專(zhuān)利名稱(chēng)：用于毛細(xì)管電泳DNA片段分離的低pH篩分溶液體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種用于毛細(xì)管電泳分離DNA片段的低pH篩分溶液體系。其特征在于基體緩沖溶液的pH值在7.0左右。該篩分體系可用于毛細(xì)管電泳在紫外檢測(cè)條件下分離相差一個(gè)堿基的DNA片段。
背景技術(shù)：
毛細(xì)管無(wú)膠篩分電泳的DNA分析在分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究中有重要的應(yīng)用價(jià)值。其技術(shù)關(guān)鍵在于使用具有高分辨率的篩分介質(zhì)。目前用于毛細(xì)管無(wú)膠電泳的高分子篩分介質(zhì)是水溶性高分子溶液。目前公開(kāi)報(bào)道的DNA分離介質(zhì)對(duì)DNA片段的分離都是在pH值較高的TBE(Tris-borate-EDTA，即89mmol/L三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)，89mmol/L硼酸(boric acid)，2mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，pH＝8.3)，TTE(Tris-TAPS-EDTA，即50mmol/L三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)，50mmol/L TAPS(N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-amino-propanesulfonic acid)，2.0mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，pH＝8.2)，TAPS-NaOH(100mmol/Lol/L N-tris(hydroxymethyl)methyl-3-amino-propanesulfonicacid，用NaOH調(diào)pH值到8.0)等緩沖液中進(jìn)行的，而且采用的是熒光試劑和激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)手段的條件下獲得的。用于紫外檢測(cè)條件則分離效果很差。較高pH值的緩沖溶液還有可能使如丙烯酰胺類(lèi)的DNA篩分介質(zhì)發(fā)生水解，從而影響分離效果。一般使用的熒光試劑價(jià)格昂貴，毒性大，如溴化乙錠(EtBr)。激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器的價(jià)格又使其不易推廣。而在紫外檢測(cè)條件下，毛細(xì)管電泳單堿基分離DNA片段還比較困難。
關(guān)于聚丙烯酰胺(LPA)、聚N，N-二甲基丙烯酰胺(PDMA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，以及它們的混合溶液體系作為DNA分離介質(zhì)的情況已有諸多報(bào)道。
1990年，已有聚丙烯酰胺(LPA)作為DNA分離介質(zhì)的報(bào)道。多年來(lái)的研究結(jié)果顯示，聚丙烯酰胺(LPA)的黏度大，操作不便，不能在空柱中使用，在堿性條件下容易水解，等等。
關(guān)于聚N，N-二甲基丙烯酰胺(PDMA)作為DNA分離介質(zhì)，文獻(xiàn)(MadabhushiR S，Electrophoresis，1998，19224-230)認(rèn)為其粘度小，具有動(dòng)態(tài)涂層能力分離能力較強(qiáng)。用TAPS-NaOH(pH8.0)緩沖溶液稀釋的6.5％PDMA(Mw98,000)用作四色熒光測(cè)序介質(zhì)在42℃時(shí)，空柱條件下，其單堿基分辨率可達(dá)600堿基左右，但是其中還是有一些沒(méi)有分開(kāi)的片段。
關(guān)于聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作為DNA分離介質(zhì)，文獻(xiàn)(Gao Q F，Yeung ES，Anal.Chem.，1998，701382-1388；Song J M，Yeung E S，Electrophoresis，2001，22748-754)報(bào)道，其水溶性好，粘度小，有自動(dòng)涂層能力，單色測(cè)序時(shí)，用TBE緩沖溶液稀釋的7％商品化的PVP(Mw1,000,000)能分離350bp的DNA片段。而在四色測(cè)序中，發(fā)現(xiàn)染料標(biāo)記的DNA片段的遷移率要比普通條件下更大，需加入10M尿素才能減少這種遷移差異。但是這種特殊條件下使用的含有極高濃度尿素的介質(zhì)溶液并不易于常規(guī)使用。
文獻(xiàn)(Song L，Liu T，Liang D，et al，Electrophoresis，2001，223688-3698)提供的一種新的DNA分離介質(zhì)，即聚丙烯酰胺和聚乙烯吡咯烷酮的互穿網(wǎng)絡(luò)(interpenetrating networks of polyacrylamide and polyvinylpyrrlidone，LPA/PVP)體系。這種體系的粘度小，具有動(dòng)態(tài)涂層能力，分離效率高，分離的重現(xiàn)性好。用TBE緩沖溶液稀釋的2％PVP(Mw1,000,000)和1％LPA(Mw400，000)的混合物溶液可以將DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pBR322/HaeIII中的22個(gè)片段很好地分開(kāi)，而且123/124bp達(dá)到了單堿基分離。但是其中使用了熒光試劑溴化乙錠(EtBr)，它具有很強(qiáng)的基因透變性，對(duì)人體和環(huán)境都有很大的毒性。
文獻(xiàn)(Wang Y.，Hao J.，Liang D.，et al，Electrophoresis.，2002，231460-1466)也提供了一種新的DNA分離介質(zhì)，聚N，N-二甲基取代聚丙烯酰胺和聚乙烯吡咯烷酮的互穿網(wǎng)絡(luò)(interpenetrating networks of(poly(N，N-dimethylacrylamide)and polyvinylpyrrlidone)。在以TBE緩沖溶液為背景電解質(zhì)的PVP溶液中聚合N，N-二甲基取代丙烯酰胺，得到的高分子混合溶液不經(jīng)純化，直接用于dsDNA的分離。在優(yōu)化條件下，DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pBR322/HaeIIIDNA中的22個(gè)片段在15分鐘內(nèi)成功分離，并且123/124bp的分離度達(dá)到了1.0(激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè))。但是同樣也使用了熒光試劑溴化乙錠(EtBr)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于毛細(xì)管電泳分離DNA片段的低pH(pH7.0左右)篩分溶液體系，這種分離體系在紫外檢測(cè)條件下就可以達(dá)到對(duì)DNA片段的單堿基分辨。
本發(fā)明提供了一種可用于DNA分離的篩分溶液體系，該篩分溶液體系的pH為6.5-7.5之間，優(yōu)選pH值為7.0。
該篩分溶液體系由篩分介質(zhì)和基體緩沖溶液組成。優(yōu)選的基體緩沖溶液可以為NaH2PO4-Na2HPO4磷酸鹽溶液，KH2PO4-K2HPO4磷酸鹽溶液，(NH4)H2PO4-(NH4)2HPO4磷酸鹽溶液，N，N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)-NaOH緩沖溶液，等等。優(yōu)選緩沖液摩爾濃度在5-50mmol/L之間，進(jìn)一步優(yōu)選20mmol/L。進(jìn)一步優(yōu)選的基體緩沖溶液為NaH2PO4-Na2HPO4磷酸鹽溶液，其磷酸鹽濃度優(yōu)選為20mmol/L，pH值為7.0。優(yōu)選的NaH2PO4是至少是分析純的。優(yōu)選的Na2HPO4的至少是分析純的。
所述的篩分介質(zhì)為水溶性高分子，優(yōu)選的水溶性高分子介質(zhì)可以是LPA，PDMA，LPA/PVP，PDMA/PVP。優(yōu)選的DMA單體是購(gòu)于日本東京工業(yè)化成株式會(huì)社。其優(yōu)選質(zhì)量濃度范圍在1～20％(質(zhì)量百分比)，進(jìn)一步優(yōu)選在1～10％，最優(yōu)選是6％。優(yōu)選的PVP系進(jìn)口分裝(購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司)。其優(yōu)選質(zhì)量濃度范圍在1～20％(質(zhì)量百分比)，進(jìn)一步優(yōu)選在1～10％，最優(yōu)選是6％。PVP的K值優(yōu)選為10～110，更優(yōu)選在20～50，最優(yōu)選為30。預(yù)定質(zhì)量的DMA單體與預(yù)定質(zhì)量的PVP之比在1∶1～6∶1之間。優(yōu)選在1∶1～3∶1。最優(yōu)選為1∶1。優(yōu)選的AM單體是購(gòu)于日本東京工業(yè)化成株式會(huì)社。其優(yōu)選質(zhì)量濃度范圍在1～20％(質(zhì)量百分比)，進(jìn)一步優(yōu)選在1～10％，最優(yōu)選是6％。上述高分子介質(zhì)的制備可以采用水溶液中的自由基聚合法。例如，先將預(yù)定質(zhì)量的PVP(K值為30)粉末溶解在預(yù)定體積的基體緩沖液磷酸鹽溶液中，然后加入至少分析純的預(yù)定質(zhì)量的DMA單體?；靹?，除氧，在惰性氣體氛圍下加入引發(fā)劑。該反應(yīng)可以在室溫，常壓下進(jìn)行，兩個(gè)小時(shí)內(nèi)聚合反應(yīng)可以完成?；蛘呃?，將預(yù)定質(zhì)量的至少分析純AM單體溶解在預(yù)定體積的基體緩沖液磷酸鹽溶液中?；靹?，除氧，在惰性氣體氛圍下加入引發(fā)劑。該反應(yīng)可以在室溫，常壓下進(jìn)行，兩個(gè)小時(shí)內(nèi)聚合反應(yīng)可以完成。能生成自由基的引發(fā)劑可以是過(guò)硫酸銨(APS和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)；過(guò)硫酸銨和3-二甲胺丙腈(3-dimethylaminopropionitrile，DMAPN)；過(guò)硫酸銨和3-二甲胺丙腈亞硫酸鹽；過(guò)氧化氫和硫酸亞鐵-抗壞血酸；過(guò)硫酸銨和亞硫酸氫鈉等。優(yōu)選過(guò)硫酸銨(APS，98％)和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED，99％)(均為電泳純，進(jìn)口分裝)。引發(fā)劑體系推薦使用量(按聚合前基體緩沖液的體積10ml計(jì))APS溶液的濃度優(yōu)選為10～40％(質(zhì)量體積百分比)，最優(yōu)選為10％；用量?jī)?yōu)選為10～50ul，更優(yōu)選為20～30ul。TEMED溶液的濃度優(yōu)選為10～40％(體積百分比)，最優(yōu)選為10％；用量?jī)?yōu)選為20～100ul，更優(yōu)選為40～60ul。引發(fā)劑加入順序例如先加TEMED溶液，在待聚合溶液充分除氧后，在惰性氣體氛圍下迅速向反應(yīng)體系中加入APS溶液。本發(fā)明提供的制備反應(yīng)可以在10～40℃之間進(jìn)行，優(yōu)選20～30℃。
基體緩沖液選用磷酸鹽溶液時(shí)，為了消除體系中金屬或其它雜質(zhì)的影響，除了使用高純度的反應(yīng)試劑外，還可以向體系中加入螯合劑EDTA。例如在10ml，20mmol/L的NaH2PO4-Na2HPO4溶液中加入100ul，1mmol/L EDTA。還可以向體系中加入DNA變性劑尿素或者甲酰胺，體系中尿素的含量?jī)?yōu)選為3.5-8mol/L；或者體系中甲酰胺的含量?jī)?yōu)選為10％-50％，濃度單位為v/v。
用做DNA分離介質(zhì)的高分子的分子量可以根據(jù)被分離DNA的大小在很寬范圍內(nèi)變化。例如，高分子可達(dá)100,000～10,000,000。優(yōu)選500,000～5,000,000。更優(yōu)選500,000～1,000,000。可以用多角度激光光散射與分子排阻色譜聯(lián)用技術(shù)(MALLS-SEC法)來(lái)測(cè)定高分子的分子量及其分布。
本發(fā)明提供的低pH(pH7.0左右)篩分溶液體系在紫外檢測(cè)條件下就可以達(dá)到對(duì)DNA片段的單堿基分辨。


1，圖1是2％PDMA/PVP溶液(含15％v/v甲酰胺)對(duì)DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pBR322/HaeIII Markers的毛細(xì)管電泳分離譜圖。
2，圖2是圖1中123/124片段的局部放大圖。
3，圖3是2％LPA溶液(含7M尿素)對(duì)DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pBR322/HaeIII Markers毛細(xì)管電泳分離譜圖。
4，圖4是圖3中123/124片段的局部放大圖。
5，圖5是2％LPA溶液(含7M尿素)對(duì)DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pBR322/Msp I Markers和φχ174/HaeIII Markers的1∶1混合溶液的毛細(xì)管電泳分離譜圖。
6，圖6是圖5中309/310片段的局部放大圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一篩分介質(zhì)PDMA/PVP(去活條件)的制備和配制取一只干燥潔凈的25ml的三頸瓶，向其中加入0.6g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，0.619ml N，N-二甲基丙烯酰胺(DMA)，10ml NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(20mmol/L，pH7.0)，將兩者充分混勻。再加入100μl的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(1mmol/L)溶液，100μl的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)(10％v/v)溶液。混勻，抽氣，除氧(惰性氣體保護(hù))，加入50μl的過(guò)硫酸銨(APS)(10％w/v)溶液?；靹?，靜置。反應(yīng)結(jié)束后，可不經(jīng)純化，直接將聚合產(chǎn)物裝入塑料瓶中，置于冰箱中冷藏保存。使用時(shí)將制得的PDMA/PVP高分子用NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(20mmol/L，pH7.0)溶解并稀釋到2％(高分子溶液濃度單位為w/v)。再分別取2％(w/v)的高分子體系PDMA/PVP溶液和甲酰胺按85∶15的體積比混勻，作為DNA篩分介質(zhì)。
毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)的條件如下
使用紫外260nm檢測(cè)。恒壓操作模式，電壓為4kV(-→+)。電動(dòng)進(jìn)樣，-4kV×3s。轉(zhuǎn)盤(pán)、柱溫設(shè)定為25℃。數(shù)據(jù)由工作站收集并處理。實(shí)驗(yàn)時(shí)，先將聚丙烯酰胺涂層毛細(xì)管柱用水沖洗180秒，之后用篩分介質(zhì)溶液沖洗180秒。在進(jìn)樣前，最好將毛細(xì)管柱的進(jìn)樣端在蒸餾水中浸一次以清洗毛細(xì)管柱的外壁，以免污染DNA樣品。
高分子體系2％(w/v)PDMA/PVP用作篩分介質(zhì)所得到的DNA分離譜圖，如圖1所示。其中123/124組分的峰分離函數(shù)p＝0.39，Rs＝0.75。
實(shí)施例二篩分介質(zhì)LPA(去活條件)的制備和配制取一只干燥潔凈的25ml的三頸瓶，向其中加入0.6g丙烯酰胺(AM)，10mlNaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(20mmol/L，pH7.0)，將兩者充分混勻。再加入100μl的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(1mmol/L)溶液，100μl的N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(TEMED)(10％v/v)溶液?；靹?，抽氣，除氧(惰性氣體保護(hù))，加入50μl的過(guò)硫酸銨(APS)(10％w/v)溶液?；靹?，靜置。反應(yīng)結(jié)束后，可不經(jīng)純化，直接將聚合產(chǎn)物裝入塑料瓶中，置于冰箱中冷藏保存。使用時(shí)將制得的LPA高分子用NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(20mmol/L，pH7.0)溶解并稀釋到2％(高分子溶液濃度單位為w/v)。實(shí)驗(yàn)時(shí)將的2％LPA高分子用含有7mol/L尿素的NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液(20mmol/L，pH7.0)溶解，并稀釋到2％(高分子溶液濃度單位為w/v)。
毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)的條件如下使用紫外260nm檢測(cè)。恒壓操作模式，電壓為4kV(-→+)。電動(dòng)進(jìn)樣，-5kV×5s。轉(zhuǎn)盤(pán)、柱溫設(shè)定為25℃。數(shù)據(jù)由工作站收集并處理。實(shí)驗(yàn)時(shí)，先將聚丙烯酰胺涂層毛細(xì)管柱用水沖洗180秒，之后用篩分介質(zhì)溶液沖洗180秒。在進(jìn)樣前，最好將毛細(xì)管柱的進(jìn)樣端在蒸餾水中浸一次以清洗毛細(xì)管柱的外壁，以免污染DNA樣品。
2％的高分子體系LPA用作篩分介質(zhì)所得到的DNA分離譜圖，如圖2所示。其中123/124組分的峰分離函數(shù)p＝0.66，Rs＝0.79。
實(shí)施例三篩分介質(zhì)LPA(去活條件)的制備和配制篩分介質(zhì)LPA(去活條件)的制備和配制同實(shí)施例二。
毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)的條件同實(shí)施例二。
2％高分子體系LPA用作篩分介質(zhì)所得到的DNA分離譜圖，如圖5所示。其中309/310組分的峰分離函數(shù)p＝0.93，Rs＝0.67。
權(quán)利要求
1.一種用于毛細(xì)管電泳分離DNA片段的篩分溶液體系，其特征是該篩分溶液體系的pH為6.5-7.5之間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩分溶液體系，其特征在于該篩分溶液體系的pH為7.0。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩分溶液體系，其特征在于所述的篩分溶液體系由篩分介質(zhì)和基體緩沖溶液組成，所述的篩分介質(zhì)為水溶性高分子，所述的基體緩沖溶液可以為NaH2PO4-Na2HPO4磷酸鹽溶液，KH2PO4-K2HPO4磷酸鹽溶液，(NH4)H2PO4-(NH4)2HPO4磷酸鹽溶液或N，N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)-NaOH緩沖溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩分溶液體系，其特征在于所述的基體緩沖溶液為NaH2PO4-Na2HPO4磷酸鹽溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩分溶液體系，其特征在于所述的緩沖液摩爾濃度在5-50mmol/L之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩分溶液體系，其特征在于所述的緩沖液摩爾濃度在20mmol/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩分溶液體系，其特征在于所述的水溶性高分子可以是線(xiàn)性聚丙烯酰胺(LPA)；線(xiàn)性聚N，N-二甲基丙烯酰胺(PDMA)；線(xiàn)性聚丙烯酰胺與聚乙烯吡咯烷酮的混合物(LPA/PVP)；或者線(xiàn)性聚N，N-二甲基丙烯酰胺與聚乙烯吡咯烷酮的混合物(PDMA/PVP)。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩分溶液體系，其特征在于所述的水溶性高分子的含量為0.5-4％，其中高分子溶液濃度單位為w/v。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩分溶液體系，其特征在于所述的水溶性高分子的含量為2％，其中高分子溶液濃度單位為w/v。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩分溶液體系，其特征在于體系中加入螯合劑EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的篩分溶液體系，其特征在于體系中螯合劑EDTA的含量在0-2mmol/L。
12.根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩分溶液體系，其特征在于體系中加入DNA變性劑尿素或甲酰胺。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的篩分溶液，其特征在于體系中尿素的含量為3.5-8mol/L；或者甲酰胺的含量為10％-50％，濃度單位為v/v。
14.權(quán)利要求1～15中任意一項(xiàng)所述的篩分溶液體系用于毛細(xì)管電泳在紫外檢測(cè)條件下分離相差一個(gè)堿基的DNA片段的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于毛細(xì)管電泳分離DNA片段的低pH篩分溶液體系。其基體緩沖溶液的pH值在6.5～7.5左右，優(yōu)選為7.0左右。該篩分體系可用于毛細(xì)管電泳在紫外檢測(cè)條件下分離相差一個(gè)堿基的DNA片段。
文檔編號(hào)C07H1/06GK1560067SQ200410016929
公開(kāi)日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2004年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月12日
發(fā)明者許旭, 王前, 戴立信, 許 旭 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所