專利名稱：：抗腫瘤活性成分陵水醇、制備方法和用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術領域：
，具體是一類從中國南海甲藻中分離得到的新型長鏈多羥基多烯類化合物陵水醇A，B，C(lingshuiolA，B，C)和它們的制備方法及用途。該類化合物對多種腫瘤細胞株具有強烈的抑制作用，可作為一類研制新的抗腫瘤藥物的先導化合物，也可能作為治療各種臨床常見多發(fā)癌癥的藥物。
背景技術：
：甲藻是植物分類系統(tǒng)中的一個門。主要由甲藻類(Dinoflagellata)的運動性單細胞藻類所構成。共分為5個綱，其中3綱為腐生，寄生或附著生種類，在海洋浮游生物中經(jīng)常出現(xiàn)的是甲藻綱(Dinophyceae)和縱裂甲藻綱(Desmophyceae)。甲藻門藻類全世界約有4000種，我國已查明的有251種，廣泛分布于我國東海和南海海域。前溝藻屬(Amphidiniumsp.)屬于環(huán)溝藻科，是一種寄生性微藻。對前溝藻屬甲藻化學成份的研究目前集中于其中的大環(huán)內酯類和長鏈多羥基多烯類化合物，這兩類化合物都具有顯著生物活性。陵水醇A，B，C(lingshuiolA，B，C)是首次從我國南海前溝藻屬甲藻中提取分離出來新型長鏈多羥基多烯類化合物，第一個結構類似物amphidinol1于1991年見諸報道，它具有很強的生物活性，對真菌Aspergillusniger的抑制作用是兩性霉素B(amphotericinB)的3倍，其溶血活性為Merck標準皂苷的120倍。另一個類似物amphidinol2也顯示出類似生物活性，能夠明顯抑制的A.niger增殖，同時具有強烈的溶血作用，其溶血活性為Merck標準皂苷的數(shù)百倍(EC50為7.3nM)。LuteophanolsA，B，andC是該化合物的另一類結構類似物，其中l(wèi)uteophanolA具有微弱的抗菌作用，但沒有抗真菌活性。LuteophanolsB和C及其它幾個類似物的生物活性則未見報道。lingshuiolA，B，C代表了一類結構新穎的化合物，目前對此類化合物生物活性的報道僅限于抗真菌、抗菌及其溶血作用等方面，對其抗腫瘤活性的研究尚屬空白。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于從我國南海甲藻中提取分離三個新型長鏈多羥基多烯類化合物；本發(fā)明的另一目的是提供一種從我國南海甲藻中提取分離長鏈多羥基多烯類化合物的方法；本發(fā)明的再一目的是提供一種上述長鏈多羥基多烯類化合物的用途。本發(fā)明的長鏈多羥基多烯類化合物具有如下的化學結構其中化合物2為其中化合物3為化合物1-3系首次從我國三亞陵水產前溝藻屬甲藻中提取得到，故分別命名為陵水醇A，B，C(lingshuiolA，B，C)。本發(fā)明還提供從甲藻中提取分離化合物lingshuiolA，B，C的方法，其步驟如下我國南海甲藻用甲醇/甲苯混合溶劑提取，減壓濃縮提取液得粗浸膏。將該浸膏溶于0.7～1.5NNaCl溶液，混懸均勻后用甲苯萃取，濃縮甲苯萃取液得到甲苯浸膏。甲苯部位經(jīng)反復硅膠柱層析，氯仿/甲醇梯度洗脫，氯仿/甲醇50∶50洗脫部分，以反相RP-18硅膠純化，甲醇/水洗脫，甲醇/水60∶40洗脫部分經(jīng)高效液相色譜純化，不同比例的乙腈/水作流動相，分別得到化合物lingshuiolA，B，C。LingshuiolA的理化性狀如下淺黃色固體，光學活性{[α]D25-8.0°(c，0.283，MeOH)}；IR譜中出現(xiàn)3411(-OH)，1735(α，β-不飽和酮)，1070(C-O)cm-1等吸收峰；正離子模式電噴霧質譜給出準分子離子峰m/z1373[M+Na]+，高分辨正離子模式電噴霧質譜顯示其分子式為C69H122O25{m/z1373.8209[M+Na]+，△＝+2.6mmu}。1H與13CNMR數(shù)據(jù)見表1。同時，通過測定二維H-H相關譜(DQF-COSY)和H-C相關譜(HMQC)及H-C遠程相關譜(HMBC)以及H-H接力相關譜(TOCSY)，確定了所有碳原子和氫原子的信號歸屬及該化合物的化學結構。LingshuiolB的理化性狀如下淺黃色固體，光學活性[α]D25-2.8(c，0.416，MeOH)；IR譜中出現(xiàn)3403(-OH)，1637(C＝C)，1066(C-O)cm-1等吸收峰；紫外譜中出現(xiàn)UVmax(MeOH).259(ε11200)，269(ε18400)，280(ε10800)(C＝C＝C＝C)。正離子模式電噴霧質譜給出準分子離子峰m/z1295[M+Na]+，高分辨正離子模式電噴霧質譜顯示其分子式為C66H112O23{m/z1295.7466[M+Na]+，△＝-2.0mmu；m/z1271.7521[M-H]-，△＝+0.4mmu}。1H與13CNMR數(shù)據(jù)見表2。同時，通過測定二維H-H相關譜(DQF-COSY)和H-C相關譜(HMQC)及H-C遠程相關譜(HMBC)，以及H-H接力相關譜(TOCSY)，確定了所有碳原子和氫原子的信號歸屬及該化合物的化學結構。LingshuiolC的理化性狀如下淺黃色固體，光學活性[α]D25+2.5(c，0.475，MeOH)；IR譜中出現(xiàn)3420(-OH)，1637(C＝C)，1250(-OSO3Na)，1066(C-O)cm-1等吸收峰；紫外譜中出現(xiàn)UVmax(MeOH).259(ε14600)，269(ε22600)，280(ε14900)(C＝C＝C＝C).正離子模式電噴霧質譜給出準分子離子峰m/z1265[M+Na]+，高分辨正離子模式電噴霧質譜顯示其分子式為C60H99O23SNa{m/z1265.5985[M+Na]+，△＝-8.5mmu}。1H與13CNMR數(shù)據(jù)見表3。同時，通過測定二維H-H相關譜(DQF-COSY)和H-C相關譜(HMQC)及H-C遠程相關譜(HMBC)，以及H-H接力相關譜(TOCSY)，確定了所有碳原子和氫原子的信號歸屬及該化合物的化學結構。表1.LingshuiolA的1H，13C以及DQF-COSY，HMBCb等波譜數(shù)據(jù)對照表注aVarianlnova600MHz；溶劑CD3OD/C5D5N(2∶1)，δ化學位移單位ppm，以氘代吡啶為內標(δH7.19andδC123.5)；bJ＝6.5Hz；c氫譜信號被水峰覆蓋，以HMQC完成信號歸屬。表2.LingshuiolB的1H，13C以及DQF-COSY，HMBCb等波譜數(shù)據(jù)對照表注aVarianInova600MHz；溶劑CD3OD/C5D5N(2∶1)，δ化學位移單位ppm，以氘代吡啶為內標(δH7.19andδC123.5)；bJ＝6.5Hz；c氫譜信號被水峰覆蓋，以HMQC完成信號歸屬。表3.LingshuiolC的1H，13C以及DQF-COSY，HBCb等波譜數(shù)據(jù)對照表注aVarianInova600MHz；溶劑CD3OD/C5D5N(2∶1)，δ化學位移單位ppm，以氘代甲醇為內標(δH3.54andδC49.3)；bJ＝6.5Hz；c氫譜信號被水峰覆蓋，以HMQC完成信號歸屬。本發(fā)明對lingshuiol型長鏈多羥基多烯類化合物進行了抗腫瘤活性測試，表明具有明顯的抗腫瘤作用。實驗結果的評判與解析<tablesid="table4"num="004"><tablewidth="811">長鏈多羥基多烯類化合物IC50(μM)A-549HL-60LingshuiolA(1)LingshuiolB(2)LingshuiolC(3)0.210.870.0450.230.820.49</table></tables>測試原理MTT法按不同腫瘤生成速率，將一定數(shù)量處于對表數(shù)生長期的腫瘤細胞90μl/孔接種于96孔培養(yǎng)板內，培養(yǎng)24小時后加入藥液10μl/孔，對每個細胞株，每個濃度均為三個復孔。腫瘤細胞在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)48小時后，加MTT(Sigma)液5mg/ml用生理鹽水配制20μl/孔；繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，加入三聯(lián)液(10％SDS-5％異丁醇-0.01mol/LHCL)50μl/孔，于C～O2培養(yǎng)箱中過夜。然后在570nm用酶標儀測定OD值。觀測指標按下列公式計算被測物對癌細胞生長的抑制率，半數(shù)抑制量IC50值采用Logit法計算。具體實施例方式下面結合具體實施實例對本發(fā)明作進一步闡述，但不限制本發(fā)明。1H-NMR用VarianInova600型儀測定；MS(ESIMS及HRESIMS)用Finnigan-MAT-95型儀測定；所使用的硅膠，為青島海洋化工廠生產，反相硅膠為天津市化學試劑二廠色譜技術開發(fā)公司生產；所使用的高效液相系統(tǒng)Agilent1100，檢測器VWDG1314A，檢測波長230nm，半制備柱ODS-HG-5[5μm，10mm(i.d.)×25cm]，洗脫系統(tǒng)乙腈/水。實施例一長鏈多羥基多烯類化合物lingshuiolA，B，C的制備(1).提取中國南海前溝藻屬(Amphidiniumsp.)甲藻(濕重2.0kg)用甲苯/甲醇(1∶3)反復超聲提取3次，提取液合并后減壓濃縮，所得流浸膏混懸于1NNaCl(500ml)溶液，以甲苯反復萃取該混懸液3次，所得萃取液合并后減壓濃縮得到甲苯層9.0g。(2).分離甲苯提取物9.0g以200-300目硅膠柱層析，氯仿/甲醇(98∶2，95∶5，90∶10，80∶20，50∶50，甲醇)梯度洗脫，氯仿/甲醇50∶50洗脫部分7.6g，以反相RP-18硅膠純化，甲醇/水(40∶60，50∶50，60∶40，70∶30，80∶20，MeOH)洗脫，甲醇/水60∶40洗脫部分經(jīng)高效液相色譜純化〔Agilent1100，檢測器VWDG1314A，檢測波長230nm，半制備柱ODS-HG-5[5μm，10mm(i.d.)×25cm]洗脫系統(tǒng)乙腈/水(35∶65)，保留時間41.2min得到新化合物lingshuiolA(16.0mg，0.0008％wetweight)；洗脫系統(tǒng)乙腈/水(33∶67)，保留時間15.7min得到新化合物lingshuiolB(25.7mg，0.0013％wetweight)。洗脫系統(tǒng)乙腈/水(22∶78)，保留時間41.1min得到新化合物lingshuiolC(22.5mg，0.0011％wetweight)。權利要求1.一類從海洋甲藻中提取的抗腫瘤活性成份陵水醇，其特征在于具有如下化學結構其中化合物2為其中化合物3為2.如權利要求1所述的抗腫瘤活性成份陵水醇、制備方法，其特征在于甲藻用甲醇/甲苯混合溶劑提取，減壓濃縮提取液得粗浸膏；將該浸膏溶于NaCl溶液，混懸均勻后用甲苯萃取，濃縮甲苯萃取液得到甲苯浸膏；甲苯部位經(jīng)反復硅膠柱層析，最后經(jīng)高效液相色譜純化得到長鏈多羥基多烯類化合物。3.根據(jù)權利要求2所述的抗腫瘤活性成份陵水醇、制備方法，其特征在于甲苯∶甲醇＝1∶3反復超聲波提取。4.根據(jù)權利要求2所述的抗腫瘤活性成份陵水醇、制備方法，其特征在于該浸膏溶于NaCl溶液的當量為0.7～1.5N。5.根據(jù)權利要求2所述的抗腫瘤活性成份陵水醇、制備方法，其特征在于甲苯提取液經(jīng)硅膠柱層析、流動相為氯仿∶甲醇為98∶2，95∶5，90∶10，80∶20，50∶50，甲醇梯度冼脫。6.根據(jù)權利要求2所述的抗腫瘤活性成份陵水醇、制備方法，其特征在于氯仿∶甲醇＝50∶50的冼脫部分濃縮后以反相RP-18硅膠純化，甲醇/水40∶60，50∶50，60∶40，70∶30，80∶20，甲醇梯度冼脫，甲醇/水60∶40洗脫部分經(jīng)HPLC純化，洗脫系統(tǒng)乙腈/水(35∶65)，保留時間41.2min得到新化合物lingshuiolA(16.0mg，0.0008％wetweight)；洗脫系統(tǒng)乙腈/水(33∶67)，保留時間15.7min得到新化合物lingshuiolB(25.7mg，0.0013％wetweight)。洗脫系統(tǒng)乙腈/水(22∶78)，保留時間41.1min得到新化合物lingshuiolC(22.5mg，0.0011％wetweight)。7.如權利要求1所述的陵水醇的醫(yī)學用途是制備預防、治療腫瘤疾病藥物中應用。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術領域：
，具體是一類從海洋甲藻(Amphidiniumsp.)中提取、分離獲得的新型的具有顯著抗腫瘤活性的長鏈多羥基多烯類化合物，結構如右式經(jīng)多次體外抗腫瘤活性實驗表明，該類化合物具有明顯的抑制腫瘤細胞活性，可望在制備抗癌癥藥物中應用。本發(fā)明可為研制新的治療各種常見多發(fā)癌癥藥物提供先導化合物，對開發(fā)利用中國的海洋生物資源具有重要意義。文檔編號C07C309/00GK1680304SQ20041001759公開日2005年10月12日申請日期2004年4月9日優(yōu)先權日2004年4月9日發(fā)明者郭躍偉,黃孝春,趙迪,吳厚銘,丁健,林莉萍申請人:中國科學院上海藥物研究所