二十二碳六烯酸乙酯在制備改善興奮性神經(jīng)毒性藥物中的應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及二十二碳六締酸乙醋在制備改善興奮性神經(jīng)毒性藥物中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 癒痛化pilepsy)是慢性反復發(fā)作短暫腦功能失調(diào)綜合征，是神經(jīng)科常見疾病之 一，而運種反復發(fā)作的神經(jīng)元異常放電所致的暫時性中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常的慢性疾病。 其病理基礎(chǔ)可能是興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)失衡，由癒痛導致的神經(jīng)元死亡可能 在一定程度上是由活性氧簇(Reactive Oxygen Species,R0S)的過度產(chǎn)生引起的。能夠預 防和治療此類疾病的功能性食品W及相關(guān)藥物研發(fā)受到了各個領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。
[0003] 紅藻氨酸化ainicAcicUKA)是一種谷氨酸類似物，它是中樞神經(jīng)系統(tǒng)強力的驚厥 劑和神經(jīng)毒素。注射了 KA的大鼠會引起伴隨著明顯的海馬區(qū)（Hippocampus)、杏仁核 (Amygdala)和梨狀皮質(zhì)(Piriform Cortex)神經(jīng)元損傷的癒痛綜合征，同時其致癒機制也 與導致跨膜離子失衡，引起巧離子等的內(nèi)流，從而釋放過量ROS攻擊神經(jīng)元內(nèi)的大分子，引 起神經(jīng)元功能素亂甚至死亡。因此KA模型被廣泛接受并應用于模擬人類癒痛持續(xù)狀態(tài)的實 驗模型。
[0004] 本發(fā)明所述的二十二碳六締酸乙醋化t-DHA)進入人體后，可水解成活性的DHA而 發(fā)揮作用。DHA具有預防屯、腦血管梗塞、抗炎癥、降血脂、抗癌等生理作用，W往的研究表明 DHA對腦缺血損傷等具有保護效應，但是在細胞水平上或用電生理刺激的方法及整體動物 水平上對DHA的保護效應少有研究，并且其保護機制尚不明確。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提出了二十二碳六締酸乙醋在制備改善興奮性神經(jīng)毒性藥物中的應用，即 在制藥中的新應用。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的是提出了二十二碳六締酸乙醋在治療癒痛的藥物中的應用， 即在制藥中的新應用。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案是運樣實現(xiàn)的：
[000引二十二碳六締酸乙醋在制備改善興奮性神經(jīng)毒性藥物中的應用。
[0009] 二十二碳六締酸乙醋在制備改善興奮性神經(jīng)毒性藥物中的應用，所述二十二碳六 締酸乙醋通過降低U)H釋放和ROS生成，抑制化spase-3活性，調(diào)控線粒體依賴的細胞調(diào)亡通 路從而保護PCl 2細胞免受KA誘導的氧化應激損傷。
[0010] 二十二碳六締酸乙醋在制備治療癒痛的藥物中的應用。
[0011] 二十二碳六締酸乙醋在制備治療癒痛的藥物中的應用，二十二碳六締酸乙醋作為 神經(jīng)保護成分。
[0012] -種改善興奮性神經(jīng)毒素藥物包括二十二碳六締酸乙醋。
[0013] 所述的改善興奮性神經(jīng)毒素藥物，所述二十二碳六締酸乙醋的分子式為：
O
[0015] 本發(fā)明的有益效果為：通過體外培養(yǎng)PC12細胞，表明二十二碳六締酸乙醋化t-DHA)通過降低LDH釋放和ROS生成，抑制化spase-3活性，調(diào)控線粒體依賴的細胞調(diào)亡通路從 而保護PC12細胞免受KA誘導的氧化應激損傷，并推測該保護效應與化-DHA能改變細胞膜及 線粒體膜的通透性有關(guān)。研究結(jié)果掲示，Et-DHA作為一種神經(jīng)保護成分運用于防治由癒痛 等疾病。
【附圖說明】
[0016] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可 W根據(jù)運些附圖獲得其他的附圖。
[0017] 圖IA是KA細胞毒性的形態(tài)學分析。
[0018] 圖IB是KA對PC12細胞存活率的影響。其中，## :KA組與正常對照組相比，P<0.0 l。
[0019] 圖2A是Et-DHA對PCl 2保護作用的形態(tài)學分析。
[0020] 圖2B是Et-DHA對PC12細胞存活率的影響。其中，##:KA組與正常對照組相比，P< 0.0 l; :Et-DHA組與KA組相比，P<0.0 l。
[0021] 圖3是巧光素染料化echst 33258檢測化-DHA對PC12細胞核型的影響。
[0022] 圖4是Et-DHA對乳酸脫氨酶化DH)釋放量的影響。其中，##:KA組與正常對照組相 tt，P<〇. Ol;林:化-DHA組與KA組相比，P<0.0 l。
[0023] 圖5是化-DHA對細胞內(nèi)活性氧簇(ROS)生成量的影響。其中，##:KA組與正常對照組 相比，P<〇. Ol; ** :Et-DHA組與KA組相比，P<0.0 l。
[0024] 圖6是Et-DHA對細胞內(nèi)Caspase-3蛋白生成量的影響。其中，1:空白對照；2: 30mM KA;3:30mMKA+10yM^-DHA;4:30mMKA+30iiM^-DHA。
【具體實施方式】
[0025] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于 本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0026] 實施例1細胞培養(yǎng)與處理
[0027] PC12細胞使用添加了 10%(v/v)胎牛血清、lOOU/mL青霉素 W及l(fā)OOU/mL鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基，在37 °C下，5 %二氧化碳的濕潤空氣中培養(yǎng)。實驗前細胞被分到平板中，密度為 2X105個細胞每孔。PC12細胞在不添加或添加不同濃度化-畑A(終濃度：10,30山O的DMEM培 養(yǎng)液中解育2地。然后添加 KA(終濃度:30mM)，再培養(yǎng)12hW開展后續(xù)實驗。在上述步驟中，給 予對照培組相同量的DMEMdKA溶于DMEM培養(yǎng)基。Et-DHA溶于二甲基亞諷（Dimethyl Sulfoxide，DMS0) dDMSO的終濃度小于0.1 % (v/v)。在上述步驟中KA及化-畑A的濃度是通過 我們的預實驗選擇的。所有的操作在相同的實驗條件下重復=次(n = 3)。
[002引實施例2KA的細胞毒性
[0029] PC12細胞W每孔IX 105個細胞的密度接種到平板中。持續(xù)生長2地，之后在培養(yǎng)基 中添加不同濃度的KA(終濃度:0，l，3，10,30和100mM)。KA處理細胞12h后，開始所有的測定。 KA的細胞毒性通過MTT檢測測定(Mosmann，1983)。如圖IB所示，MTT檢測的細胞存活率結(jié)果 表明了 KA對細胞活性的抑制具有濃度依賴性，同時具有統(tǒng)計學意義上的顯著性(P<0.01)。 KA在濃度為IOOmM時對PC12細胞的抑制率同樣大約達到了50%，但是與30mM處理組相比較 無顯著性差異，故將KA SOmM選作后續(xù)試驗的PC12細胞適宜的損傷模型劑量。
[0030] 實施例3Et-DHA對PC12細胞的保護作用的測定
[0031] 每孔1X105個細胞的PC