一種采用灌注?壓差法制備脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種采用灌注?壓差法制備脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料的方法，包括：(1)將原材料分離出粘膜下層或全層后接入灌注反應(yīng)器，灌注消毒液同時(shí)超聲振蕩進(jìn)行預(yù)滅菌；(2)依次向分離出的空腔內(nèi)灌注細(xì)胞內(nèi)容物清洗液和抗原封閉/清除液，利用滲透壓差和/或液壓差洗去細(xì)胞內(nèi)容物、清除抗原；最終消毒滅菌、保存，即得。本發(fā)明可以顯著縮短生化試劑的處理時(shí)間、降低生化試劑的使用濃度；明顯提高了脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料中粘連蛋白類(lèi)、生長(zhǎng)因子類(lèi)、蛋白聚糖類(lèi)、糖蛋白類(lèi)、葡糖胺基聚糖類(lèi)等生物活性成分的保留量；同時(shí)力學(xué)強(qiáng)度保留好、脫細(xì)胞徹底，病毒等生物負(fù)載清除干凈；工業(yè)化生產(chǎn)方便，具有良好的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種采用灌注-壓差法制備脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物支架材料領(lǐng)域，特別涉及一種采用灌注-壓差法制備脫細(xì)胞基質(zhì) 生物材料的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 脫細(xì)胞技術(shù)制備的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)成分生物材料是軟 組織修復(fù)材料的重要發(fā)展方向。相關(guān)產(chǎn)品在國(guó)外被廣泛的用于各種創(chuàng)面，如代替腦膜、胸 膜、血管、骨膜、心包、關(guān)節(jié)囊等，肝脾等實(shí)質(zhì)臟器破損填塞止血、吻合口加強(qiáng)、膀胱懸吊、盆 底重建以及各種復(fù)雜疝和腹壁缺損的治療如伴有污染的腹壁缺損、合成補(bǔ)片植入后感染、 腸痿二次手術(shù)治療、造口旁疝預(yù)防等。
[0003] ECM是所有組織器官的組成部分，維持著各種組織器官的三維結(jié)構(gòu)和儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)物 質(zhì)，支撐著細(xì)胞賴(lài)生存、活動(dòng)和變化。ECM作為組織修復(fù)和再生支架材料具有較多優(yōu)勢(shì):①結(jié) 構(gòu)和組分接近自然，生物相容性佳:ECM的主要成分包括結(jié)構(gòu)蛋白（主要為I型和m型膠原纖 維，含少量IV型和VI型膠原纖維，其余部分主要為糖蛋白、纖粘蛋白、糖胺聚糖類(lèi)(硫酸軟骨 素、硫酸肝素、透明質(zhì)酸、蛋白多糖、結(jié)合生長(zhǎng)因子和儲(chǔ)留水等）、生長(zhǎng)因子與酶類(lèi)(堿性成纖 維細(xì)胞生成因子(bFGF)-2、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-I胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF)和血管內(nèi)皮生 長(zhǎng)因子(VEGF)、肝臟生長(zhǎng)因子(HGF)等）；②ECM保留"組織特異性"微環(huán)境，能夠維持生長(zhǎng)其 上的細(xì)胞形態(tài)和表型、增進(jìn)細(xì)胞的粘附、增殖和分化：以骨骼肌ECM為例，其ECM高IV型膠原 含量(骨骼肌基底膜的主要成分），具有復(fù)雜的、具有啟動(dòng)功能的三維超微結(jié)構(gòu)，包括平行排 列的基底膜(肌內(nèi)膜管)結(jié)構(gòu)、殘存的神經(jīng)和血管通路，利于成肌細(xì)胞粘附、迀移、激活和融 合，且其降解產(chǎn)物對(duì)維持成肌細(xì)胞和衛(wèi)星細(xì)胞的活力非常重要。③ECM有良好的可降解性和 降解速率可控性，降解更符合再生規(guī)律;④ECM具有一定的孔隙率，便于組織間的營(yíng)養(yǎng)和物 質(zhì)空氣的交換;⑤ECM具有一定的機(jī)械強(qiáng)度能夠?qū)M織的生長(zhǎng)起到支持作用。
[0004] ECM材料的制備均是將取自同種、異種的組織，經(jīng)脫細(xì)胞處理去除組織中的所有細(xì) 胞、抗原、脂質(zhì)、可溶性蛋白質(zhì)等物質(zhì)、保留下具有完整外觀形態(tài)和組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的不 溶性細(xì)胞外基質(zhì)。ECM生物修補(bǔ)材料攜帶生物活性成分的多少將直接影響其體內(nèi)重塑和修 復(fù)效果。脫細(xì)胞方案十分嚴(yán)酷，生物活性成分將丟失殆盡(粘連蛋白、生長(zhǎng)因子和糖胺聚糖 類(lèi)等生物活性成分含量保留量低于30% )，植入后僅可誘導(dǎo)再生出血管化的結(jié)締組織填充 組織缺損、實(shí)現(xiàn)解剖層面的修復(fù)。中國(guó)目前臨床上已有的關(guān)于ECM材料的應(yīng)用，包括替代腦 膜、胸膜，盆底重建、肛痿修補(bǔ)以及各種復(fù)雜疝和腹壁缺損的治療等均屬于這一水平。保留 了天然ECM中40%以上的生物活性成分、低免疫原性的產(chǎn)品植入后則能實(shí)現(xiàn)組織特異性的 誘導(dǎo)再生;如實(shí)現(xiàn)肌肉筋膜等組織再生和神經(jīng)支配恢復(fù)而改善殘疾肢體功能和斷指再造， 療效肯定。
[0005] 因此，相關(guān)制備技術(shù)發(fā)展的方向即是徹底脫細(xì)胞的同時(shí)最大限度保留生物活性成 分、并減少因材料引起的各種并發(fā)癥如漿液腫、修復(fù)區(qū)失彈性等。已有的片狀ECM材料的脫 細(xì)胞方法一般都是化學(xué)除垢劑聯(lián)合其他輔助試劑振蕩法，即將片狀材料置于處理液中劇烈 震蕩搖擺。這一方法存在較多缺點(diǎn):首先，外基質(zhì)生物材料如小腸粘膜下層、膀胱基質(zhì)，多為 致密結(jié)締組織結(jié)構(gòu)，一般的生化試劑+物理振蕩的方法并不能使得試劑穿透結(jié)締組織，試劑 只能被動(dòng)的處理材料表層細(xì)胞成分，無(wú)法深入具有一定厚度的組織發(fā)揮完全徹底的脫細(xì)胞 作用。其次，振蕩過(guò)程中極易導(dǎo)致片狀的細(xì)胞外基質(zhì)材料糾結(jié)而致使不能全部得到徹底的 脫細(xì)胞處理，部分細(xì)胞外基質(zhì)材料片段上的生物負(fù)載如真菌、病毒等滅活不充分，植入引起 較高水平的炎癥反應(yīng)、降低材料重塑效果;再次，振蕩洗出DNA、抗原等物質(zhì)需要較長(zhǎng)的處理 時(shí)間、生物活性成分丟失多，如細(xì)胞外基質(zhì)生物材料制備過(guò)程中都經(jīng)歷了堿處理，這一步驟 雖然可用于促進(jìn)材料的顯著擴(kuò)張(體積增加甚至達(dá)到6倍）、提高了孔隙率和表面的均勻性、 降低脂質(zhì)含量，但同時(shí)也幾乎全部耗盡了細(xì)胞外基質(zhì)中生物活性成分如生長(zhǎng)因子、糖蛋白、 葡萄糖胺聚糖、蛋白聚糖等，部分廠家常在之后步驟中，再次通過(guò)噴霧、浸泡、沉浸等方法補(bǔ) 充生物活性成分;最后，振蕩工藝過(guò)程需要多次人工更換液體，分離材料，操作繁瑣，所需時(shí) 間較長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種采用灌注-壓差法制備脫細(xì)胞基質(zhì)生物材 料的方法，該方法可以顯著縮短生化試劑的處理時(shí)間、降低生化試劑的使用濃度；明顯提高 了脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料中粘連蛋白類(lèi)、生長(zhǎng)因子類(lèi)、蛋白聚糖類(lèi)、糖蛋白類(lèi)、葡糖胺基聚糖 類(lèi)等生物活性成分的保留量；同時(shí)力學(xué)強(qiáng)度保留好、脫細(xì)胞徹底，病毒等生物負(fù)載清除干 凈;工業(yè)化生產(chǎn)方便，具有良好的應(yīng)用前景。
[0007] 本發(fā)明的一種采用灌注-壓差法制備脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料的方法，包括：
[0008] (1)將原材料分離出粘膜下層或全層后接入灌注反應(yīng)器，灌注消毒液同時(shí)超聲振 蕩進(jìn)行預(yù)滅菌；
[0009] (2)依次向分離出的空腔內(nèi)灌注細(xì)胞內(nèi)容物清洗液和抗原封閉/清除液，利用滲透 壓差和/或液壓差洗去細(xì)胞內(nèi)容物、清除抗原;最終消毒滅菌、保存，即得。
[0010]所述步驟(1)中的原材料為哺乳動(dòng)物(人、豬、牛、胎牛、馬、羊、狗）的空腔臟器(腸、 胃、膀胱)的粘膜下層或全層。
[0011 ]所述步驟(1)中的灌注反應(yīng)器為"灌注-套管機(jī)-灌注"自動(dòng)脫細(xì)胞反應(yīng)器。
[0012] 所述步驟（1)中的消毒液為醇與過(guò)氧化物、氧化性消毒劑或非氧化性消毒劑中一 種或多種;預(yù)滅菌的時(shí)間為1~5小時(shí)。預(yù)滅菌處理包括單純腔內(nèi)灌注或腔內(nèi)外聯(lián)合灌注，灌 注方式為循環(huán)或非循環(huán)灌注，消毒后PBS和去離子水交替灌注沖洗。消毒液優(yōu)選為過(guò)氧乙酸 (Peroxyacetic acid,PAA)/乙醇(EtOH)混合液，其中PAA的終濃度(V/V)為0 ·05-0 · 5%，乙 醇的終濃度(V/V)為0.5-10%，PAA/乙醇混合液的作用時(shí)間1-5小時(shí)，優(yōu)選為2-3小時(shí)，灌注 速度為管腔內(nèi)外液體每15分鐘更新一遍。
[0013] 所述步驟(2)中的細(xì)胞內(nèi)容物清洗液為含鹽緩沖液、堿性溶液或DNA增溶性緩沖鹽 等溶液中一種或幾種;洗去細(xì)胞內(nèi)容物的時(shí)間為0.1-16小時(shí)。
[0014] 所述步驟(2)中的抗原封閉/清除液為離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑或 酶類(lèi)(DNA酶、RNA酶、半乳糖苷酶)溶液中的一種或幾種，如濃度0.005-0.1 %的十二烷基硫 酸鈉或0.01-1 %的Triton-X，表面活性劑處理同時(shí)可協(xié)助脫脂、進(jìn)一步降低DNA含量。清除 抗原的時(shí)間為0.1 -16小時(shí)。
[0015] 所述步驟(2)中的洗去細(xì)胞內(nèi)容物、清除抗原之前(之中、之后也可)還包括灌注脫 脂溶劑進(jìn)行脫脂處理。
[0016] 所述脫脂溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇、丙酮、氯仿中的一種或幾種。
[0017] 步驟(2)中的灌注處理包括管腔內(nèi)灌注和管腔外灌注，管腔內(nèi)外流動(dòng)液體的種類(lèi)、 壓力（可內(nèi)外反復(fù)交替利用液體壓力差產(chǎn)生透壁液體交換）以及液體流向（同向或反向）均 可不同。灌注方式為循環(huán)或非循環(huán)灌注，管腔內(nèi)外灌注系統(tǒng)各自獨(dú)立。管腔外液體的質(zhì)量與 材料的體積比多2:1且要求材料全部浸于管腔外液體中。管腔內(nèi)外液體流量要求每15分鐘 全部更新一遍。
[0018] 預(yù)滅菌消毒液、細(xì)胞內(nèi)容物清洗液、抗原清除液可于管腔內(nèi)外同時(shí)灌注但保持不 同滲透壓或液體壓力，優(yōu)選方案是管腔內(nèi)外同時(shí)存在一定的滲透壓差和液體壓差，滲透壓 與液體壓形成同方向的透壁流，在不增加被灌注腔壁力學(xué)負(fù)荷的前提下達(dá)到增加細(xì)胞內(nèi)容 物的灌注洗出、降低免疫原性和封閉抗原的效果。
[0019] 所述灌注處理管腔內(nèi)外液體壓力差，不超過(guò)被灌注空腔臟器的粘膜下層或全層的 爆破壓(Burst Pressure)的最大值;管腔內(nèi)外滲透壓差為2-10倍，優(yōu)選2-4倍。
[0020] 所述步驟(2)中的消毒滅菌的方法為全反應(yīng)器系統(tǒng)預(yù)滅菌、全程滅菌液體灌注、灌 注消毒液、環(huán)氧乙烷滅菌、超臨界CO2滅菌、等離子體處理、γ射線(xiàn)輻射滅菌中的一種或幾 種。
[0021] 所述步驟(2)中的保存為冷凍干燥保存或保存液保存。
[0022]所述預(yù)滅菌、洗去細(xì)胞內(nèi)容物、清除抗原、消毒滅菌后均進(jìn)行灌注清洗，以便除去 保留在材料內(nèi)或材料上的引進(jìn)的化學(xué)殘留物。包括反復(fù)交替灌注去離子水、磷酸緩沖鹽或 生理鹽水，可輔助超聲振蕩。
[0023] 本發(fā)明灌注脫細(xì)胞處理的全程工作溫度1_30°C，優(yōu)選為4°C。
[0024]本發(fā)明全部操作步驟，除最初接入反應(yīng)器需要手工操作外，全程處理可由生產(chǎn)線(xiàn) 自動(dòng)完成。
[0025]本發(fā)明的高壓灌注指的是在腸管內(nèi)外同時(shí)以不同壓力(等靜水壓)/滲透壓的灌注 消毒液、抗原滅活試劑、脫脂劑，形成腸管內(nèi)外的均勻的液體壓力差或滲透壓差，借助這種 壓力差和快速的液體運(yùn)輸交換過(guò)程使試劑中的成分主動(dòng)性穿透組織，增強(qiáng)各項(xiàng)試劑的功 能，縮短處理時(shí)間，增強(qiáng)細(xì)胞破碎效果，快速洗去細(xì)胞內(nèi)容物，達(dá)到徹底脫除細(xì)胞的效果。這 種壓力差通常為腸管內(nèi)部壓力/滲透壓高于外部壓力/滲透壓。
[0026]本發(fā)明的原理：高壓/滲透壓差的灌注方法處理細(xì)胞外基質(zhì)生物材料的過(guò)程可以 分為三步:在灌注早期，由于腸管內(nèi)外存在均勻的液體壓/滲透壓差，勢(shì)必導(dǎo)致一定程度的 腸管內(nèi)外液體交換過(guò)程，而這種液體交換過(guò)程鑒于腸管的完整性?xún)H能通過(guò)細(xì)胞間隙發(fā)生。 這樣一方面可以增大試劑與細(xì)胞膜的接觸面積，促進(jìn)試劑深入組織內(nèi)部破壞細(xì)胞膜;另一 方面壓力/滲透壓差在一定程度上具有破碎細(xì)胞的效果。而單純使用生物化學(xué)試劑脫細(xì)胞 時(shí)，僅通過(guò)提高試劑濃度，延長(zhǎng)處理時(shí)間并不能達(dá)到相似效果。在灌注中期，在較短時(shí)間內(nèi)， 材料內(nèi)部的細(xì)胞膜和核膜基本破碎，細(xì)胞內(nèi)容物流出分散。在灌注后期，腸管內(nèi)外的壓力差 導(dǎo)致的液體交換可以在細(xì)胞間隙和破碎細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，以完全透壁流動(dòng)的液體交換方式快 速、徹底沖洗出殘留細(xì)胞內(nèi)容物。在這一步完全可以更換功能性試劑為中性化緩沖液體，以 達(dá)到相同的效果，減少破壞性試劑的使用。
[0027] 灌注-壓差法的優(yōu)勢(shì)：相對(duì)于振蕩法的不足①振蕩過(guò)程中極易導(dǎo)致片狀的細(xì)胞外 基質(zhì)材料纏繞而致使不能全部得到徹底的脫細(xì)胞處理，②振蕩洗出DNA、抗原等物質(zhì)需要較 長(zhǎng)的處理時(shí)間、生物活性成分丟失多，③工藝過(guò)程操作繁瑣;腔內(nèi)外聯(lián)合灌注制備法處理膜 狀或管狀細(xì)胞外基質(zhì)材料，通過(guò)壓力形成內(nèi)腔、外腔等壁兩側(cè)可反復(fù)交替的透壁液體流動(dòng)， 以溫和的方式持續(xù)不斷的洗去DNA、抗原等物質(zhì)。使用灌注可使用最少的液體流量、最短的 處理時(shí)間即可脫脂、洗走細(xì)胞成分、清除抗原和消毒，如灌注-壓差法以十分之一的化學(xué)試 劑濃度、二分之一的處理時(shí)間即獲得與機(jī)械振蕩法一樣的DNA去除和封閉抗原效果，同時(shí)保 留有更高的生物活性成分含量。此外，灌注-壓差法全部流程都可以使用電腦控制完成，除 了最初將膜狀原材料接入反應(yīng)器需要人工操作，其他步驟均可程控完成，不需要像機(jī)械振 蕩法那樣反復(fù)需人工解開(kāi)膜狀脫細(xì)胞基質(zhì)材料糾結(jié)、換液，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0028] 通過(guò)調(diào)節(jié)腔內(nèi)外灌注壓力成的透壁液體流動(dòng)，可以使得化學(xué)/生物試劑快速充分 的與細(xì)胞膜接觸，致使細(xì)胞膜和細(xì)胞核結(jié)構(gòu)破壞，內(nèi)容物流出，極大的縮短試劑的處理時(shí)間 和降低濃度，且透壁流動(dòng)可以確保細(xì)胞內(nèi)容物的徹底洗出。整個(gè)脫細(xì)胞過(guò)程快速、徹底且溫 和，更好的保留生物活性成分含量。
[0029] 有益效果
[0030]本發(fā)明可以顯著縮短生化試劑的處理時(shí)間、降低生化試劑的使用濃度；明顯提高 了脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料中粘連蛋白類(lèi)、生長(zhǎng)因子類(lèi)、蛋白聚糖類(lèi)、糖蛋白類(lèi)、葡糖胺基聚糖 類(lèi)等生物活性成分的保留量；同時(shí)力學(xué)強(qiáng)度保留好、脫細(xì)胞徹底，病毒等生物負(fù)載清除干 凈;工業(yè)化生產(chǎn)方便，具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0031 ]圖1為本發(fā)明自動(dòng)脫細(xì)胞反應(yīng)器結(jié)構(gòu)原理圖；
[0032]圖2為本發(fā)明的具體操作圖；
[0033]圖3為本發(fā)明制備的脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料的生物學(xué)特性比較;其中，A為DNA殘留 量，B為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子含量，C為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子_i3，D為成纖維生長(zhǎng)因子;*代表兩組間比 較存在顯著性差異(P〈〇. 05)。
[0034] 圖4為本發(fā)明制備的脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料的力學(xué)特性比較;其中，A為單向拉伸強(qiáng) 度;B為爆破力;C為透濕性;*代表兩組間比較存在顯著性差異(P〈0.05)。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定 的范圍。
[0036] 實(shí)施例1
[0037]灌注法脫細(xì)胞基質(zhì)的制備：
[0038] 原材料獲取:植物源飼料封閉飼養(yǎng)的大豬，體重150公斤以上，死亡后半小時(shí)取出 空腸。腔內(nèi)沖洗后置于2°C的長(zhǎng)征-1號(hào)器官保存液中，運(yùn)輸過(guò)程中維持溫度不超過(guò)4°C。
[0039] 預(yù)滅菌:豬空腸接入灌注反應(yīng)桿，腔內(nèi)循環(huán)灌注0.05%過(guò)氧乙酸/5%乙醇混合消 毒液，灌注速度l〇〇ml/min/m，同時(shí)腔外浸泡于0.05%過(guò)氧乙酸/5%乙醇混合消毒液，處理 時(shí)間15分鐘。已證實(shí)處理5分鐘可以完全滅活豬莢膜病毒，生物負(fù)載量降至不高于2CFU/g、 內(nèi)毒素量降至不高于20EU/g、指示病毒量降至100PFU/g，bFGF在這一步驟中損失不超過(guò) 10%〇
[0040]分離豬小腸粘膜下層：豬空腸使用通用機(jī)豬腸衣機(jī)（3-U-400Stridhs型，瑞典AB Stridhs Maskiner公司）制備。PBS和去離子水交替灌注沖洗。
[0041 ] 脫脂處理：依次管腔內(nèi)外反向灌注50 %、70 %、90 %、100 %乙醇各15分鐘，循環(huán)灌 注，腔內(nèi)壓力高于腔外，腔內(nèi)灌注速度l〇〇ml/min/m，輔助170kHz的超聲振蕩。結(jié)束后去離子 水灌注15分鐘進(jìn)入下一步驟。
[0042]洗出細(xì)胞內(nèi)容物:管腔內(nèi)外反向灌注DNA增溶性緩沖鹽溶液30分鐘，非循環(huán)灌注， 腔內(nèi)壓力高于腔外，腔內(nèi)灌注速度l〇〇ml/min/m，腔內(nèi)外滲透壓差4倍。結(jié)束后去離子水灌注 15分鐘進(jìn)入下一步驟。
[0043]抗原封閉：管腔內(nèi)外反向灌注0.005%的十二烷基硫酸鈉溶液30分鐘，非循環(huán)灌 注，腔內(nèi)壓力高于腔外，腔內(nèi)灌注速度l〇〇ml/min/m。結(jié)束后去離子水、IXPBS液交替灌注2 輪，每次各灌注15分鐘，進(jìn)入下一步驟。
[0044]消毒和保存：自0.05 %PAA/5 %ET0H灌注后，所有灌注的液體，包括去離子水，均為 已滅菌液體。最終獲得豬空腸 SIS基質(zhì)真空冷凍干燥后，γ射線(xiàn)輻射滅菌，保存。
[0045] 實(shí)施例2
[0046] 灌注法脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料的檢測(cè)：
[0047]脫細(xì)胞徹底性測(cè)定：組織學(xué)染色未見(jiàn)細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，DAPI染色陰性，使用Picogreen 法測(cè)定豬空腸 SIS基質(zhì)干重中殘留DNA的含量低于500ng/mg。殘留DNA鏈的長(zhǎng)度小于300bp。
[0048] 生物安全性測(cè)定：內(nèi)毒素含量0.25EU/g，生物負(fù)載、真菌、病毒檢測(cè)均為0，未檢測(cè) 至IjSDS殘留，IgA含量0 · lyg/g，脂質(zhì)含量0 · 5%。
[0049] 使用灌注-壓差法，制備豬SIS來(lái)源的脫細(xì)胞基質(zhì)，獲得的產(chǎn)品生物活性均符合如 下標(biāo)準(zhǔn)：
[0051 ] 實(shí)施例3
[0052]灌注-壓差法與機(jī)械法和攪拌法脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料的比較
[0053]灌注-壓差法、機(jī)械法和振蕩法使用的試劑均僅為O. I %PAA/4%ET0H溶液。
[0054] 灌注-壓差法:取30cm豬小腸粘膜下層，接入灌注反應(yīng)器中，以0.1%PAA/4%ET0H 溶液與腔內(nèi)外灌注2小時(shí)，腔內(nèi)外壓力差為40KPa，非循環(huán)灌注，灌注速度為每15分鐘整個(gè)系 統(tǒng)更新一次。
[0055] 機(jī)械法:取30cm豬小腸粘膜下層，浸沒(méi)于適量0.1%PAA/4%ET0H溶液，以170kHz的 超聲振蕩，每超聲15分鐘間歇15分鐘，并更換溶液，共持續(xù)2小時(shí)。
[0056] 攪拌法：取30cm豬小腸粘膜下層，浸沒(méi)于適量0.1 %PAA/4%ET0H溶液，以IOOrpm/ min的轉(zhuǎn)速攪拌2小時(shí)，期間每30分鐘更換一次液體。
[0057]測(cè)定三種方法獲得的脫細(xì)胞基質(zhì)中殘留DNA含量(脫細(xì)胞徹底性KPicogreen法）， 生長(zhǎng)因子殘留(ELISA法），力學(xué)性能。
[0058]比較結(jié)果：由圖3和圖4可知，灌注法在細(xì)胞脫除較為徹底的基礎(chǔ)上，保留大量生長(zhǎng) 因子，且力學(xué)特性較優(yōu)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種采用灌注-壓差法制備脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料的方法，包括： (1) 將原材料分離出粘膜下層或全層后接入灌注反應(yīng)器，灌注消毒液同時(shí)超聲振蕩進(jìn) 行預(yù)滅菌； (2) 依次向分離出的空腔內(nèi)灌注細(xì)胞內(nèi)容物清洗液和抗原封閉/清除液，利用滲透壓差 和/或液體壓差洗去細(xì)胞內(nèi)容物、清除抗原；最終消毒滅菌、保存，即得脫細(xì)胞基質(zhì)生物材 料。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用灌注-壓差法制備脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料的方法，其特 征在于:所述步驟(1)中的原材料為哺乳動(dòng)物的空腔臟器。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用灌注-壓差法制備脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料的方法，其特 征在于:所述步驟(1)中的消毒液為醇與過(guò)氧化物、氧化性消毒劑或非氧化性消毒劑中的一 種或幾種;預(yù)滅菌的時(shí)間為1~5小時(shí)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用灌注-壓差法制備脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料的方法，其特 征在于:所述步驟(2)中的細(xì)胞內(nèi)容物清洗液為含鹽緩沖液、堿性溶液、DNA增溶性緩沖鹽溶 液中的一種或幾種;洗去細(xì)胞內(nèi)容物的時(shí)間為〇. 1 -16小時(shí)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用灌注-壓差法制備脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料的方法，其特 征在于:所述步驟(2)中的抗原封閉/清除液為離子型表面活性劑溶液、非離子型表面活性 劑溶液、酶類(lèi)溶液中的一種或多種;清除抗原的時(shí)間為0.1-16小時(shí)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用灌注-壓差法制備脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料的方法，其特 征在于:所述步驟(2)中的洗去細(xì)胞內(nèi)容物、清除抗原之前還包括灌注脫脂溶劑進(jìn)行脫脂處 理。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種采用灌注-壓差法制備脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料的方法，其特 征在于:所述脫脂溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇、丙酮、氯仿中的一種或幾種。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用灌注-壓差法制備脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料的方法，其特 征在于:所述步驟(2)中的消毒滅菌的方法為全反應(yīng)器系統(tǒng)預(yù)滅菌、全程滅菌液體灌注、灌 注消毒液、環(huán)氧乙烷滅菌、超臨界C0 2滅菌、等離子體處理、γ射線(xiàn)輻射滅菌中的一種或多 種。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用灌注-壓差法制備脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料的方法，其特 征在于:所述步驟(2)中的保存為冷凍干燥保存或保存液保存。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種采用灌注-壓差法制備脫細(xì)胞基質(zhì)生物材料的方法，其 特征在于:所述預(yù)滅菌、洗去細(xì)胞內(nèi)容物、清除抗原、消毒滅菌后均進(jìn)行灌注清洗，清洗方法 為反復(fù)交替灌注去離子水、磷酸緩沖鹽或生理鹽水，輔助超聲振蕩。
【文檔編號(hào)】A61L27/36GK106075583SQ201610531693
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月7日
【發(fā)明人】張劍
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué), 上海卓阮醫(yī)療科技有限公司