益生菌發(fā)酵生附子的組合物及其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種益生菌發(fā)酵生附子的組合物及其制備方法，將生附子粉碎，加水浸泡，調(diào)pH，酶解，滅菌，接種預培養(yǎng)好的菌種，發(fā)酵即得。本發(fā)明還公開了益生菌發(fā)酵附子的組合物在制備發(fā)酵型附子中藥配方顆粒中的應用以及在提取分離發(fā)酵附子中的多糖成分和生物堿成分中的應用。本發(fā)明制備的發(fā)酵型附子中藥配方顆粒，能顯著降低有毒成分雙酯型生物堿含量,提高藥效成分單酯型生物堿含量，最大限度地促進藥效成分的提取,提高藥物利用率，成分穩(wěn)定，使用方便。實驗結果顯示：發(fā)酵型附子中藥配方顆粒中高毒性雙酯型生物堿含量很低，幾乎檢測不到，而低毒性單酯型生物堿含量明顯提高。急性毒性試驗顯示：發(fā)酵型附子中藥配方顆粒沒有表現(xiàn)出毒性。
【專利說明】
益生菌發(fā)酵生附子的組合物及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及中藥發(fā)酵組合物及中藥加工技術，特別是設及中藥附子經(jīng)微生物發(fā)酵 達到減毒存效目的，制備有效提取物，特別是制備發(fā)酵型附子中藥配方顆粒，屬于醫(yī)藥技術 領域。
【背景技術】
[0002] 中藥附子來源于毛良科植物烏頭(Aconitum carmichaeli Debx.)，其側根(子根） 叫附子，味辛、甘，性大熱，有毒，被譽為"亂世之良將，回陽救逆之第一品，補命口真火第一 要藥"，有回陽、逐冷、桂風濕的作用。治大汗亡陽、四肢厥逆、腎陽衰弱的腰膝冷痛、形寒愛 冷、精神不振W及風寒濕痛、腳氣等癥。后世多因其有"毒"而畏之。有人說"附子最有用，亦 最難用"。附子為臨床回陽救逆的要藥，近年來在治療危急重癥方面有著廣闊的前景，具有 鎮(zhèn)痛、消炎、強屯、和抗癌等藥理作用。
[0003] 附子主要成分為生物堿，包括雙醋型生物堿(烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿等）、單 醋型生物堿(苯甲酯烏頭原堿、苯甲酯次烏頭原堿、苯甲酯新烏頭原堿等）、氨醇型生物堿 (烏頭原堿、次烏頭原堿、新烏頭原堿等)和其他類生物堿(如新江油烏頭堿、消旋去甲烏藥 堿等），運幾種生物堿的毒性差異極大，其中雙醋型生物堿毒性很大，烏頭堿、新烏頭堿、次 烏頭堿的小鼠 LD50分別為1.8 mg/kg、1.9 mg/kg和5.8 mg/kg。烏頭堿等雙醋類生物堿水 解可生成毒性小的單醋類生物堿(苯甲酯烏頭原堿、苯甲酯新烏頭原堿及苯甲酯次烏頭原 堿），其毒性僅為雙醋型生物堿的1/1000。單醋型生物堿如果進一步水解則變?yōu)槎拘愿』?無毒的醇胺類生物堿(烏頭原堿、新烏頭原堿、次烏頭原堿），其毒性僅為烏頭堿的1/2000左 右。因此，附子的毒性指標應W雙醋型生物堿含量為指標。如炮制不當或劑量過大W及煎煮 時間不夠，均可引起中毒反應。烏頭堿的毒性主要作用于神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、屯、血管系統(tǒng) 和呼吸系統(tǒng)。對于神經(jīng)系統(tǒng)，烏頭堿能夠對各種神經(jīng)末梢和中樞系統(tǒng)產(chǎn)生一個先興奮后抑 制的過程，并對屯、肌直接產(chǎn)生作用，進而造成呼吸中樞麻搏，中樞性血壓下降，甚至引起窒 息而死亡。對于屯、血管系統(tǒng)，烏頭堿對屯、臟的損害最嚴重，臨床表現(xiàn)為屯、惇、胸悶、血壓下 降、屯、率失常、屯、率減慢或過速，嚴重者甚至發(fā)生屯、跳驟停、急性屯、源性腦缺血綜合癥等。對 于消化系統(tǒng)，烏頭堿對胃腸迷走神經(jīng)的興奮作用可引起流誕、吞咽困難、惡屯、、頻繁嘔吐、胃 部灼熱、腹痛、腹瀉、腸鳴音亢進，嚴重者可導致嘔吐咖啡色樣液及解鮮血樣糞便，里急后 重，酷似頻疾等表現(xiàn)。對于呼吸系統(tǒng)，烏頭堿的毒性可導致呼吸困難、呼吸麻搏甚至休克死 亡。
[0004] 由于生附子毒性大，臨床應用附子，古今都很重視附子的加工炮制。
[0005] 為使附子達減毒存效的目的，漢代至今已有70余種附子的加工炮制方法，比如， 炒炭法、蜜炙法、火炮法、紙裹腰法、姜制法、鹽制法、甘草湯炒法等。2015年版《中國藥典》 附子仍然采用膽己炮制方法，將生附子用食用膽己水浸泡、煮透、水漂、切片、再水漂、染 色、蒸制、干燥。經(jīng)過多次反復的水浸泡、漂洗等處理，炮制工藝繁瑣，方法復雜，可控性差， 有效成分損失嚴重。唐小龍等研究報道:附子炮制過程中生物堿的減少主要在于膽己水泡 (損失31.6 % )、漂片（損失33.6 % )、水解(損失16.9 % )，生物堿總量減少了81.3%，又因為 浸泡時間、溫度、漂洗程度等不同，不同批次附子飲片成分含量相差可高達10倍。
[0006] 中藥附子傳統(tǒng)加工方法W減毒為目標的工藝流程存在附子有效活性成分大量流 失的弊端，改革傳統(tǒng)工藝，科學把握烏頭堿等雙醋生物堿的水解反應，避免流失浪費，有效 利用中藥資源，是大勢所趨。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種益生菌發(fā)酵生附子的組合物及其制備 方法，是將優(yōu)選的幾種菌種，加入經(jīng)預處理的附子中，利用微生物生長活動產(chǎn)生活性物質(zhì)， 實現(xiàn)對附子成分的結構性修飾，W達到提高藥效和降低毒性的目的。
[0008] 微生物菌群具有氧化、甲基化、徑基化、去醋化、還原化等多種生物轉化能力。通過 微生物生物轉化來炮制中藥，可W比一般的物理或化學的炮制手段更大地增強或調(diào)整藥 性，從而提高中藥療效，降低毒副作用，擴大中藥適應癥。
[0009] 細菌W生長繁殖速度快、針對性強、有較強的綜合轉化能力，特別是利用人體腸道 中的有益菌群對中藥進行轉化。
[0010] 本發(fā)明所述的益生菌發(fā)酵生附子的組合物，是將生附子粉碎、浸泡、酶解后，由益 生菌發(fā)酵制得，具體步驟如下： 1、 粉碎:取干燥的生附子粉碎（10-100目）； 2、 浸泡:加入藥材量的5-20倍水浸泡0.5-2.0小時，得到生附子水浸混懸液； 3、 調(diào)pH:將步驟2得到的生附子水浸混懸液，用氨氧化鋼或氨氧化巧調(diào)P冊.0-7.5; 4、 酶解:將步驟3得到的已調(diào)pH值的生附子水浸混懸液，加熱至70-95°C，按生附子的干 重加入重量百分比0.1-1.0%的耐高溫α-淀粉酶，并保持20-60分鐘，取樣檢測，使艦試液不 再變藍，得到酶解的附子混合液； 5、 滅菌:將步驟4得到的已酶解的附子混合液，105-12rC高溫高壓滅菌20-120min; 6、 接種:將步驟5得到的滅菌附子混合液，溫度降至30-37°C，接種兩種或兩種W上預培 養(yǎng)好的菌種； 7、 發(fā)酵:將步驟6得到的已接種的附子混合液，在25-37Γ環(huán)境下，按常規(guī)發(fā)酵條件培養(yǎng) 2-7天，結束發(fā)酵，即得到益生菌發(fā)酵附子的組合物。
[0011] 所述的菌種選自芽抱桿菌、乳桿菌、雙歧桿菌、酵母菌，接種量分別為體積百分比 0.5〇/〇-2.0〇/〇。
[0012] 所述的芽抱桿菌選自枯草芽抱桿菌、地衣芽抱桿菌;所述的乳桿菌選自嗜酸乳桿 菌、德氏乳桿菌、植物乳桿菌、唾液乳桿菌、副干酪乳桿菌、干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌;所 述的雙歧桿菌選自兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、長雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、青春雙歧桿菌 和嬰兒雙歧桿菌;所述的酵母菌選自馬克斯克魯酵母、釀酒酵母。
[0013] 菌種來源于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、（CCTCC)(中國，武漢）或中國普通微生物菌 種保藏管理中屯、（CGMCC)(中國，北京）或者中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中屯、（CICC)(中 國，北京）。
[0014] 本發(fā)明的另一個目的在于提供本發(fā)明益生菌發(fā)酵附子在醫(yī)藥領域中的應用，根據(jù) 用途不同，設及制備發(fā)酵型附子中藥配方顆粒;提取分離發(fā)酵附子中的多糖成分和/或提取 分離發(fā)酵附子中的生物堿成分。
[0015] 所述的制備發(fā)酵型附子中藥配方顆粒，是將已經(jīng)發(fā)酵好的益生菌發(fā)酵附子的組合 物進行提取、濃縮、干燥、檢測、分裝，即得發(fā)酵型附子中藥配方顆粒。
[0016] 具體包括W下步驟： a、 提取、濃縮:將得到的益生菌發(fā)酵附子的組合物，離屯、或過濾，分離發(fā)酵液，中藥殘渣 再加水巧-20倍），加熱提取1-2遍，合并發(fā)酵液與提取液，減壓濃縮至固形物含量10%W上； b、 干燥:將步驟a得到的濃縮液，噴霧干燥； C、檢測、分裝:將步驟b得到的干燥粉末，檢測成分，并按要求規(guī)格分裝。
[0017] 所述的提取分離發(fā)酵附子中的多糖成分和/或提取分離發(fā)酵附子中的生物堿成 分，是將已經(jīng)發(fā)酵好的益生菌發(fā)酵生附子的組合物進行提取、分離、純化。
[001引具體包括W下步驟： 1) 提取:將得到的益生菌發(fā)酵生附子的組合物離屯、或過濾，分離發(fā)酵液，中藥殘渣再加 水巧-20倍），加熱提取1-2遍，合并發(fā)酵液與提取液，減壓濃縮至相對密度1.08-1.18; 2) 分離發(fā)酵附子中多糖成分:取步驟1)得到的濃縮液加乙醇使含醇量為75-90%，放置 24小時后，分離上清液與沉淀，取沉淀加水溶解，濾過，濾液再加乙醇使含醇量為80-90%， 放置24小時，再次分離上清液與沉淀，取沉淀用丙酬洗涂3次，揮干溶劑，50°C減壓干燥得發(fā) 酵附子多糖。
[0019] 3)分離發(fā)酵附子中總生物堿成分:取步驟1)得到的濃縮液加乙醇使含醇量為80- 90%，放置24小時后，分離上清液與沉淀，收集乙醇上清液，減壓回收乙醇，并濃縮至相對密 度1.01-1.03,用D101大孔吸附樹脂吸附，W5倍體積蒸饋水除雜，再用體積分數(shù)為15%的乙 醇溶液1.5~2 BV· h-1流速洗脫5倍體積，濃縮洗脫液，真空干燥，得發(fā)酵附子總生物堿。
[0020] 有益效果:本發(fā)明是將中藥與現(xiàn)代生物技術、生物工程技術和酶工程技術相結合 的一種新的中藥炮制方法，是將中藥炮制與制備中藥配方顆粒有機結合在一起。本發(fā)明制 備的發(fā)酵型附子中藥配方顆粒，能顯著降低有毒成分雙醋型生物堿的含量，提高藥效成分 單醋型生物堿的含量，同時，能最大限度地促進藥效成分的提取，提高藥物利用率，成分穩(wěn) 定，使用方便。為檢測本發(fā)明制備的發(fā)酵型附子中藥配方顆粒減毒存效，分別進行了成分比 較實驗和急性毒性比較試驗。成分比較實驗結果顯示:本發(fā)明的發(fā)酵型附子中藥配方顆粒 中高毒性雙醋型生物堿含量很低，幾乎檢測不到，而低毒性單醋型生物堿含量明顯提高。急 性毒性試驗結果顯示:發(fā)酵型附子中藥配方顆粒沒有表現(xiàn)出毒性。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明的發(fā)酵型附子中藥顆粒與生附子和附子飲片（黑順片)成分比較的薄 層色譜圖。
[0022] 圖中：S、自上而下分別為次烏頭堿、烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酯次烏頭原堿、苯甲 酷烏頭原堿、苯甲酯新烏頭原堿；1、發(fā)酵型附子中藥配方顆粒A供試品；2、發(fā)酵型附子中藥 配方顆粒B供試品；3、發(fā)酵型附子中藥配方顆粒C供試品;0、生附子;A、附子飲片(黑順片）。
【具體實施方式】
[0023] W下通過【具體實施方式】的描述對本發(fā)明作進一步說明，但運并非是對本發(fā)明的限 審IJ，本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可W做出各種修改或改進，但是只要不脫離本 發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0024] 實施例1:發(fā)酵型附子中藥配方顆粒A的制備 取中藥生附子粗粉(20目）10kg，加水10化浸泡1.0小時，用氨氧化鋼調(diào)整抑為7.0,加 熱至90°C，加入耐高溫α-淀粉酶50g，并保持30分鐘，取樣檢測，艦試液不再變藍。于115°C下 滅菌50分鐘，溫度降至37°C時，同時接種預培養(yǎng)的體積百分比1.0%的短雙歧桿菌（CGMCC 1.2213) 的菌液和體積百分比各0.5%的嗜酸乳桿菌（CGMCC 1.1854)、植物乳桿菌（CGMCC 1.19) W及體積百分比1.0%的啤酒酵母（CGMCC 2.1416)，37°C發(fā)酵24小時，然后溫度降至 3(TC培養(yǎng)48小時，取樣檢測，雙醋型生物堿斑點消失，結束發(fā)酵，得益生菌發(fā)酵生附子的組 合物。離屯、分離發(fā)酵液，中藥殘渣再加水15化，加熱煮沸提取0.5小時，離屯、，合并發(fā)酵液與 提取液，減壓濃縮至固形物含量1 〇%W上，噴霧干燥，得干燥顆粒3.62kg，檢測，分裝，即得。
[0025] 實施例2:發(fā)酵型附子中藥配方顆粒B的制備 取中藥生附子粉(60目）10kg，加水50L浸泡2.0小時，用氨氧化巧調(diào)整pH為7.0,加熱至 70°C，加入耐高溫α-淀粉酶lOOg，并保持20分鐘，取樣檢測，艦試液不再變藍。于12rC下滅 菌40分鐘，溫度降至30°C時，同時接種預培養(yǎng)的體積百分比2.0%的枯草芽抱桿菌（CGMCC 1.2213) 的菌液和體積百分比2.0%的馬克斯克魯酵母(CGMCC 2.3959)，30°C培養(yǎng)7天，取樣 檢測，雙醋型生物堿斑點消失，結束發(fā)酵，得益生菌發(fā)酵生附子的組合物。發(fā)酵物加水1〇化， 加熱煮沸提取0.5小時，離屯、，中藥殘渣再加水100L，加熱提取0.5小時，合并提取液，減壓濃 縮至固形物含量1 〇%W上，噴霧干燥，得干燥顆粒3.06kg，檢測，分裝，即得。
[00%]實施例3:發(fā)酵型附子中藥配方顆粒C的制備 取中藥生附子粉(100目）10kg，加水20化浸泡2.0小時，用氨氧化鋼調(diào)整pH為7.0，加熱 至80°C，加入耐高溫α-淀粉酶lOg，并保持60分鐘，取樣檢測，艦試液不再變藍。于11(TC下滅 菌90分鐘，溫度降至37°C時，同時接種預培養(yǎng)的體積百分比1.0%的兩歧雙歧桿菌（CGMCC 1.5090)的菌液和體積百分比各0.5%的干酪乳桿菌（CGMCC 1.2901 )、德氏乳桿菌乳亞種 (CGMCC 1.2625)，37°C發(fā)酵48小時，取樣檢測，雙醋型生物堿斑點消失，結束發(fā)酵，得益生菌 發(fā)酵生附子的組合物。離屯、分離發(fā)酵液，中藥殘渣再加水50L，加熱煮沸提取0.5小時，離屯、， 合并發(fā)酵液與提取液，減壓濃縮至固形物含量10%W上，噴霧干燥，得干燥顆粒3.38kg，檢 巧。，分裝，即得。
[0027]實施例4:提取分離發(fā)酵附子中的多糖成分和生物堿成分 取中藥生附子粗粉(80目）lkg，加水10L浸泡1.0小時，用氨氧化鋼調(diào)整pH為7.0,加熱 至90°C，加入耐高溫α-淀粉酶5g，并保持30分鐘，取樣檢測，艦試液不再變藍。于115°C下滅 菌50分鐘，溫度降至37°C時，同時接種預培養(yǎng)的體積百分比1.0%的短雙歧桿菌（CGMCC 1.2213) 的菌液和體積百分比各0.5%的嗜酸乳桿菌（CGMCC 1.1854)、植物乳桿菌（CGMCC 1.19) ，37°C發(fā)酵24小時，然后溫度降至30°C培養(yǎng)24小時，結束發(fā)酵，得益生菌發(fā)酵生附子的 組合物。離屯、分離發(fā)酵液，中藥殘渣再加水15L，加熱煮沸提取0.5小時，離屯、，合并發(fā)酵液與 提取液，減壓濃縮至相對密度1.10; 緩緩加入乙醇使含乙醇量為85%，放置24小時后，分離上清液與沉淀，收集上清液備 用;取沉淀加水500ml溶解，濾過，濾液加乙醇使含醇量為85%，放置24小時，再次分離上清 液與沉淀，收集上清液備用;取沉淀用丙酬洗涂3次，每次150ml，揮干溶劑，50°C減壓干燥， 得發(fā)酵附子多糖62.6g。
[00%]另合并收集的85%乙醇上清液，減壓回收乙醇，并濃縮至相對密度1.02,用D101大 孔吸附樹脂吸附，W5倍體積（BV)蒸饋水除雜，再用體積分數(shù)為15%的乙醇溶液1.5~2 BV · h-1流速洗脫5BV，濃縮洗脫液，真空干燥，得發(fā)酵附子總生物堿10.8g。
[0029] 實驗例1:發(fā)酵型附子中藥顆粒與生附子、附子飲片(黑順片)成分比較 取生附子粉末5g加氨試液5ml潤濕，加二氯甲燒50ml超聲30min，過濾，濾液揮干，殘渣 加無水乙醇1.0ml溶解，作為生附子對照樣品；另取黑順片粉末5g同法制備，作為附子飲片 (黑順片）對照樣品；再取發(fā)酵型附子中藥配方顆粒A、B、C適量（相當于附子5g)，加氨試液 2.0ml潤濕，加二氯甲燒50ml超聲30min，過濾，濾液揮干，殘渣加無水乙醇1.0ml溶解，作為 供試品1、2、3;再取烏頭堿3mg、次烏頭堿3mg、新烏頭堿各1.8mg、苯甲酯烏頭原堿3.2mg、苯 甲酯新烏頭原堿2.6mg、苯甲酯新烏頭原堿1.9mg分別加無水乙醇2ml溶解。薄層層析：照薄 層色譜法（中國藥典2015版通則0502)試驗，吸取對照品溶液、供試品溶液1、2、3、生附子對 照樣品溶液各加1，分別點于同一硅膠G薄層板上，W正己燒-乙酸乙醋-甲醇(6.4:3.6:1)為 展開劑，置氨蒸氣飽和20min的展開缸內(nèi)，展開，取出，驚干，噴W稀艦化祕鐘試液。
[0030] 結果分析:發(fā)酵型附子中藥配方顆粒在與雙醋型生物堿(次烏頭堿、烏頭堿、新烏 頭堿)對照品相對應的位置上幾乎看不到相應的斑點，而在與單醋型生物堿(苯甲酯次烏頭 堿、苯甲酯新烏頭堿)對照品相對應的位置上，相應斑點明顯，說明發(fā)酵型附子中藥配方顆 粒中雙醋型生物堿含量已經(jīng)很少，幾乎檢測不到，而單醋型生物堿明顯增加;生附子對照樣 品雙醋型生物堿斑點非常明顯，說明生附子雙醋型生物堿含量較高；黑順片中雙醋型生物 堿斑點比生附子弱，但仍能檢測到，說明黑順片中仍存在一定量的雙醋型生物堿。見附圖1。
[0031] 用薄層法對發(fā)酵型附子中藥配方顆粒與生附子和黑順片進行成分比較，很直觀的 反映了生附子中雙醋型生物堿含量高，單醋型生物堿含量低，黑順片雙醋型生物堿含量降 低，單醋型生物堿增加不明顯，說明黑順片在炮制過程中成分損失嚴重;而發(fā)酵型附子中藥 配方顆粒雙醋型生物堿含量很低，單醋型生物堿含量明顯增高，說明在制備過程中將劇毒 性雙醋型生物堿C位上的乙酷基水解，失去一分子醋酸，得到相應的苯甲酯單醋型生物堿， 從而降低毒性。另外烏頭類生物堿C位上的乙酷基在比較緩和的條件下被脂肪酷基置換，生 成毒性較小的單醋類生物堿。所W發(fā)酵型附子中藥顆粒降低了附子的毒性，保存了單醋型 生物堿的藥理功效，從而達到減毒存效的目的，使臨床用藥更為安全、方便。
[0032] 實驗例2:發(fā)酵型附子中藥顆粒與生附子急性毒性實驗 取小鼠48只，雌雄各半，根據(jù)性別和體重隨機分為6組:正常組、生附子組(附子1.0 g/ ml)、黑順片組(制附子1.0 g/ml)、發(fā)酵附子顆粒A組(相當于附子1.0 g/ml)、發(fā)酵附子顆粒 B組(相當于附子1.0 g/ml)、發(fā)酵附子顆粒C組(相當于附子1.0 g/ml)。
[0033] 小鼠撤食不撤水12 h后按40 mL/kg體積灌胃給藥，每天2次，連續(xù)給予3天。藥后連 續(xù)觀察7 d:藥后30min內(nèi)，連續(xù)觀察;藥后30min-化，每15 min觀察一次;藥后2 h-4 h，每 30 min觀察一次;藥后4 h-8 h，每1 h觀察一次;藥后8 h-24 h，每4 h觀察一次;藥后d2 起，每天觀察一次，記錄小鼠的毛色、精神、動度、進食、飲水等一般情況、中毒癥狀及死亡情 況。死亡小鼠即刻解剖，觀熟。、肝、脾、肺、腎等重要臟器的大體病理變化。
[OOW 結果 小鼠藥后7天內(nèi)毛色、二便等正常，生附子組死亡3只，黑順片組死亡0只、發(fā)酵附子組死 亡ο只。小鼠給予生附子和黑順片后，小鼠體重增長緩慢，與正常組比較，生附子組呈非常顯 著性差異，黑順片組呈顯著性差異，而各發(fā)酵組均無顯著性差異。并且灌胃生附子、黑順片 水煎液后表現(xiàn)有不同程度的惡屯、、俯邸不動等癥狀毒性反應，而小鼠灌胃發(fā)酵型附子中藥 顆粒未出現(xiàn)相應毒性癥狀，對小鼠尸檢未見異常。
[0035] 1.對小鼠體重的影響 小鼠體重變化見表1。
[0036] 由表1結果可見，給予生附子和黑順片后，小鼠體重增長緩慢，明顯低于正常組，與 正常組比較，生附子組呈非常顯著性差異，黑順片組呈顯著性差異，而各發(fā)酵組均無顯著性 差異。
[0037] 2.對小鼠死亡情況的影響 連續(xù)多次給予附子后，小鼠的死亡情況如表2所示。生附子組中在2~4天給藥后引起3 只小鼠死亡，其他各組無小鼠死亡。
[0038] 3.小鼠毒性癥狀觀察 附子不同樣品給小鼠灌胃毒性癥狀見表3。
[0039]由表3結果可見：小鼠灌胃生附子、黑順片水煎液后的毒性反應主要有惡屯、、俯邸 不動等癥狀;而小鼠灌胃發(fā)酵型附子中藥顆粒未出現(xiàn)相應毒性癥狀，對小鼠尸檢未見異常。
【主權項】
1. 一種益生菌發(fā)酵生附子的組合物，其特征在于，將生附子粉碎、浸泡、酶解后，由益生 菌發(fā)酵制得，具體步驟如下： 1) 粉碎:取干燥的生附子粉碎（10-100目）； 2) 浸泡:加入藥材量的5-20倍水浸泡0.5-2.0小時，得到生附子水浸混懸液； 3) 調(diào)pH:將步驟2得到的生附子水浸混懸液，用氫氧化鈉或氫氧化鈣調(diào)pH6.0-7.5; 4) 酶解:將步驟3得到的已調(diào)pH值的生附子水浸混懸液，加熱至70-95Γ，按生附子的干 重加入重量百分比0.1-1.0%的耐高溫α-淀粉酶，并保持20-60分鐘，取樣檢測，使碘試液不 再變藍，得到酶解的附子混合液； 5) 滅菌:將步驟4得到的已酶解的附子混合液，105-121°C高溫高壓滅菌20-120min; 6) 接種:將步驟5得到的滅菌附子混合液，溫度降至30-37Γ，接種兩種或兩種以上預培 養(yǎng)好的菌種； 7) 發(fā)酵:將步驟6得到的已接種的附子混合液，在25-37Γ環(huán)境下，按常規(guī)發(fā)酵條件培養(yǎng) 2-7天，結束發(fā)酵，即得到益生菌發(fā)酵生附子的組合物； 步驟6)所述的菌種選自芽孢桿菌、乳桿菌、雙歧桿菌或酵母菌，接種量分別為體積百分 比0·5%-2·0%〇2. 根據(jù)權利要求1所述的益生菌發(fā)酵生附子的組合物，其特征在于，所述的芽孢桿菌選 自枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌;所述的乳桿菌選自嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌、植物乳桿菌、 唾液乳桿菌、副干酪乳桿菌、干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌;所述的雙歧桿菌選自兩歧雙歧桿 菌、短雙歧桿菌、長雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、青春雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌;所述的酵母菌 選自馬克斯克魯酵母、釀酒酵母。3. 權利要求1或2所述的益生菌發(fā)酵生附子的組合物的制備方法，其特征在于，步驟如 下： 1) 粉碎:取干燥的生附子粉碎至10-100目； 2) 浸泡:加入藥材量的5-20倍水浸泡0.5-2.0小時，得到生附子水浸混懸液； 3) 調(diào)pH:將步驟2得到的生附子水浸混懸液，用氫氧化鈉或氫氧化鈣調(diào)pH6.0-7.5; 4) 酶解:將步驟3得到的已調(diào)pH值的生附子水浸混懸液，加熱至70-95Γ，按生附子的干 重加入重量百分比0.1-1.0%的耐高溫α-淀粉酶，并保持20-60分鐘，取樣檢測，使碘試液不 再變藍，得到酶解的附子混合液； 5) 滅菌:將步驟4得到的已酶解的附子混合液，105-121°C高溫高壓滅菌20-120min; 6) 接種:將步驟5得到的滅菌附子混合液，溫度降至30-37Γ，接種兩種或兩種以上預培 養(yǎng)好的菌種； 7) 發(fā)酵:將步驟6得到的已接種的附子混合液，在25-37Γ環(huán)境下，按常規(guī)發(fā)酵條件培養(yǎng) 2-7天，結束發(fā)酵，即得到益生菌發(fā)酵生附子的組合物； 步驟6)所述的菌種選自芽孢桿菌、乳桿菌、雙歧桿菌或酵母菌，接種量分別為體積百分 比0·5%-2·0%〇4. 根據(jù)權利要求3所述的益生菌發(fā)酵生附子的組合物的制備方法，其特征在于，所述的 芽孢桿菌選自枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌;所述的乳桿菌選自嗜酸乳桿菌、德氏乳桿菌、 植物乳桿菌、唾液乳桿菌、副干酪乳桿菌、干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌;所述的雙歧桿菌選 自兩歧雙歧桿菌、短雙歧桿菌、長雙歧桿菌、動物雙歧桿菌、青春雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌； 所述的酵母菌選自馬克斯克魯酵母、釀酒酵母。5. 權利要求1或2所述的益生菌發(fā)酵生附子的組合物在制備發(fā)酵型附子中藥配方顆粒 中的應用。6. 根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的制備發(fā)酵型附子中藥配方顆粒，是 將益生菌發(fā)酵生附子的組合物進行提取、濃縮、干燥、檢測、分裝，即得發(fā)酵型附子中藥配方 顆粒，具體步驟如下： a、 提取、濃縮:將益生菌發(fā)酵生附子的組合物離心或過濾，分離發(fā)酵液；中藥殘渣再加 5-20倍重量的水，加熱提取1-2遍，得提取液;合并發(fā)酵液與提取液，減壓濃縮至固形物含量 10%以上，得濃縮液； b、 干燥:將步驟a得到的濃縮液，噴霧干燥，得干燥粉末； c、 檢測、分裝:將步驟b得到的干燥粉末，檢測成分，按要求規(guī)格分裝。7. 權利要求1或2所述的益生菌發(fā)酵生附子的組合物在提取分離發(fā)酵附子中的多糖成 分和/或提取分離發(fā)酵附子中的生物堿成分中的應用。8. 根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的提取分離發(fā)酵附子中的多糖成分的 步驟如下： 1) 提取:將益生菌發(fā)酵生附子的組合物離心或過濾，分離發(fā)酵液，中藥殘渣再加5-20倍 水，加熱提取1-2遍，合并發(fā)酵液與提取液，減壓濃縮至相對密度1.08-1.18; 2) 分離發(fā)酵附子中多糖:取步驟1)得到的濃縮液加乙醇使含醇量為75-90%，放置24小 時后，分離上清液與沉淀，取沉淀加水溶解，濾過，濾液再加乙醇使含醇量為80-90 %，放置 24小時，再次分離上清液與沉淀，取沉淀用丙酮洗滌3次，揮干溶劑，50°C減壓干燥得發(fā)酵附 子多糖。9. 根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的提取分離發(fā)酵附子中的生物堿成分 的步驟如下： 1) 提取:將益生菌發(fā)酵生附子的組合物離心或過濾，分離發(fā)酵液，中藥殘渣再加5-20倍 水，加熱提取1-2遍，合并發(fā)酵液與提取液，減壓濃縮至相對密度1.08-1.18; 2) 分離發(fā)酵附子中總生物堿:取步驟1)得到的濃縮液加乙醇使含醇量為80-90%，放置 24小時后，分離上清液與沉淀，收集乙醇上清液，減壓回收乙醇，并濃縮至相對密度1.01-1.03,用D101大孔吸附樹脂吸附，以5倍體積蒸餾水除雜，再用體積分數(shù)為15%的乙醇溶液 1.5~2 BV· h-Ι流速洗脫5倍體積，濃縮洗脫液，真空干燥，得發(fā)酵附子總生物堿。
【文檔編號】A61K36/714GK105998222SQ201610314984
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】吳炳新, 褚新紅, 孫筱林
【申請人】三株福爾制藥有限公司