堿性氨基酸修飾氨基四苯基卟啉化合物的新用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種堿性氨基酸修飾氨基四苯基卟啉化合物的用途。所述的堿性氨基酸修飾氨基四苯基卟啉化合物具有下述結構：實驗證明：堿性氨基酸修飾氨基四苯基卟啉化合物在光動力治療大鼠潰瘍性結腸炎模型，顯示出良好的治療效果，具有水溶性好，生物利用度高，光反應效率高，不良反應少的特點，可用于潰瘍性結腸炎的臨床治療。同時，化合物本身制備工藝簡便、收率高，適宜于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】
堿性氨基酸修飾氨基四苯基卟啉化合物的新用途
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于藥物研究領域，具體涉及堿性氨基酸修飾氨基四苯基卟啉化合物的新 用途，特別是涉及堿性氨基酸修飾氨基四苯基卟啉化合物在制備潰瘍性結腸炎治療藥物中 的應用。
【背景技術】
[0002] 潰瘍性結腸炎(Ulcerative Colitis，UC)是一種常見的病因未明的慢性非特異性 腸道疾病，其發(fā)病與遺傳、環(huán)境、腸道感染、自身免疫等多種因素相關，臨床表現(xiàn)為持續(xù)或反 復發(fā)作的腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重等，部分患者出現(xiàn)眼、皮膚、黏膜、關節(jié)損傷或肝 膽類疾病等腸外表現(xiàn) [1]。潰瘍性結腸炎病變范圍廣泛，致病機理復雜，常反復發(fā)作、迀延不 愈，極易導致癌變，已被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治性疾病之一 [2]。潰瘍性結腸炎在歐洲和 北美較為普遍，發(fā)病率分別為0.243%。和0.192%。，僅美國就有高達100萬患者，每年的治療 費用約為人民幣120億元。近年來，隨著生活習慣和飲食結構的西方化，潰瘍性結腸炎在亞 洲國家的發(fā)病率也呈逐年增高趨勢，目前已達〇. 〇63%。[3]。我國尚無普通人群的流行病學統(tǒng) 計資料，但粗略估計潰瘍性結腸炎患者已超過20萬人，發(fā)病人群以中青年為主，性別差異不 大（男：女約為1.0-1.3:1.0)，但發(fā)病率逐年增高，引起國內(nèi)外醫(yī)藥工作者和政府職能部門 的關注 [4]。尋找有效治療潰瘍性結腸炎的方法，使患者恢復身心健康，緩解疾病給患者家庭 和社會帶來的沉重經(jīng)濟負擔，成為臨床上亟待解決的關鍵科學問題。
[0003] 現(xiàn)階段潰瘍性結腸炎的臨床治療以抗炎和調(diào)節(jié)免疫反應為主，多采用藥物治療或 手術治療。其中，常規(guī)的治療藥物主要包括氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素類、免疫抑制劑、抗生 素和微生態(tài)制劑等，這些藥物只能暫時控制和緩解癥狀，無法從根本上治愈疾病，且存在毒 副作用大、維持效果差、容易復發(fā)等缺陷。手術治療主要針對發(fā)生大出血、腸道穿孔、癌變和 中毒性腸擴張的患者，目前常用的手術方式有全結腸直腸切除、回腸造口、結腸部分切除、 回腸直腸吻合和回腸貯袋肛管吻合等，它們普遍存在創(chuàng)傷大、并發(fā)癥多、術后恢復慢、易復 發(fā)等弊端 [5]。因此，開發(fā)一種治療效果好、不良反應少的替代治療方案成為潰瘍性結腸炎研 究的熱點。
[0004] 近年來，隨著醫(yī)藥生物技術的發(fā)展很多新療法應運而生，包括生物靶向治療、中醫(yī) 中藥、干細胞療法和光動力療法等。其中，光動力療法(Photodynamic Therapy，Η)Τ)是基于 光敏藥物對不同組織具有不同親和力的特點，利用特定波長的光激發(fā)光敏藥物，在生物組 織中分子氧的參與下，使之發(fā)生一定的光化學反應，產(chǎn)生非?；顫姷膯尉€態(tài)氧和自由基等 活性氧物質(zhì)，選擇性的殺傷病灶組織的一種治療方法 [6]。光動力療法具有起效快、靶向性 強、毒副作用低、可以重復治療等優(yōu)點，目前其臨床適應癥已由惡性腫瘤拓展到越來越多的 良性疾病，如:血管性病變(鮮紅斑痣、眼底黃斑變性）、感染性病變(痤瘡、銀肩病、尖銳濕 疣）、類風濕性關節(jié)炎、動脈粥樣硬化等 [7]。新世紀以來，隨著各種內(nèi)窺鏡和纖維光學技術的 飛速發(fā)展，利用光動力療法治療內(nèi)腔疾患逐漸成為可能，為潰瘍性結腸炎的臨床治療提供 了一種新的思路。
[0005] 國內(nèi)外對光動力療法治療潰瘍性結腸炎（或炎癥性腸?。┑膱蟮啦欢唷avre L 等[8]以5-氨基酮戊酸(5-ALA)為光敏劑治療小鼠克羅恩病，發(fā)現(xiàn)TOT可以通過下調(diào)IL-UIL-17等促炎細胞因子的表達和誘導T細胞凋亡來快速改善T細胞介導的結腸炎癥狀，且沒有明 顯的副作用。Reinhard A等[9]用光敏劑替莫泊芬治療小鼠炎癥性腸病，發(fā)現(xiàn)TOT可以有效地 減輕腸炎癥狀，阻止腸道發(fā)生癌變。上述研究從組織形態(tài)學、病理學和分子生物學角度，分 別證實了 5-氨基酮戊酸和替莫泊芬介導的光動力療法治療腸炎的有效性和安全性，但是也 存在一些不足之處，比如:5-氨基酮戊酸本身并無光敏活性，需要在酶的激活下生成原卟啉 IX，而形成的原卟啉IX存在濃度低、分布不均、光動力反應效率低等缺陷[1()];替莫泊芬在水 中的溶解度較差，容易引起神經(jīng)痛、中樞抑制等不良反應 [11]。因此，需要開發(fā)一種水溶性 好、生物利用度高、光反應效率高、不良反應少的潰瘍性結腸炎治療專屬光敏劑。
[0006] 本課題組設計合成了一系列具有良好理化性質(zhì)的堿性氨基酸修飾氨基四苯基卟 啉化合物，前期研究表明其中一個化合物（即5，10，15，20-四{4-[ (S)-2，6-二氨基己酰胺 基]苯基}撲啉)具有水溶性好、毒性低和靶向性強的特點，特別是其外傷感染治療中表現(xiàn)出 獨特的促進傷口愈合和免疫調(diào)節(jié)作用，以及對微生物和病原體顯示出良好的抑制和調(diào)節(jié)作 用?；谏鲜鼋Y果，我們設想將該光敏劑用于潰瘍性結腸炎的PDT治療，結果顯示該化合物 可以明顯抑制NF-kB p65通路的活化，下調(diào)炎性因子TNF-α的表達，提高結腸粘膜組織中GSH 的含量、降低MDA的含量，進而減輕炎癥反應，促進結腸粘膜愈合，改善潰瘍性結腸炎的臨床 癥狀。因此，有望開發(fā)出一種新型的高效低毒治療潰瘍性結腸炎的光敏劑。
[0007] 參考文獻
[0008] [I]Hindryckx PjBaert FjHart A,et al.Clinical trials in ulcerative colitis:a historical perspective[J].J Crohns Colitis,2015,9(7):580-588.
[0009] [2]Feuerstein J D,Cheifetz A S.Ulcerative colitis : epidemiology， diagnosis,and management[J].Mayo Clin Proc，2014,89(ll):1553-1563.
[0010] [3]Ye YjPang ZjChen ff,et al.The epidemiology and risk factors of inflammatory bowel disease[J]·Int J Clin Exp Med，2015,8(12):22529-22542.
[0011] [4]Chow D KjLeong R WjTsoi K K.Long-term follow-up of ulcerative colitis in the Chinese population[J].Am J Gastroenterol,2009,104(3):647-654.
[0012] [5]Bezzio CjFurfaro F,de Franchis R,et al.Ulcerative colitis:current pharmacotherapy and future directions[J].Expert Opin Pharmacother，2014,15(12): 1659-1670.
[0013] [6]Mallidi S,Spring B QjChang S，et al.Optical imaging,photodynamic therapy and optically triggered combination treatments[J].Cancer J,2015,21 (3):194-205.
[0014] [7]Qiang Y GjZhang X PjLi J，et al.Photodynamic therapy for malignant diseases: clinical investigation and application[J].Chin Med J,2006,119(10):845- 857.
[0015] [8]Favre LjBorle FjVelin D，et al.Low dose endoluminal photodynamic therapy improves murine T cell-mediated colitis[J].Endoscopy.201IJul；43(7): 604-16.
[0016] [9]Reinhard A,Bressenot A,Dassonneville R,et al.Photodynamic therapy relieves colitis and prevents colitis-associated carcinogenesis in mice[J] .Inflamm Bowel Dis,2015,21(5):985-995.
[0017] [IOjMaisch T1Moor AC,Regensburger J,et al. Intense pulse light and 5_ ALA PDT: phototoxic effects in vitro depend on the spectral overlap with protoporphyrine IX but do not match cut-off filter notations[J].Lasers Surg Med,2011,43(2):176-182.
[0018] [ 11 ] Senge M 0，Brandt J C · Temoporfin( Foscan1?.，.5，10，15，2〇-tetra(m_ hydroxyphenyl)chlorin)-a second-generation photosensitizer[J]·Photochem Photobiol,2011,87(6):1240-1296.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種堿性氨基酸修飾氨基四苯基卟 啉化合物作為潰瘍性結腸炎治療藥物的用途。
[0020] 本發(fā)明的目的主要通過以下技術方案實現(xiàn)：
[0021] -種堿性氨基酸修飾氨基四苯基卟啉化合物在制備治療潰瘍性結腸炎藥物的應 用，所述的堿性氨基酸修飾氨基四苯基卟啉化合物具有下述結構：
[0022]
[0023]所述的藥物為光動力治療藥物。
[0024]實驗證明：堿性氨基酸修飾氨基四苯基卟啉化合物在光動力治療大鼠潰瘍性結腸 炎模型，顯示出良好的治療效果，具有水溶性好，生物利用度高，光反應效率高，不良反應少 的特點，可用于潰瘍性結腸炎的臨床治療。同時，化合物本身制備工藝簡便、收率高，適宜于 大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0025]圖1為本發(fā)明實施例2各實驗組大鼠結腸粘膜的組織病理形態(tài)學圖片（HE染色X 200倍)。
[0026]圖2為本發(fā)明實施例2各實驗組大鼠結腸粘膜的NF-kBP65免疫組化染色圖片。
[0027]圖3為本發(fā)明實施例2各實驗組大鼠結腸粘膜的ΙκΒ-b免疫組化染色圖片。
【具體實施方式】
[0028]下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明，其目的僅在于更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容 而非限制本發(fā)明的保護范圍：
[0029] 實施例1 5，10，15,20-四{4-[(5)-2,6-二氨基己酰胺基]苯基}卟啉的制備 [0030]將13〇(：-1^8(13〇(3)-0!1(467.6711^，1.351]1111〇1)置于反應瓶中，％保護下加入干燥的 THF 20mL，磁子攪拌。冷卻至-17°C，加入三乙胺（197.6(^1^，1.42111111〇1)和氯甲酸乙酯 (131.10yL，l .38mmol)反應lh，生成白色沉淀，過濾，棄去沉淀。取四氨基卟啉（202.40mg， 0.30mmol)溶解于15mL THF中，將上述濾液加入，室溫攪拌反應HhJLCX二氯甲烷：甲醇:氨 水=60 :1:0.6)監(jiān)測反應進程。反應完全后，將反應液倒入冰水中，析出沉淀，過濾，水洗3 次，得到紫色固體。最后柱層析分離（洗脫劑：二氯甲烷：甲醇：氨水=30 :1:0.4)得產(chǎn)物 596.1311^，產(chǎn)率93%。
[0031] 將上述步驟得到的100 . OOmg樣品用IOmL干燥的CH2Cl2溶解，緩慢滴加三氟乙酸 IOmL，室溫反應30min。旋除溶劑，加入無水乙醚，生成淺綠色沉淀，過濾，30mL二氯甲燒和 30mL無水乙醚各洗滌3次。再用20mL蒸餾水將綠色沉淀溶解，氨水調(diào)節(jié)PH 7-8，析出紫色沉 淀，過濾，水洗2次，柱層析分離得到堿性氨基酸修飾氨基四苯基卟啉化合物51.96mg，產(chǎn)率 87%〇
[0032] 實施例2
[0033]本發(fā)明實施例1所得堿性氨基酸修飾氨基四苯基卟啉化合物治療大鼠潰瘍性結腸 炎的在體實驗過程，包括如下步驟：
[0034] (1)大鼠潰瘍性結腸炎模型的建立:將54只雄性SD大鼠置于實驗環(huán)境中飼養(yǎng)1周， 室溫20-25 °C。所有大鼠禁食不禁水24h后，10 %水合氯醛0.4ml/kg，腹腔注射麻醉，將一根 直徑為2mm長約12cm硅膠管（石錯油潤滑）由肛門輕緩插入8cm，將100mg/kg三硝基苯磺酸 (TNBS)溶于0.25ml 50%乙醇中，用注射器推入硅膠管中，注射后將大鼠尾巴提起，保持肛 門高位Imin，結束后使動物平躺，自然清醒，自由飲食。
[0035] (2)動物分組和給藥:實驗動物隨機分為9組，每組6只，即①正常組，②模型組，③ 照光組、④光敏劑組，⑤低劑量組，⑥中劑量組，⑦高劑量組，⑧聯(lián)合治療組，⑨陽性對照組 (柳氮磺胺吡啶）。正常組自由飲水、喂食;模型組用硅膠管推入〇.5ml生理鹽水，照光組用硅 膠管推入〇.5ml生理鹽水，30min后，采用Intense 650nm PDT系統(tǒng)對結腸部位進行激光照射 (柱狀光纖，由肛門插入4cm，使用時外加石蠟油潤滑的醫(yī)用套管），光照密度為40mW/cm 2,照 射時間為IOmin;光敏劑組用硅膠管推入0.5ml堿性氨基酸修飾氨基四苯基卟啉化合物水溶 液(40μΜ，120yg/kg);低劑量組用硅膠管推入0.5ml堿性氨基酸修飾氨基四苯基卟啉化合物 水溶液(20yM，60yg/kg)，30min后，采用Intense 650nm PDT系統(tǒng)對結腸部位進行激光照射， (柱狀光纖，由肛門插入4cm，使用時外加石蠟油潤滑的醫(yī)用套管），光照密度為40mW/cm 2,照 射時間為IOmin;中劑量組用硅膠管推入0.5ml堿性氨基酸修飾氨基四苯基卟啉化合物水溶 液(40μΜ，120yg/kg)，30min后，采用Intense 650nm PDT系統(tǒng)對結腸部位進行激光照射，（柱 狀光纖，由肛門插入4cm，使用時外加石蠟油潤滑的醫(yī)用套管），光照密度為40mW/cm 2,照射 時間為IOmin;高劑量組用硅膠管推入0.5ml堿性氨基酸修飾氨基四苯基卟啉化合物水溶液 (80yM，240yg/kg)，30min后，采用Intense 650nm PDT系統(tǒng)對結腸部位進行激光照射，（柱狀 光纖，由肛門插入4cm，使用時外加石蠟油潤滑的醫(yī)用套管），光照密度為40mW/cm2，照射時 間為IOmin;聯(lián)合治療組給予堿性氨基酸修飾氨基四苯基卟啉化合物中劑量組的治療方案， 同時按500mg/kg口服灌胃柳氮磺胺吡啶；陽性對照組，按500mg/kg 口服灌胃柳氮磺胺吡啶。 每隔1天，治療1次，共4次。末次治療后，禁食24h，處死大鼠。
[0036] (3)檢測指標:①一般情況:觀察大鼠的體重、大便、毛發(fā)、活動、進食和精神狀態(tài)， 以體重和大便綜合進行疾病活動度(DAI)評分，評分標準見表1。②結腸損傷評價:各組大鼠 腹腔注射10 %水合氯醛麻醉，開腹，腹主動脈無菌取血3ml，4000r/min低溫離心15min，分離 血清500μ1，置-20°C冰箱儲存?zhèn)溆茫焖倨嗜【喔亻T2-lOcm的結腸組織，用生理鹽水沖洗干 凈，將結腸粘膜平鋪于白紙上，觀察炎癥和潰瘍發(fā)生的情況情況。③組織病理形態(tài)學觀察： 取病變最明顯處結腸組織2cm，4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片和HE染色， 置顯微鏡下觀察結腸粘膜的改變，并作組織學評分。評分標準:上皮缺失:無缺失0分，缺失 0-5 % 1分，缺失5-10 % 2分，缺失>10 % 3分;腺體損傷:無損傷0分，損傷0-10 % 1分，損傷10-20 % 2分，損傷>20 % 3分;杯狀細胞破壞:無0分，輕度1分，中度2分，重度3分;炎細胞浸潤:無 0分，粘膜層1分，粘膜和粘膜下層2分，結腸全層3分;潰瘍深度:無0分，上皮1分，黏膜固有層 2分，黏膜肌層3分。④GSH、MDA和TNF-α水平測定:取病變最明顯處結腸組織2cm，精確稱重， 用冷生理鹽水按重量(mg)體積(mL)在冰浴狀態(tài)下制備10%的結腸組織勻漿液，4000r/min 低溫離心15min，取上清液和血清樣本，按照GSH、MDA和TNF-a試劑盒說明書操作。⑤NF-κΒ、I κΒ表達的檢測：免疫組化法檢測各實驗組結腸粘膜組織中NF-kB P65和ΙκΒ-b的表達，采用 Image-Pro Plus 5.0專業(yè)圖像分析軟件分析免疫組化結果，在200倍光鏡下對免疫組化染 色的陽性表達進行定量分析，計算陽性染色的平均積分吸光度(MIA) IIA =積分吸光度 (Ia)/測量區(qū)域面積。
[0037] (4)實驗結果:①疾病活動度和組織學評分:結果顯示，模型組的疾病活動度和組 織學評分均明顯高于正常組;照光組、光敏劑組與模型組相比沒有統(tǒng)計學差異;高、中、低劑 量組的評分均明顯下降，且有一定的劑量依賴性(見表2)。②組織病理形態(tài)學觀察：正常組 無明顯炎性細胞浸潤，腸粘膜完整;模型組可見腸粘膜完整性明顯破壞，腺體排列紊亂及炎 性細胞浸潤；照光組可見腸粘膜完整性明顯破壞，腺體排列紊亂及炎性細胞浸潤;光敏劑組 可見腸粘膜完整性明顯破壞，腺體排列紊亂及炎性細胞浸潤；低劑量組可見腸粘膜完整性 破壞，腺體排列紊亂及炎性細胞浸潤；中劑量組可見腸粘膜完整性破壞，腺體排列紊亂及炎 性細胞浸潤，較低劑量組有減輕;高劑量組可見腸粘膜完整性破壞，腺體排列紊亂及炎性細 胞浸潤，較中劑量組明顯減輕;聯(lián)合治療組少量炎性細胞浸潤，腸粘膜基本完整；陽性對照 組可見腸粘膜完整性破壞，腺體排列紊亂及炎性細胞浸潤（見圖1)。③GSH、MDA和TNF-α水 平:結果顯示，在血清和結腸組織中，模型組MDA、TNF-α均明顯高于正常組，模型組GSH活性 明顯低于正常組，有統(tǒng)計學差異；照光組和光敏劑組與模型組相比，上述指標均無統(tǒng)計學差 異；高、中、低劑量組的MDA、TNF-a均有下降，GSH均有上升，且存在一定的劑量依賴關系，但 僅高劑量組與模型組比較有統(tǒng)計學差異;近端激光照射處腸組織的上述指標變化更明顯， 遠端未照射處僅高劑量組的上述指標與模型組比較有統(tǒng)計學差異;聯(lián)合治療組MDA、TNF_a 下降幅度及GSH上升幅度最大，有統(tǒng)計學差異(見表2-4)。④免疫組化:正常組NF-kBP65不表 達或極少量表達，模型組、照光組和光敏劑組NF-kB P65大量表達，高中低劑量組和陽性對照 組NF-kBP65中等量表達，聯(lián)合治療組NF-kB P65少量表達。正常組ΙκΒ-b不表達或極少量表 達，模型組、照光組和光敏劑組ΙκΒ-b大量表達，高中低劑量組和陽性對照組ΙκΒ-b中等量表 達，聯(lián)合治療組ΙκΒ-b少量表達。結果表明，模型組的NF-kBP65和ΙκΒ-b的表達明顯高于對照 組，照光組和光敏劑組與模型組相比沒有統(tǒng)計學差異，高、中、低劑量組NF-kB P65和ΙκΒ-b的 表達均有下降，且有一定的劑量依賴性，近端激光照射處腸組織中上述指標下降更明顯，遠 端未照射處，僅高劑量組NF-kB P65和ΙκΒ-b的表達與模型組比較有統(tǒng)計學差異;無論近端還 是遠端腸組織中，以聯(lián)合治療組NF-kBP65和ΙκΒ-b的表達下降幅度最大，有統(tǒng)計學差異（見 表3-4,圖2-3)。
[0038]堿性氨基酸修飾氨基四苯基卟啉化合物介導的光動力療法對大鼠潰瘍性結腸炎 有較好的效果，以高劑量組效果最佳，可作為潰瘍性結腸炎理想的治療藥物。
[0039]表1疾病活動度評分標準
a.與模型組比較p〈〇. 05; b.與模型組比較P〈0.01。
[0043] 表3各實驗組大鼠近端照射處腸組織中GSH、MDA、TNF_a的含量和免疫組化評分 a. . υ? 〇
【主權項】
1. 一種堿性氨基酸修飾氨基四苯基卟啉化合物在制備治療潰瘍性結腸炎藥物的應用， 所述的堿性氨基酸修飾氨基四苯基卟啉化合物具有下述結構：2. 根據(jù)權利要求1所述的用途，其特征是所述的藥物為光動力治療藥物。
【文檔編號】A61P1/00GK105944101SQ201610261149
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月22日
【發(fā)明人】劉天軍, 洪閣, 江勇, 劉娟, 紀?，?
【申請人】劉天軍