稱SEQ ID NO 13序列描述序列--------<213>生物名稱人工的<400>前序列串GPASVPTTCC FNLANRKI 18<212>類型PRT<211>長度18序列名稱SEQ ID NO 14序列描述序列--------<213>生物名稱人工的<400>前序列串GPASVPTTCC FNLANRKIP 19<212>類型PRT<211>長度19序列名稱SEQ ID NO 15序列描述序列--------<213>生物名稱人工的<400>前序列串GPASVPTTCC FNLANRKIPL 20<212>類型PRT<211>長度20序列名稱SEQ ID NO 16
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權(quán)利要求
1.用于治療受試者由嗜酸性粒細胞積聚產(chǎn)生的炎性疾病的方法，其包括在患者中產(chǎn)生包含針對eotaxin和IL-5的自身抗體的主動免疫反應。
2.治療受試者由哮喘、變態(tài)反應或變態(tài)反應性疾病產(chǎn)生的疾病的方法，其包括在受試者中產(chǎn)生針對eotaxin和IL-5的免疫反應。
3.免疫原性組合物，其包含偶聯(lián)至免疫原性蛋白質(zhì)載體的eotaxin或其肽片段和IL-5或其肽片段。
4.免疫原性組合物，其包含T-細胞表位、源于IL-5的表位和源于eotaxin的表位。
5.用于治療哮喘、變態(tài)反應或變態(tài)反應性疾病的免疫原性組合物，其包含連接至免疫原性載體的eotaxin或其部分以及IL-5或其部分。
6.產(chǎn)生權(quán)利要求3、4或5的組合物的方法，其包括將eotaxin或其部分以及IL-5或其部分連接至免疫原性載體。
7.治療涉及包含多種細胞因子的免疫調(diào)節(jié)途徑的疾病的方法，該方法包括主動免疫受試者對抗該途徑中的兩種或多種細胞因子，以在受試者中引起能結(jié)合至所述細胞因子并調(diào)節(jié)其活性的自身抗體。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述途徑為Th-2途徑。
9.權(quán)利要求8的方法，其中將受試者主動免疫對抗IL-5和eotaxin。
10.用于治療受試者由eotaxin介導的疾病的方法，其包括在受試者中產(chǎn)生對抗eotaxin和至少一種選自eotaxin-2、eotaxin-3、IL-4、IL-5、IL-9或IL-13的細胞因子的主動免疫反應。
11.權(quán)利要求10的方法，其中由eotaxin介導的疾病是哮喘、變態(tài)反應或變態(tài)反應性疾病。
12.權(quán)利要求5的免疫原性組合物，其包含至少一種選自SEQ ID NO1-38、42-61、117-121和130-132所示的肽序列以及至少一種選自SEQ IDNO 62-116和122-123所示的肽序列。
13.在人類受試者中改善嗜酸性粒細胞增多的方法，其包括下調(diào)eotaxin并同時下調(diào)選自eotaxin-2、eotaxin-3、IL-4、IL-5、IL-9或IL-13的細胞因子。
14.用于主動免疫受試者來治療Th-2免疫性疾病的多價免疫原性組合物，其包含連接有源于兩種或多種Th-2細胞因子的多種肽表位的免疫原性載體。
15.權(quán)利要求14的組合物，其中Th-2細胞因子選自eotaxin-1、eotaxin-2、eotaxin-3、IL-4、IL-5、IL-9或IL-13。
全文摘要
公開了通過下調(diào)eotaxin和至少一種其它的與Th－2相關(guān)的細胞因子治療嗜酸性粒細胞增多的方法，同樣公開了多價免疫原性組合物，其在受試者中產(chǎn)生包含對抗eotaxin－1，eotaxin－2，eotaxin－3，IL－4，IL－5，IL－9和IL－13的自身抗體的主動免疫，以及公開了使用這些組合物的治療方法。
文檔編號C07K16/24GK101052415SQ200480008119
公開日2007年10月10日 申請日期2004年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月24日
發(fā)明者D·T·德利瓦斯, P·布萊克本 申請人:莫西亞藥物公司