專利名稱：水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用高山被孢霉(Mortierella alpina)生產(chǎn)花生四烯(Arachidonic acid，簡稱ARA)油脂的工藝，屬于生物工程領(lǐng)域。具體地說，利用生物酶破碎高山被孢霉的 細(xì)胞壁，從而提取花生四烯酸油脂的方法，是生物工程下游過程中分離提取的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
花生四烯酸(Arachidonic acid，ARA，即5，8，11，14-二十碳四烯酸)屬于ω-6系 列長鏈多不飽和脂肪酸(PUFAs)，是一種人體最活躍和必需的多不飽和脂肪酸，具有促進(jìn)智 力發(fā)育、提高人體視力、降低血脂、增強(qiáng)免疫力和抗癌等功效，被廣泛應(yīng)用于功能保健、生物 醫(yī)藥、化妝品及飼料添加劑等方面。由于花生四烯酸油脂在成年人體內(nèi)合成量極少，嬰幼兒 體內(nèi)則無法合成，因此從食物中攝取額外的花生四烯酸油脂對(duì)人體許多組織特別是腦組織 的生長發(fā)育至關(guān)重要。花生四烯酸油脂的傳統(tǒng)來源是從動(dòng)物肝臟、豬腎上腺、血液、魚油中提取，但動(dòng)物 組織中的花生四烯酸油脂含量很低(約為0.2% )，來源少，且受季節(jié)限制，價(jià)格昂貴，無 法滿足日益增長的市場需求。微生物合成花生四烯酸油脂以生產(chǎn)周期短、環(huán)境污染小、 原料來源廣泛、可持續(xù)發(fā)展性強(qiáng)和產(chǎn)品質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)逐漸替代了傳統(tǒng)花生四烯酸油脂的 制備方法，其中以高山被孢霉(Malpina)的花生四烯酸油脂含量最高(Higashiyama K， Biotechnology and Bioprocess Engineering，2002，7 :252_262)，且利用高山被孢霉生產(chǎn) 花生四烯酸油脂已經(jīng)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。因此，花生四烯酸油脂的提取工藝成為微生物合成法工 業(yè)化生產(chǎn)的一個(gè)必要環(huán)節(jié)。從高山被孢霉中提取花生四烯酸油脂的方法主要有(1)索式提取法，發(fā)酵液抽 濾集菌，烘干研碎，裝入索式提取器，正己烷加熱回流提取十二小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除正己烷 即得油脂。(2)有機(jī)溶劑萃取法，發(fā)酵液抽濾集菌，按一定比例加入有機(jī)溶劑(常用的有石 油醚，乙醇 正己烷，氯仿 甲醇，乙醚)，振蕩混勻，離心取有機(jī)相，蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑即得 油脂。(3)超聲波提取法，發(fā)酵液超聲波破解細(xì)胞壁，加入機(jī)溶劑萃取，離心取有機(jī)相，蒸發(fā) 去除有機(jī)溶劑即得油脂。(4)超臨界CO2萃取法，發(fā)酵液抽濾集菌，烘干研碎，裝入萃取管， 超臨界狀態(tài)下分離出油脂。但是，這些油脂提取方法存在著種種缺點(diǎn)與不足(1)索式提取法，耗時(shí)長，冷卻 水用量大，難以批量提取，僅局限在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的油脂提取。(2)有機(jī)溶劑法油脂收率低，油 脂品質(zhì)差，對(duì)花生四烯酸而言，有機(jī)溶劑的殘留存在食用安全性的潛在問題。(3)超聲波提 取所需功率大，處理規(guī)模小，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。(4)超臨界CO2萃取，設(shè)備復(fù)雜，生產(chǎn)成本高， 僅局限在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的油脂提取。因此，需要尋求一種油脂收率高、油脂品質(zhì)高、功效高、能 耗低且易于工業(yè)化的油脂提取方法，利用水酶法對(duì)高山被孢霉菌體進(jìn)行花生四烯酸油脂的 提取工藝未見文獻(xiàn)報(bào)道。水酶法以功效高、油脂品質(zhì)高、能耗低、易于批量化處理等特點(diǎn)，日益得到科研界 和工業(yè)界的重視。公開號(hào)CN101307341A利用生物酶對(duì)寇式隱甲藻進(jìn)行油脂提取，論證了酶解法對(duì)海藻細(xì)胞的可行性；公開號(hào)CN101531689A和CN101235399A論證了酶解法對(duì)植物細(xì) 胞的可行性。本發(fā)明以三種蛋白酶(堿性蛋白酶，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶)以及六種多 糖水解酶(纖維素酶，木聚糖酶，果膠酶，糖化酶，淀粉酶和蝸牛酶)為研究重點(diǎn)，提供一種 花生四烯酸水酶法提取工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝，以高 效、批量化萃取花生四烯酸油脂，并通過優(yōu)化工藝條件，獲得較高的油脂收率。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下一種水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝，包含如下步驟(1)培養(yǎng)高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸；(2)向步驟(1)得到的發(fā)酵液中，加蒸餾水稀釋1 3體積倍數(shù)制成菌體懸浮液， 加入0. 25 2. 5g/L的生物酶，調(diào)節(jié)體系pH值至生物酶的酶解反應(yīng)最適pH，調(diào)節(jié)體系溫度 至生物酶的酶解反應(yīng)最適溫度，進(jìn)行酶解6 10h ；(3)向步驟(2)得到的酶解后的體系中，加入體系體積的10 15% (v/v)的乙醇 和20 40% (v/v)的正己烷進(jìn)行油脂萃取，離心分層，取有機(jī)相；向剩下的水相和固體相 中，加入步驟(2)得到的酶解后體系體積的20 40% (v/v)的正己烷進(jìn)行二次萃取，離心 分層，取有機(jī)相，合并兩次有機(jī)相；(4)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)收集的有機(jī)相，得到花生四烯酸油脂。其中，所述的生物酶為纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、糖化酶、淀粉酶、蝸牛酶、木瓜 蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶中的任意一種或幾種。當(dāng)所加入的生物酶為單一酶時(shí)，各種酶的酶解條件如下纖維素酶，最適pH為4. 5 5. 5，最適溫度為40 50°C ；木聚糖酶，最適pH為3. 5 5. 5，最適溫度為50 60°C ；果膠酶，最適pH為3. 5 4. 5，最適溫度為50 60°C ；糖化酶，最適pH為4.0 4. 5，最適溫度為60 62°C ；淀粉酶，最適pH為5. 5 6. 5，最適溫度為50 55°C ；蝸牛酶，最適pH為5. 8 7. 2，最適溫度為37 45°C ；木瓜蛋白酶，最適pH為5. 5 6.0，最適溫度為45 65°C ；堿性蛋白酶，最適pH為7. 5 9.0，最適溫度為45 60°C ；中性蛋白酶，最適pH為6. 5 7. 5，最適溫度為45 60°C。當(dāng)所加入的生物酶為多種酶時(shí)，采用依次向菌體懸浮液中加入單一酶進(jìn)行酶解的 方式，每一種酶都在其最適PH條件和最適反應(yīng)溫度下進(jìn)行酶解，一種酶的反應(yīng)結(jié)束之后， 再加入另外一種酶。本發(fā)明對(duì)每一種酶的比例沒有任何限制，只要求所有酶的總加入量為 0. 25 2. 5g/L。本發(fā)明對(duì)每一種酶的酶解時(shí)間沒有任何限制，只要求所有酶的酶解總時(shí)間 為6 10h。有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比有如下優(yōu)點(diǎn)(1)水酶法效率高，能耗低，易于批量化大規(guī)模應(yīng)用。相對(duì)于常規(guī)花生四烯酸油脂的提取方法，水酶法易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，和超聲波提取相比，水酶法反應(yīng)條件溫和，效率高，能耗低。和索式提取法相比，可以節(jié)約大量冷卻水 的使用。(2)水酶法反應(yīng)設(shè)備簡易，成本低，適用性強(qiáng)。
水酶法反應(yīng)設(shè)備簡單，實(shí)驗(yàn)室規(guī)?？梢灾苯邮褂迷嚬芑驌u瓶進(jìn)行油脂提??；工業(yè) 化規(guī)模可以直接使用花生四烯酸發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵罐進(jìn)行原位酶解提取，不需要對(duì)其進(jìn)行任 何改造，從而使操作成本大大降低，適用性強(qiáng)。(3)水酶法提取花生四烯酸油脂收率高，品質(zhì)高。在水酶法提取工藝的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化工藝條件，相比索式提取法(文獻(xiàn)報(bào)道此 法提油，收率最高)最終獲得90 100%的油脂收率，水酶法提取的油脂，呈金黃色，清澈明 亮，并且油脂中花生四烯酸相對(duì)含量相比索式提取法偏高10 15%。


圖1為本發(fā)明水酶法提取花生四烯酸油脂工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限 制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。以下實(shí)施例所用的菌種為高山被孢酶(Mortierella alpine)，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M 207067。實(shí)施例1 菌種發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基配方如下種子培養(yǎng)基100g/L葡萄糖，llg/L酵母粉，8g/L玉米漿，3. 8g/L KH2PO4,初始pH 為 5. 0-6. 0。發(fā)酵培養(yǎng)基100g/L葡萄糖，llg/L 酵母粉，3.8g/L KH2PO4, 3. 4g/L NaNO3,0. 5g/ LMgSO4. 7H20。初始 pH 為 5. 5-6. 5。1)菌種活化在制備種子之前，采用PDA斜面進(jìn)行菌種活化，并將活化的菌種轉(zhuǎn)入PDA固體培養(yǎng) 基中培養(yǎng)3 5天，以積累大量孢子備用。2)種子一次放大將生長在PDA固體培養(yǎng)基上的高山被孢霉的孢子用無菌水洗脫后，通過無菌操作 接入裝有種子培養(yǎng)基的凹槽搖瓶中。搖瓶裝液量為50ml/250ml。種子培養(yǎng)條件搖床轉(zhuǎn)速 為150rpm，培養(yǎng)溫度為25°C，培養(yǎng)時(shí)間為2 3天。3)種子二次放大將2)中培養(yǎng)的菌種通過無菌操作接入裝有種子培養(yǎng)基凹槽搖瓶中。凹槽搖瓶裝 液量為100mL/500mL。接種量為5% (ν/ν)，即5mL。種子培養(yǎng)條件搖床轉(zhuǎn)速為150rpm，培 養(yǎng)溫度為25°C，培養(yǎng)時(shí)間為3天。4)菌種發(fā)酵培養(yǎng)將3)中培養(yǎng)的菌種通過無菌操作接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的凹槽搖瓶中。凹槽搖裝液量為100mL/500mL。接種量為10% (v/v)，即10mL。培養(yǎng)條件搖床轉(zhuǎn)速為150rpm，培養(yǎng) 溫度為25°C，培養(yǎng)時(shí)間為7 8天。實(shí)施例2 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體，在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液，調(diào)節(jié)PH值為6. 0，按30mL等量分裝在50mL試管中，加入蝸牛酶20mg，40°C恒溫振蕩8 小時(shí)；加乙醇4mL和10mL正己烷進(jìn)行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，向剩下的 水相和固體相中，加10mL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4854g，對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 4994g，油脂收 率為97. 2%。實(shí)施例3 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體，在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液，調(diào)節(jié)PH值為6. 0，按30mL等量分裝在50mL試管中，加入蝸牛酶20mg，37°C恒溫振蕩8 小時(shí)；加乙醇4. 5mL和10mL正己烷進(jìn)行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，向剩下 的水相和固體相中，加10mL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4752g，對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 4994g，油脂 收率為95. 1%0實(shí)施例4 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體，在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液，調(diào)節(jié)PH值為6. 0，按30mL等量分裝在50mL試管中，加入蝸牛酶20mg，45°C恒溫振蕩8 小時(shí)；加乙醇3mL和12mL正己烷進(jìn)行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，向剩下的 水相和固體相中，加12mL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4823g，對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 4994g，油脂收 率為96. 6%。實(shí)施例5 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體，在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液，調(diào)節(jié)pH值為7. 2，按30mL等量分裝在50mi試管中，加入蝸牛酶20mg，40°C恒溫振蕩8 小時(shí)；加乙醇3mL和6mL正己烷進(jìn)行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，向剩下的水 相和固體相中，加10mL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4741g，對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 4994g，油脂收率 為 94. 9%。實(shí)施例6 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體，在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋3體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液，調(diào)節(jié)PH值為8. 0，按30mL等量分裝在50mL試管中，加入堿性蛋白酶40mg，50°C恒溫振 蕩8小時(shí)；加乙醇4mL和10mL正己烷進(jìn)行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，向剩 下的水相和固體相中，加10mL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，合并有機(jī)相旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4472g，對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 4883g，油 脂收率為91.6%。實(shí)施例7 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體，在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋3體積倍數(shù)制成菌體懸浮
6液，調(diào)節(jié)PH值為4. 0，按30mL等量分裝在50mL試管中，加入果膠酶40mg，55°C恒溫振蕩8 小時(shí)；加乙醇4mL和IOmL正己烷進(jìn)行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，向剩下的 水相和固體相中，加IOmL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4783g，對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 4994g，油脂收 率為95. 8%。表1是實(shí)施例2 7所提油脂成分分布情況。表 1 實(shí)施例8 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體，在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋1體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液，調(diào)節(jié)PH值為4. 8，按30mL等量分裝在50mL試管中，加入纖維素酶40mg，45°C恒溫振蕩 8小時(shí)；加乙醇4mL和IOmL正己烷進(jìn)行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，向剩下的 水相和固體相中，加IOmL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4703g,對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 5186g，油脂收 率為90. 7%。實(shí)施例9 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體，在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋1體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液，調(diào)節(jié)PH值為5. 5，按30mL等量分裝在50mL試管中，加入木瓜蛋白酶40mg，55°C恒溫振 蕩8小時(shí)；加乙醇4mL和IOmL正己烷進(jìn)行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，向剩 下的水相和固體相中，加IOmL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，合并有機(jī)相旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4943g，對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 5186g，油 脂收率為95.3%。實(shí)施例10 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體，在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液，調(diào)節(jié)PH值為7. 0，按30mL等量分裝在50mL試管中，加入中性蛋白酶40mg，50°C恒溫振 蕩8小時(shí)；加乙醇4mL和IOmL正己烷進(jìn)行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，向剩 下的水相和固體相中，加IOmL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，合并有機(jī)相旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4685g，對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 4883g，油 脂收率為95. 9%。表2是實(shí)施例8 10所提油脂成分分布情況。表 2 實(shí)施例11 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體，在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液，調(diào)節(jié)PH值為4. 0，按30mL等量分裝在50mL試管中，加入木聚糖酶20mg，55°C恒溫振蕩 8小時(shí)；加乙醇4mL和IOmL正己烷進(jìn)行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，向剩下的 水相和固體相中，加IOmL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4808g,對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 4994g，油脂收 率為96. 3%。實(shí)施例12 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體，在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液，調(diào)節(jié)PH值為4. 5，按30mL等量分裝在50mL試管中，加入糖化酶40mg，60°C恒溫振蕩8 小時(shí)；加乙醇4mL和IOmL正己烷進(jìn)行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，向剩下的 水相和固體相中，加IOmL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4682g，對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 5186g，油脂收 率為90. 3%。實(shí)施例13 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體，在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液，調(diào)節(jié)PH值為6. 0，按30mL等量分裝在50mL試管中，加入淀粉酶60mg，55°C恒溫振蕩8 小時(shí)；加乙醇4mL和IOmL正己烷進(jìn)行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，向剩下的 水相和固體相中，加IOmL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四烯酸油脂0. 4465g，對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 4994g，油脂收 率為89. 4%。表3是實(shí)施例11 13所提油脂成分分布情況。表3脂肪酸種類 _ 油脂中含_ (%)_ 實(shí)施例14 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體，在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液，按30mL等量分裝在50mL試管中，調(diào)節(jié)ρΗ值為8.0，加入堿性蛋白酶40mg，50°C恒溫振蕩 4小時(shí)后，將pH值調(diào)為4. 0，再加入果膠酶40mg，55°C恒溫振蕩4小時(shí)；加乙醇4mL和IOmL 正己烷進(jìn)行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，向剩下的水相和固體相中，加IOmL正 己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四 烯酸油脂0. 5238g，對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 5422g，油脂收率為96. 6%。實(shí)施例15 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體，在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液，按30mL等量分裝在50mL試管中，調(diào)節(jié)pH值為6. 0，加入蝸牛酶20mg，40°C恒溫振蕩4小 時(shí)后，將PH值調(diào)為7.0，再加入中性蛋白酶40mg，50°C恒溫振蕩4小時(shí)；加乙醇4mL和IOmL 正己烷進(jìn)行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，向剩下的水相和固體相中，加IOml正 己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四 烯酸油脂0. 4986g，對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 5075g,油脂收率為98. 2 %。實(shí)施例16 按照實(shí)施例1發(fā)酵培養(yǎng)菌體，在發(fā)酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數(shù)制成菌體懸浮 液，按30mL等量分裝在50mL試管中，調(diào)節(jié)pH值為6. 0，加入蝸牛酶20mg，40°C恒溫振蕩4小 時(shí)后，將PH值調(diào)為5. 5，再加入木瓜蛋白酶60mg，55°C恒溫振蕩4小時(shí)；加乙醇4mL和IOmL 正己烷進(jìn)行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，向剩下的水相和固體相中，加IOml正 己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機(jī)相，合并有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到有機(jī)溶劑和花生四 烯酸油脂0. 4225g，對(duì)照組索式提取法得到油脂0. 4209g,油脂收率為100. 3 %。表4是實(shí)施 例14 16所提油脂成分分布情況。表 權(quán)利要求
一種水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝，其特征在于，該工藝包含如下步驟(1)培養(yǎng)高山被孢霉發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸；(2)向步驟(1)得到的發(fā)酵液中，加蒸餾水稀釋1～3體積倍數(shù)制成菌體懸浮液，加入0.25～2.5g/L的生物酶，調(diào)節(jié)體系pH值至生物酶的酶解反應(yīng)最適pH，調(diào)節(jié)體系溫度至生物酶的酶解反應(yīng)最適溫度，進(jìn)行酶解6～10h；(3)向步驟(2)得到的酶解后的體系中，加入體系體積的10～15％(v/v)的乙醇和20～40％(v/v)的正己烷進(jìn)行油脂萃取，離心分層，取有機(jī)相；向剩下的水相和固體相中，加入步驟(2)得到的酶解后體系體積的20～40％(v/v)的正己烷進(jìn)行二次萃取，離心分層，取有機(jī)相，合并兩次有機(jī)相；(4)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)收集的有機(jī)相，得到花生四烯酸油脂。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝，其特征在于，所述的生 物酶為纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、糖化酶、淀粉酶、蝸牛酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和中 性蛋白酶中的任意一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝，其特征在于當(dāng)所加 入的生物酶為單一酶時(shí)，各種酶的酶解條件如下纖維素酶，最適pH為4. 5 5. 5，最適溫度為40 50°C ； 木聚糖酶，最適pH為3. 5 5. 5，最適溫度為50 60°C ； 果膠酶，最適pH為3. 5 4. 5，最適溫度為50 60°C ； 糖化酶，最適pH為4. 0 4. 5，最適溫度為60 62V ； 淀粉酶，最適pH為5. 5 6. 5，最適溫度為50 55°C ； 蝸牛酶，最適pH為5. 8 7. 2，最適溫度為37 45°C ； 木瓜蛋白酶，最適pH為5. 5 6. 0，最適溫度為45 65°C ； 堿性蛋白酶，最適pH為7. 5 9. 0，最適溫度為45 60°C ； 中性蛋白酶，最適pH為6. 5 7. 5，最適溫度為45 60°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝，其特征在于當(dāng)所加 入的生物酶為多種酶時(shí)，采用依次向菌體懸浮液中加入單一酶進(jìn)行酶解的方式，每一種酶 都在其最適PH條件和最適反應(yīng)溫度下進(jìn)行酶解，一種酶的反應(yīng)結(jié)束之后，再加入另外一種
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝，以高山被孢霉為出發(fā)菌株，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，加入蒸餾水稀釋制成菌體懸浮液，調(diào)節(jié)懸浮液pH值，加入生物酶恒溫振蕩6～10小時(shí)后，加入乙醇和正己烷進(jìn)行油脂萃取，離心分層后取有機(jī)溶劑相，然后在剩下的水相和固體相中加入正己烷進(jìn)行二次萃取，離心分層后合并有機(jī)溶劑相，有機(jī)溶劑相經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即可得到油脂和有機(jī)溶劑。本發(fā)明具有能耗低、成本低、花生四烯酸油脂收率高、品質(zhì)高、反應(yīng)設(shè)備簡易，易于批量大規(guī)模應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C11B1/00GK101870915SQ20101021459
公開日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者叢蕾蕾, 劉欣, 尤江英, 彭超, 紀(jì)曉俊, 路金淼, 黃和, 黎志勇 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)