一種酯化膽酸/Fe₃O₄磁性納米復(fù)合體及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種新型的酯化膽酸/Fe3O4磁性納米粒子復(fù)合體，該復(fù)合體是用甲酸修飾膽酸使其酯化，與3?氨基丙基三乙氧基硅烷修飾后的含有氨基的Fe3O4磁性納米粒子脫水縮合制得。運(yùn)用X?射線衍射、透射電鏡、紅外光譜和熱重分析方法進(jìn)行表征，證實(shí)Fe3O4磁性納米粒子上接枝了膽酸。該復(fù)合體借助膽酸是內(nèi)源性的肝細(xì)胞特異性的天然配基、具有較好的生物兼容性以及Fe3O4磁性納米粒子的磁學(xué)性能來實(shí)現(xiàn)藥物的磁靶向傳遞，可作為一種重要的藥物載體。鹽酸阿霉素或鹽酸表阿霉素被Fe3O4磁性納米復(fù)合體包合后，不但降低了藥物的毒副作用、提高了藥物的生物相容性，而且在外磁場作用下該包合物還可用于靶向給藥，能最大限度的發(fā)揮藥物療效。
【專利說明】
一種酯化膽酸/Fe3O4磁性納米復(fù)合體及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及磁性納米復(fù)合體及其藥物包合物，具體涉及一種酯化膽酸/Fe3O4磁性納米復(fù)合體及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]磁性納米材料是近年來新興的功能型材料，不僅具有納米粒子的四大效應(yīng):尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、體積效應(yīng)和隧道效應(yīng)，還具有優(yōu)良的磁學(xué)效應(yīng)。常用的磁性納米材料主要是指過渡元素鐵、鎳、鈷或其合金、氧化物等，F(xiàn)e3Ck磁性納米粒子因其高比表面積、生物相容性好、粒徑可控、易制備和在外部磁場下快速響應(yīng)等特性得到人們的特別關(guān)注，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、材料化學(xué)、分離科學(xué)等領(lǐng)域，尤其是在磁靶向給藥方面的應(yīng)用引起了研究者們持續(xù)而廣泛的關(guān)注。
[0003]膽酸(Cholicacid，CA)是人類四種主要膽汁酸中含量最豐富的一種，是人體中存在的一類具有生物活性和生物相容性的兩親性分子(親水性和親油性)。膽酸分子的留環(huán)上連有三個(gè)羥基和一個(gè)羧基易于進(jìn)行化學(xué)修飾。膽酸是在肝細(xì)胞中以膽固醇為原料在酶催化條件下合成的，是肝臟清除膽固醇的主要方式，對降低膽固醇治療有重要作用。另外某些膽酸還有鎮(zhèn)痙、健胃、降低血液中膽留醇含量等作用。膽酸是內(nèi)源性的肝細(xì)胞特異性的天然配基，具有較好的生物兼容性、高度的器官特異性和較高的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，以膽酸及其衍生物為靶向載體，賦予藥物包合物靶向定位功能，能夠?qū)崿F(xiàn)藥物的靶向性傳遞，減少毒副作用。該包合物生物兼容性強(qiáng)、毒副作用低、具有潛在靶向定位作用和抗癌功能，在生物載體方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0004]鹽酸阿霉素(DOX)是從放線菌發(fā)酵液中提取的蒽環(huán)抗生素，是一種氨基糖苷類的廣譜抗腫瘤活性藥物，臨床上用于治療急性白血病、乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌等，作用機(jī)理是藥物分子嵌入DNA鏈中阻斷其復(fù)制而達(dá)到抗腫瘤的目的。鹽酸表阿霉素(EPI)為桔紅色粉末狀結(jié)晶，溶于水，微溶于乙醇，不溶于氯仿、丙酮等溶劑，主要作用是直接嵌入DNA堿基對之間，干擾轉(zhuǎn)錄過程，阻止mRNA的形成。EPI能抑制DNA和RNA的合成，故對細(xì)胞周期各階段均有作用，為細(xì)胞周期非特異性藥物。在臨床上被廣泛用于治療乳腺癌、肺癌、惡性淋巴瘤、卵巢癌、腎癌、胃癌、軟組織肉瘤、惡生黑色素瘤等。但是，在應(yīng)用鹽酸表阿霉素進(jìn)行化療的過程中可能發(fā)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如骨髓抑制、心臟毒性和過敏反應(yīng)等，尤其是藥物蓄積引起的劑量依賴性的骨髓抑制、心臟毒性，成為限制其臨床應(yīng)用的主要因素。此類藥物的安全使用問題也越來越受到社會各界的廣泛關(guān)注，研究和制備該類藥物的靶向給藥系統(tǒng)一直是制藥領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種毒副作用小、生物相容性好的酯化膽酸/Fe3O4磁性納米復(fù)合體及其制備方法，進(jìn)一步將該復(fù)合體與鹽酸阿霉素(DOX)或鹽酸表阿霉素(EPI)制備成藥物包合物，并作為靶向藥物。該靶向藥物在外磁場作用下可使所含藥物定位在病變部位釋放，以降低藥物不良反應(yīng)，減少給藥次數(shù)，發(fā)揮藥物最大療效。
[0006]本發(fā)明所提供的TC-APTES-Fe304-MNPs復(fù)合體，通過包括如下步驟的方法制備得到:
[0007](I )Fe304_MNPs的制備:將摩爾比為I: 1.5-2的FeCl2.4H20和FeCl3.6H20置于反應(yīng)器中，加入反應(yīng)器容量1/3-2/3的二次水，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱、攪拌至溶解，同時(shí)滴加濃氨水(25%)將反應(yīng)液的pH調(diào)至9.5-10.5(優(yōu)選10)，機(jī)械攪拌(優(yōu)選800r/min)反應(yīng)1.5-3小時(shí)(優(yōu)選2小時(shí))，冷卻至室溫，磁滯分離，黑褐色沉淀用二次水洗滌，再用乙醇洗滌至中性，40-700C (優(yōu)選60 0C)真空干燥12小時(shí)，得到Fe3O4-MNPs ；
[0008](2)3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)修飾的Fe3O4-MNPs的制備:取摩爾比為90-110:1的Fe3O4-MNPs和APTES，先將Fe3O4-MNPs超聲分散在乙醇溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入APTES，室溫下機(jī)械攪拌(優(yōu)選800r/min)7-8h，反應(yīng)停止后磁滯分離，棄去上清液，沉淀用無水乙醇洗滌3次，40-7O °C (優(yōu)選6O °C )真空干燥12小時(shí)，得到APTES修飾的磁性納米粒子(APTES-Fe3O4-MNPs);
[0009](3)甲酸修飾膽酸的制備:將膽酸溶解在甲酸溶液中，在50-60 °C (優(yōu)選55 °C)下，攪拌反應(yīng)5-6小時(shí)后，產(chǎn)物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，所得固體過柱提純(展開劑為乙醇:二氯甲烷=2:98); 40-700C (優(yōu)選60 V)真空干燥12小時(shí)，得到甲酸修飾的酯化膽酸(TC)，密封保存；
[0010](4)酯化膽酸/Fe3O4磁性納米復(fù)合體的制備:將酯化膽酸溶解于無水二氯甲烷中，加入縮水劑二環(huán)己基碳二亞胺、催化劑4-二甲氨基吡啶，攪拌lOmin，所述酯化膽酸、縮水劑和催化劑的摩爾比為1: 0.9-1.2:0.8-1.2;同時(shí)稱取酯化膽酸質(zhì)量18-22% (優(yōu)選20 % )的APTES-Fe3O4-MNPs溶于無水二氯甲烷溶液中，超聲使其均勻分散后加入到上述酯化膽酸溶液中，室溫反應(yīng)過夜;所得產(chǎn)物過濾，用二氯甲烷漂洗，再分別用二次水、飽和碳酸氫鈉、二次水洗滌;40-70°C (優(yōu)選600C)真空干燥12小時(shí)，得到酯化膽酸/Fe3O4磁性納米復(fù)合體(TC-APTES-Fe3OfMNPs)。
[0011]本發(fā)明所提供的一種酯化膽酸/Fe304磁性納米復(fù)合體與鹽酸阿霉素(DOX)或鹽酸表阿霉素(EPI)的包合物，通過如下方法制得:
[0012]將TC-APTES-Fe3OfMNPs加入pH=7.4的磷酸緩沖溶液中，超聲混勻，再加入濃度為10—3mol/L的藥物DOX或EPI，緩沖溶液和藥物的體積比1:1，復(fù)合體與藥物的質(zhì)量比為3_5:1;在室溫下超聲lOmin，振蕩24小時(shí);磁滯分離(上清液稀釋一定倍數(shù)后測定其熒光強(qiáng)度，確定包合物中藥物含量)，沉淀在60 °C下真空干燥12小時(shí)，得到TC-APTES-Fe3O4-MNPs與藥物DOX或EPI的包合物。
[0013]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果:
[0014]本發(fā)明在Fe3O4磁性納米粒子上接枝了膽酸，合成了一種新型酯化膽酸/Fe3O4磁性納米粒子復(fù)合體。該復(fù)合體生物兼容性強(qiáng)、毒副作用低、具有靶向定位作用，在生物載體方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值。由于膽酸是內(nèi)源性的肝細(xì)胞特異性的天然配基，具有較好的生物兼容性，以酯化膽酸為靶向載體，賦予藥物包合物肝細(xì)胞靶向定位作用功能，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)藥物的靶向性，減少毒副作用，也能提高肝臟等重要器官對抗癌藥物的吸收能力和器官對藥物的選擇性。本發(fā)明還通過改變緩沖液的pH值研究了酯化膽酸/Fe3O4磁性納米復(fù)合體對DOX和EPI負(fù)載能力，及其在體外釋放的能力。此外，還對其進(jìn)行了細(xì)胞內(nèi)藥物分布評價(jià)。得出該復(fù)合體生物兼容性強(qiáng)、毒副作用低、具有肝細(xì)胞靶向定位作用和抗癌功能，在生物載體方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0015]圖1Fe3O4-MNPs的分離過程。圖中:(a)制備的Fe3(k-MNPs分散在水溶液中；(b)Fe304-MNPs完全被分離。
[0016]圖2Fe304_MNPs(a)、APTES-Fe3O4-MNPs(b)及TC-APTES-Fe3O4-MNPs (c)的紅外光譜圖。
[0017]圖3Fe304_MNPs (a)和 TC-APTES-Fe3OfMNPs (b)的透射電鏡照片。
[0018]圖4TC-APTES-Fe304-MNPs 的 X-射線衍射圖。
[0019]圖5Fe304_MNPs、APTES-Fe304-MNPs和TC-APTES-Fe3OfMNPs的磁滯回線圖。
[0020]圖6Fe304_MNPs(a)、APTES-Fe3O4-MNPs (b)及TC-APTES-Fe3O4-MNPs (c)的熱重分析圖。
[0021]圖7pH 對 TC-APTES-Fe3OfMNPs 與 EPI 和 DOX 負(fù)載作用的影響，F(xiàn):TC-APTES-Fe304-MNPs吸附后上清液中DOX和EPI的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)o: DOX和EPI的熒光強(qiáng)度。
[0022]圖8不同pH條件下兩種藥物(D0X和EPI)的體外釋放曲線。
[0023]圖9藥物EP 1(a)和DOX(b)進(jìn)入HepG2細(xì)胞效果圖。
[0024]圖10藥物EPI(a)和DOX(b)流式實(shí)驗(yàn)效果圖。
[0025]圖11包合物不同濃度下的細(xì)胞毒性圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]實(shí)施例1:TC-APTES-Fe3OfMNPs的制備
[0027](I )Fe304_MNPs的制備:稱取Ig的FeCl2.4H20和2.7g的FeCl3.6H20置于反應(yīng)器中，加入二次水200mL。氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱至80°C，機(jī)械攪拌至溶解；同時(shí)滴加濃氨水(25% )將反應(yīng)液的pH調(diào)至10，在800r/min的條件下反應(yīng)2小時(shí)。待反應(yīng)完畢后將反應(yīng)液冷卻至室溫，磁滯分離，黑褐色沉淀用二次水洗滌3次，再用乙醇反復(fù)洗滌(至少3次)至中性。在60°C真空干燥12 小時(shí)，得到Fe3O4-MNP s ；
[0028](2)APTES-Fe304-MNPs 的制備:將 300mg 的 Fe3O4-MNPs 超聲分散在 600mL 乙醇溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入120uL的APTES。室溫下800r/min機(jī)械攪拌7h，反應(yīng)停止后磁滯分離棄去上清液，沉淀用無水乙醇洗滌3次，在60 0C下真空干燥12小時(shí)，得到APTES-MNPs;
[0029 ] (3)甲酸修飾膽酸的制備:稱取1.042g膽酸，將其溶解在I OmL甲酸溶液中。55 °C下，磁力攪拌5小時(shí)后，產(chǎn)物通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除溶劑，所得固體過柱提純(展開劑:乙醇:二氯甲烷=2:98)。60°(:真空干燥12小時(shí)，得到甲酸修飾的酯化膽酸(TC)，密封保存；
[0030](4)TC-APTES-Fe304_MNPs復(fù)合體的制備:稱取酯化膽酸Ig溶解于20mL無水二氯甲燒中，加入縮水劑二環(huán)己基碳二亞胺0.58g、催化劑4-二甲氨基卩比啶0.24g，攪拌1min。同時(shí)稱取0.2g的APTES-Fe3O4-MNPs溶于無水二氯甲烷溶液中，超聲lOmin，待其均勻分散后加入酯化膽酸溶液中，室溫反應(yīng)過夜。所得產(chǎn)物用二氯甲烷漂洗，再分別用二次水、飽和碳酸氫鈉、二次水洗滌。60 °C真空干燥12小時(shí)，得到TC-APTES-Fe3O4-MNPs。
[0031]從圖2紅外光譜圖顯示:a譜線588cm—1處的吸收峰為Fe3O4-MNPs中Fe-O四面體的特征吸收，3424cm—1處為Fe3O4-MNPs表面-OH的伸縮振動峰。b為APTES-Fe3O4-MNPs的紅外譜線，F(xiàn)e3O4-MNPs被APTES包裹后Fe-O鍵在500-6500^1范圍內(nèi)的特征吸收峰稍有移動，1630cm—1和3420cm—1為-NH和-NH2的伸縮振動峰。b譜線的分析表明:APTES成功修飾到Fe3O4-MNPs表面。c譜線為TC-APTES-Fe3O4-MNPs的紅外譜線，1114cm—1為酯化膽酸中C-C( =0)-0的強(qiáng)吸收峰，此峰強(qiáng)且寬，在酯的紅外光譜中常為第一強(qiáng)峰。1716cm—1為酰胺中C = O伸縮振動，1630cm—1為-NH的伸縮振動峰，1559cm—1為N-H的彎曲振動，1410cm—1為C-N的伸縮振動，以上特征峰的出現(xiàn)證實(shí)了酯化膽酸成功修飾到APTES-Fe3O4-MNPs上。
[0032]圖3的透射電鏡照片顯示:圖中a和b分別為Fe3OfMNPs和TC-APTES-Fe3OfMNPs的TEM照片。從圖中可看到Fe3O4-MNPs和TC-APTES-Fe3O4-MNPs形狀近似球形或橢球形，分散性良好，沒有明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象。Fe3O4-MNPs和TC-APTES-Fe3OfMNPs的平均粒徑分布在12 土2nm,在Fe304_MNPs超順磁性粒徑要求范圍內(nèi)(粒徑小于20nm)，酯化膽酸的修飾對平均粒徑影響不大。
[0033]圖4為TC-APTES-Fe3OfMNPs 的 X-射線衍射圖譜(XRD)。圖中 2Θ 位于 30.27,35.52,43.38，53.70，57.30，62.，80相應(yīng)的衍射峰分別對應(yīng)于Fe3O4面心立方的(220)，(311)，(400)，(422)，(511)和(440)衍射面。上述結(jié)果與JCPDS(N0.85-1436)標(biāo)準(zhǔn)卡片中赤鐵礦的圖譜一致，表明合成的TC-APTES-Fe3OfMNPs具有立方尖晶石結(jié)構(gòu)。選取TC-APTES-Fe3OfMNPs的最強(qiáng)衍射峰(311)用于粒徑估算，由Scherrer公式(I)計(jì)算出TC-APTES-Fe3O4-MNPs的平均粒徑為10.20nm，與TEM測得的粒徑數(shù)據(jù)接近。
[0034]D = 0.89A/Bcos9(I)
[0035]其中，D為粒子的平均直徑/nm，0.89為Scherrer常數(shù)，λ為0.154nm，是X-射線波長，B為衍射峰的半高寬，Θ為衍射角/rad。
[0036]圖5 為 Fe3OfMNPs、APTES-Fe3OfMNPs 和 TC-APTES-Fe304-MNPs 的磁滯回線圖。橫坐標(biāo)為外加磁場強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為單位質(zhì)量磁性物質(zhì)在外加磁場存在時(shí)的感應(yīng)磁性大小。從下圖可以看到，三條曲線都經(jīng)過原點(diǎn)。當(dāng)外加磁場為O時(shí)，以上三種物質(zhì)的磁感應(yīng)強(qiáng)度都為0，符合超順磁的概念，說明以上三種物質(zhì)均是超順磁性的。根據(jù)磁力矩實(shí)驗(yàn)得到結(jié)果為:Fe3O4-MNPs的飽和磁化值可達(dá)到64emu/g，將其包裹以后磁性納米復(fù)合物磁化值分別降至61emu/g。當(dāng)用酯化膽酸進(jìn)一步將APTES修飾后，其磁化值降到了56emu/g。分析原因我們認(rèn)為APTES和酯化膽酸修飾后，沒有明顯的弱化Fe3O4MNPs磁性。
[0037]采用熱重分析(TGA)進(jìn)一步證實(shí)酯化膽酸修飾到Fe304-MNPs表面，并測定了表面修飾劑的含量。Fe3OfMNPs，APTES-Fe3OfMNPs和TC-APTES-Fe304-MNPs的熱重曲線如圖6所示。Fe3O4-MNPs在120 °C左右出現(xiàn)了首次失重，這是Fe3O4-MNPs表面吸附的溶劑(水或乙醇)揮發(fā)造成的。APTES-Fe3O4-MNPs在200-700°C范圍內(nèi)首先失重除去表面吸附溶劑后，接著由于3-氨基丙基的熱分解失重，失重率為4.7%。熱重分析APTES成功修飾到Fe3O4-MNPs表面。TC-APTES-Fe304-MNPs的失重曲線在155°C-275°C以下的失重(3.6%)歸結(jié)為3-氨基丙基的熱分解失重;在275 0C-600°C之間存在一個(gè)顯著的失重(3.7 % )過程，這是由于修飾到磁納米材料上的酯化膽酸等有機(jī)結(jié)構(gòu)的熱分解造成的。TC-APTES-Fe304-MNPs的失重曲線沒有出現(xiàn)增重的過程，說明TC-APTES-Fe304-MNPs包覆Fe3O4MNPs后不容易被氧化，穩(wěn)定性有了很大提高。通過分析及計(jì)算表明，酯化膽酸成功修飾到Fe3O4MNPs表面，修飾量為36.75mg/g。
[0038]實(shí)施例2:pH對TC-APTES-Fe3OfMNPs載藥性能的影響
[0039]稱取7份2mg的TC-APTES-Fe3O4-MNPs，分別加入4mL不同pH(3-9)磷酸緩沖液和4mL濃度為1X10—5mol/L的藥物DOX。超聲lOmin，溶液在室溫下振蕩24小時(shí)。反應(yīng)完畢后，磁滯分離，上清液于491nm處測定其熒光強(qiáng)度。處理數(shù)據(jù)，探究pH對TC-APTES-Fe304-MNPs的載藥性能的影響(TC-APTES-Fe3O4-MNPs對藥物EPI載藥性能的實(shí)驗(yàn)同DOX)。如圖7所示，當(dāng)pH < 8時(shí)，TC-APTES-Fe3O4-MNPs對DOX和EPI的負(fù)載量隨著pH的增大而增大，且在pH=7時(shí)，負(fù)載量明顯增加。pH為8-9時(shí)，負(fù)載量又稍有下降。綜上所述，中性條件更有利于TC-APTES-Fe3O4-MNPs對藥物的負(fù)載。因此選用PH=7.4來探究TC-APTES-Fe304-MNPs對藥物(DOX或EPI)的負(fù)載作用。
[0040]實(shí)施例3:TC-APTES-Fe304-MNPs與鹽酸阿霉素(DOX)或鹽酸表阿霉素(EPI)制備包合物
[0041 ] 稱取20mg TC-APTES-Fe3OfMNPs,加入4mLpH= 7.4的磷酸緩沖溶液中，超聲混勻，再加入4mL濃度為10—5mol/L的DOX，在室溫下超聲1min，振蕩24小時(shí);磁滯分離(上清液稀釋一定倍數(shù)后測定其熒光強(qiáng)度，確定包合物中藥物含量)，沉淀在60°C下真空干燥12小時(shí)，得到TC-APTES-Fe3O4-MNPs與藥物DOX的包合物(EPI包合物的制備條件同DOX包合物的制備)。上清液于491nm處測定其熒光強(qiáng)度，計(jì)算得到DOX和EPI包合物實(shí)際載藥量分別為198.44mg/g和198.6mg/g。
[0042]實(shí)施例4:包合物DOX和EPI的體外釋放研究
[0043]稱取2份2mg的DOX包合物和2份2mg的EPI包合物，分別加入pH = 5和pH= 7.4的PB緩沖溶液各15mL。在37°C的水浴中計(jì)時(shí)釋放，每隔一定時(shí)間取上清液測其熒光，計(jì)算其累計(jì)釋放率。如圖8所示，pH= 5時(shí)，DOX和EPI的累計(jì)釋放率分別達(dá)到42.5%和45% ; pH=7.4時(shí)，DOX和EPI的累計(jì)釋放率分別為18%和10%。對比釋放數(shù)據(jù)可以看出，藥物釋放具有一定的pH依賴性。DOX和EPI的釋放過程均分為兩個(gè)階段。在60min內(nèi)釋放曲線的斜率很大，說明此時(shí)釋放速率較快，這可能是由于吸附在載體表明的DOX和EPI，由于濃度差產(chǎn)生擴(kuò)散引起的。之后變化較緩慢，7小時(shí)左右達(dá)到平臺。說明載體外圍吸附的DOX和EPI達(dá)到了擴(kuò)散平衡。pH= 5的緩沖液中藥物釋放率比pH=7.4的釋放率高。這是由于中性條件下，藥物和載體之間的氫鍵作用力較強(qiáng);酸性條件下，藥物和載體之間的作用力較弱，有利于藥物釋放。
[0044]實(shí)施例5:藥物包合物進(jìn)入HepG2肝癌細(xì)胞的研究
[0045]將EPI包合體和D0X包合體與人肝癌細(xì)胞HepG2分別孵育0.5h、lh、2h和4h，用熒光倒置顯微鏡觀察其在細(xì)胞中的分布(如圖9)。由圖可知:隨著時(shí)間的增長，逐漸在肝癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中觀察到紅色熒光并不斷增大，證明包合體成功的進(jìn)入細(xì)胞，并在不斷釋放藥物。進(jìn)一步通過流式細(xì)胞儀測定了EPI包合體和DOX包合體分別與細(xì)胞共孵育0.5h、lh、2h和4h的熒光強(qiáng)度(如圖10)。其中，EPI包合體對應(yīng)的熒光強(qiáng)度平均值分別為34.14、44.17、50.56、57.39。0(^包合體對應(yīng)的熒光強(qiáng)度平均值分別為34.41、40.14、47.12、48.73。表明1'(:-APTES-Fe3O4-MNPs復(fù)合體是很好的藥物載體，而且EPI效果更好。
[0046]實(shí)施例6: TC-APTES-Fe3O4-MNPs復(fù)合體細(xì)胞毒性評價(jià)及載藥包合物對H印G2細(xì)胞殺死率的測定
[0047]如圖11所示，用MTT法評價(jià)了 TC-APTES-Fe3O4-MNPs復(fù)合體的細(xì)胞毒性。在不同濃度下，良好的細(xì)胞存活率證明了復(fù)合體沒有細(xì)胞毒性，說明該載體有優(yōu)越的生物相容性。當(dāng)載藥包合物進(jìn)入HepG2肝癌細(xì)胞，隨著DOX包合物和EPI包合物濃度的增大，細(xì)胞活性在顯著降低。此外EPI包合物的細(xì)胞殺死率明顯高于D0X，這是由于藥物釋放的程度不同造成的。以上結(jié)果表明TC-APTES-Fe3O4-MNPs是一種無毒、生物相容性好、有效的DOX和EPI藥物運(yùn)載體。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種酯化膽酸/Fe3O4磁性納米復(fù)合體，其特征在于，通過包括如下步驟的方法制備得到: (I )Fe304_MNPs的制備:將摩爾比為I: 1.5-2的FeCl2.4Η20和FeCl3.6Η20置于反應(yīng)器中，加入反應(yīng)器容量1/3-2/3的二次水，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱、攪拌至溶解，同時(shí)滴加濃氨水將反應(yīng)液的PH調(diào)至9.5-10.5，機(jī)械攪拌反應(yīng)1.5-3小時(shí)，冷卻至室溫，磁滯分離，黑褐色沉淀用二次水洗滌，再用乙醇洗滌至中性，40-70 °C真空干燥12小時(shí)，得到Fe3O4-MNPs; (2)3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)修飾的Fe3O4-MNPs的制備:取摩爾比為90-110:1的Fe3O4-MNPs和APTES，先將Fe3O4-MNPs超聲分散在乙醇溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入APTES，室溫下機(jī)械攪拌7_8h，反應(yīng)停止后磁滯分離，棄去上清液，沉淀用無水乙醇洗滌3次，40-70 °C真空干燥12小時(shí)，得到APTES-Fe3O4-MNPs ； (3)甲酸修飾膽酸的制備:將膽酸溶解在甲酸溶液中，在50-60°C下，攪拌反應(yīng)5-6小時(shí)后，產(chǎn)物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，所得固體過柱提純;40-70°C真空干燥12小時(shí)，得到甲酸修飾的酯化膽酸(TC)，密封保存； (4)酯化膽酸/Fe3O4磁性納米復(fù)合體的制備:將酯化膽酸溶解于無水二氯甲烷中，加入縮水劑二環(huán)己基碳二亞胺、催化劑4-二甲氨基吡啶，攪拌lOmin，所述酯化膽酸、縮水劑和催化劑的摩爾比為1: 0.9-1.2:0.8-1.2;同時(shí)稱取酯化膽酸質(zhì)量18-22%的APTES-Fe3O4-MNPs溶于無水二氯甲烷溶液中，超聲使其均勻分散后加入到上述酯化膽酸溶液中，室溫反應(yīng)過夜;所得產(chǎn)物過濾，用二氯甲烷漂洗，再分別用二次水、飽和碳酸氫鈉、二次水洗滌;40-70°C真空干燥12小時(shí)，得到TC-APTES-Fe304-MNPs。2.如權(quán)利要求1所述的酯化膽酸/Fe3O4磁性納米復(fù)合體，其特征在于，所述步驟(I)中反應(yīng)液的pH調(diào)至10，機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速800r/min，反應(yīng)2小時(shí)。3.如權(quán)利要求1所述的酯化膽酸/Fe3O4磁性納米復(fù)合體，其特征在于，所述步驟(2)中機(jī)械攪拌轉(zhuǎn)速800r/min。4.如權(quán)利要求1所述的酯化膽酸/Fe3O4磁性納米復(fù)合體，其特征在于，所述步驟(3)中在55 °C下，攪拌反應(yīng)5-6小時(shí)。5.如權(quán)利要求1所述的酯化膽酸/Fe3O4磁性納米復(fù)合體，其特征在于，所述步驟(3)中過柱提純的展開劑為乙醇:二氯甲烷= 2:98。6.如權(quán)利要求1所述的酯化膽酸/Fe3O4磁性納米復(fù)合體，其特征在于，所述步驟(4)中APTES-Fe3O4-MNPs的量為酯化膽酸質(zhì)量的20%。7.如權(quán)利要求1所述的酯化膽酸/Fe3O4磁性納米復(fù)合體，其特征在于，所述步驟(I)、(2)、(3)或(4)中真空干燥溫度為60°C。8.如權(quán)利要求1所述的酯化膽酸/Fe3O4磁性納米復(fù)合體在制備抗腫瘤靶向藥物中的應(yīng)用。9.一種酯化膽酸/Fe3O4磁性納米復(fù)合體與鹽酸阿霉素(DOX)的包合物，通過如下方法制得: 將權(quán)利要求1所述TC-APTES-Fe3O4-MNPs加入pH = 7.4的磷酸緩沖溶液中，超聲混勻，再加入濃度為10—3mol/L的藥物DOX或EPI，緩沖溶液和藥物的體積比1:1，復(fù)合體與藥物的質(zhì)量比為3-5: I;在室溫下超聲1min，振蕩24小時(shí);磁滯分離，沉淀在60°C下真空干燥12小時(shí)，得到TC-APTES-Fe3O4-MNP s與藥物DOX的包合物。10.—種酯化膽酸/Fe304磁性納米復(fù)合體與鹽酸表阿霉素(EPI)的包合物，通過如下方法制得: 將權(quán)利要求1所述TC-APTES-Fe3O4-MNPs加入pH = 7.4的磷酸緩沖溶液中，超聲混勻，再加入濃度為10—3mol/L的藥物DOX或EPI，緩沖溶液和藥物的體積比1:1，復(fù)合體與藥物的質(zhì)量比為3-5: I;在室溫下超聲1min，振蕩24小時(shí);磁滯分離，沉淀在60°C下真空干燥12小時(shí)，得到TC-APTES-Fe3O4-MNPs 與 EPI 的包合物。
【文檔編號】A61K47/48GK105903030SQ201610255261
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月22日
【發(fā)明人】梁文婷, 李丹, 趙美玲, 弓韜, 董川, 雙少敏
【申請人】山西大學(xué)