桑色素的一種新藥物用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及桑色素的一種新藥物用途，屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝X受體（liverXreceptors,LXR)是核受體轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，分為 LXRa(NR1H3)和LXR0 (NR1H2)兩種同源亞型。LXRa僅高表達(dá)于肝臟、小腸、脾臟、腎臟、 脂肪等有限的組織中，而LXRi3則廣泛分布于人體的各種組織中。在過去的二十年里，人們 發(fā)現(xiàn)了LXRs的許多生理功能，其可通過調(diào)控其一系列下游靶基因的表達(dá)來調(diào)控脂質(zhì)代謝、 糖代謝和免疫功能調(diào)節(jié)等。這些生理功能的異常直接與動(dòng)脈硬化、脂肪肝、肥胖、糖尿病和 腫瘤等疾病的發(fā)展有關(guān)。
[0003] 目前已知的LXRs靶基因主要有膽固醇7a-羥化酶（CYP7A1)、載脂蛋白 E(APOE)、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1/G1/G5/G8(ABCA1/G1/G5/G8)、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋 白-lc(SREBP-lc)、脂蛋白脂酶（LPL)和脂肪酸合成酶（FAS)等。由于這些靶基因大多都能 通過不同途徑參與脂質(zhì)代謝、脂肪酸合成和糖原異生等生理過程，所以LXRs又被譽(yù)為是人 體糖脂代謝的調(diào)節(jié)器。
[0004] 因?yàn)長(zhǎng)XRs及其信號(hào)通路的激活顯現(xiàn)了明顯的降膽固醇的效果，而且之前的研究 也顯示了合成的LXRs激動(dòng)劑GW3965能夠減緩apoE/和LDLR/小鼠的動(dòng)脈硬化的發(fā)展，然 而激動(dòng)劑在激活LXRs，降低膽固醇的同時(shí)，也可通過增加其下游生脂基因的表達(dá)而增加甘 油三脂合成，導(dǎo)致嚴(yán)重的脂肪肝、高甘油三酯血癥，甚至肥胖等不良反應(yīng)，而使得LXRs激動(dòng) 劑的研發(fā)遇到了巨大的困難。
[0005] 相對(duì)于LXRs激動(dòng)劑而言，LXRs拮抗劑卻很少有人研究。然而最近的研究也報(bào)道 LXRs拮抗劑同樣具有防治代謝紊亂的療效。人們也從天然植物中發(fā)現(xiàn)了一些具有LXRs拮 抗效果的天然產(chǎn)物，其中最具潛力的是5α，6α環(huán)氧膽固醇-3-硫酸鹽（ECHS)和7-酮基 膽固醇-3-硫酸鹽能通過抑制LXR的轉(zhuǎn)錄活性而阻止小鼠動(dòng)脈硬化的斑塊形成。另外葡萄 柚中的柚皮素作為一種LXRa抑制劑，具有降低甘油三酯和膽固醇的作用，并有望成為一 種新型的降脂藥物。五葉地錦和野鴨椿抽提物可以抑制LXR轉(zhuǎn)錄而抑制脂肪細(xì)胞分化，具 有潛在的減肥降脂療效。許多LXRs拮抗劑在抑制甘油三脂合成的同時(shí)，并未顯示出升高膽 固醇的副作用。這些研究表明LXRs拮抗劑對(duì)于改善代謝性疾病的新藥研發(fā)具有重要意義。
[0006] 桑色素是從?？浦参锏臉淦ず驮S多中草藥中提取的一種淺黃色色素，是一種化學(xué) 分析中常用的顯色劑，一般用來檢測(cè)痕量的鐵、鋅、鈷等，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下所示：
[0007]
[0008] 目前，關(guān)于桑色素的藥物用途主要是抗炎、抗腫瘤和抗氧化作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供桑色素的一種新藥物用途，以拓展桑色素的應(yīng)用價(jià)值。
[0010] 本發(fā)明所述的桑色素的新藥物用途，是指以桑色素作為活性成分用于制備肝X受 體-β(LXRi3受體）拮抗劑。
[0011] 進(jìn)一步說，本發(fā)明所述的桑色素的新藥物用途，是指以桑色素作為活性成分用于 制備預(yù)防、緩解和/或治療由肝X受體_β介導(dǎo)的代謝性疾病的藥物。
[0012] 更進(jìn)一步說，所述的代謝性疾病包括但不限于：代謝綜合征、糖尿?。ǜ训貫镮I 型糖尿?。⒁葝u素抵抗、高脂血癥、肥胖癥、動(dòng)脈粥樣硬化、脂肪肝和/或它們的并發(fā)癥。
[0013] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明中所述的桑色素可通過多種本領(lǐng)域熟知的方法、 利用公知的原料獲得，比如化學(xué)合成或從植物中提取分離等。
[0014] 本發(fā)明中所述的藥物可以采用各種劑型，包括但不限于：顆粒劑、膠囊劑、注射劑、 酊劑、口服液、片劑、口含劑、沖劑、丸劑、散劑等常見劑型或納米制劑等緩釋劑型。
[0015] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：桑色素能夠選擇性的抑制LXRi3的轉(zhuǎn)錄活性，具有明顯的抑制脂 肪細(xì)胞分化的體外效果，以及阻斷高脂餐誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠體重增加、抑制體脂肪細(xì)胞 的體積增加、改善小鼠空腹血糖、胰島素抵抗和小鼠的血脂異常等體內(nèi)效果，說明桑色素可 望通過選擇性的抑制LXRi3的轉(zhuǎn)錄活性達(dá)到預(yù)防、緩解和/或治療由肝X受體-β介導(dǎo)的 代謝性疾病，可望開發(fā)為一種低毒高效的LXRβ受體拮抗劑及用于制備預(yù)防、緩解和/或治 療由肝X受體-β介導(dǎo)的代謝性疾病的藥物。
【附圖說明】
[0016] 圖1Α體現(xiàn)了桑色素對(duì)核受體LXRα轉(zhuǎn)錄活性的影響。
[0017] 圖1Β體現(xiàn)了桑色素對(duì)核受體LXRβ轉(zhuǎn)錄活性的影響。
[0018] 圖2體現(xiàn)了桑色素對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞分化的抑制作用。
[0019] 圖3體現(xiàn)了桑色素對(duì)肥胖小鼠脂肪細(xì)胞體積的減小作用。
[0020] 圖4體現(xiàn)了桑色素對(duì)高脂飼料誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠體重增加的阻止作用。
[0021] 圖5體現(xiàn)了桑色素對(duì)高脂飼料誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠血脂異常的預(yù)防作用。
[0022] 圖6體現(xiàn)了桑色素對(duì)高脂飼料誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠血脂異常的治療作用。
[0023] 圖7體現(xiàn)了桑色素對(duì)高脂飼料誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠肝臟的甘油三酯含量的影響。
[0024] 圖8體現(xiàn)了桑色素對(duì)高脂飼料誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠空腹血糖和葡萄糖耐受能力的 影響。
[0025]圖9體現(xiàn)了桑色素對(duì)高脂飼料誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠胰島素耐受能力的影響。
[0026]圖中表示與對(duì)照組比較，Ρ〈0· 05。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說明，但并不因此限制本發(fā)明；本 領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)下述內(nèi)容所作的一些非本質(zhì)的改進(jìn)或替換均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0028] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所 建議的條件。
[0029]I.材料和方法
[0030] 1.藥物和動(dòng)物
[0031]8周齡C57BL/6小鼠，體重約22-25克/只。飼養(yǎng)條件為SPF級(jí)，飼養(yǎng)溫度為 22-23Γ。12小時(shí)晝夜交替。動(dòng)物飼料購(gòu)自Research Diet(高脂D12492,低脂D12450B)。
[0032] 桑色素為單體化合物，純度>98%，來源于市購(gòu)。
[0033] 2.實(shí)驗(yàn)試劑與儀器
[0034] DMEM培養(yǎng)液（Hyclone，Logan，UT);
[0035]胰蛋白酶（Gibco，USA);
[0036]小牛血清（Gibco, USA);
[0037] Oil Red 0(Sigma，St. Louis，MO);
[0038] Dexamethasone (Sigma, St. Louis, M0)；
[0039] Insulin (Sigma，St. Louis，M0);
[0040] DMS0(Sigma，St. Louis，M0);
[0041]FuGENE?HD Transfection Reagent (Roche, Mannheim, Germany)；
[0042] Rosiglitazone (Sigma，St. Louis，M0);
[0043] GW3965 (Sigma, St. Louis, M0)；
[0044] Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega, USA)；
[0045] Plasmid Midi Kit(25) (Qiagen, Germany)；
[0046] 二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoScientific，RS-485,USA);
[0047]潔凈工作臺(tái)（AIRTECH，SW-CJ，USA);
[0048]細(xì)胞顯微鏡（Olympus，CKX41，Japan);
[0049]電鏡掃描儀（Philip，XL-30, USA);
[0050]高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge5810R，Germany);
[0051]小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge5424R，Germany);
[0052]通用臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge5415R，Germany);
[0053]多功能酶標(biāo)儀（Bio-Tek，Synergy HT，USA);
[0054]制冰機(jī)（雪科電器有限公司，IMS-40,中國(guó)）；
[0055]凝膠成像儀（上海天能科技有限公司，Tanon-2500,中國(guó)）；
[0056]移液器（Eppendorf Research，Germany);
[0057]丨旦溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司，DHP-9082,中國(guó)）；
[0058] 48孔板（Corning，USA);
[0059] 0· 22μm、0. 45μm微孔濾膜（Millipore，Germany);
[0060] 異丙醇、福爾馬林、娥酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司）；
[0061] 3.LXRa/p報(bào)告基因分析
[0062] (1)293T細(xì)胞培養(yǎng)
[0063] 293Τ細(xì)胞株（人胚腎細(xì)胞株）用含10%小牛血清及1 %雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基于 37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293Τ細(xì)胞鋪板，細(xì)胞密度為1Χ105~2Χ105 個(gè)/mL鋪板于48孔板中。
[0064] (2)供轉(zhuǎn)染質(zhì)粒
[0065]pCMX-Gal-mLXRa,βLBD質(zhì)粒，Gal4reportervectorMH100X4-TK-Luc重組質(zhì)粒 以及Renillaluciferase內(nèi)參質(zhì)粒。
[0066] (3)轉(zhuǎn)染
[0067] 過夜，待細(xì)胞長(zhǎng)至50~80%的密度時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用DMEM(無血清無雙抗）配 制轉(zhuǎn)染體系：在每毫升的DMEM中含有10μg的總質(zhì)粒，以及15μL的轉(zhuǎn)染試劑-FuGENE HD(Roche,Mannheim,Germany)，然后將轉(zhuǎn)染體系潤(rùn)旋混勻，并室溫放置15min，然后將轉(zhuǎn)染 體系共轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞中，培養(yǎng)4~6h后，換用完全培養(yǎng)基（DMEM，10%FBS，1%雙抗）繼 續(xù)培養(yǎng)至24h。
[0068] (4)加藥干預(yù)
[0069] 24h后，加入用完全培養(yǎng)基稀釋的不同濃度梯度（10、25、50μΜ)的桑色素進(jìn)行干 預(yù)，每孔加入250μL終濃度藥物溶液。并且同時(shí)加入LXR激動(dòng)劑GW3965 (10μΜ)。
[0070] (5)細(xì)胞處理
[0071] ①24h后，用PBS清洗細(xì)胞兩次，除去剩余的細(xì)胞培養(yǎng)液；
[0072] ②每孔加入65μL的裂解液，搖床振蕩15min，待細(xì)胞裂解完全，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn) 移到1. 5mL離心管中；
[0073] ③將細(xì)胞裂解液于lOOOrpm離心5min，取上清液10μL于新的離心管中，待測(cè)。
[0074](6)測(cè)定與分析熒光素酶強(qiáng)度
[0075] ①加LARII液20μL，混勻，測(cè)熒光，2秒延遲，讀10秒。轉(zhuǎn)染效率利用內(nèi)參Reni1la 熒光素酶活性校正。所有轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)三次，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組至少2個(gè)副孔。
[0076] ②利用Bio-Tek，SynergyHT多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行螢火蟲和海洋腔腸螢光強(qiáng)度檢測(cè)。 螢火蟲螢光素酶表達(dá)強(qiáng)度用螢火蟲螢光和海洋腔腸螢光強(qiáng)度的比值表示，相對(duì)熒光強(qiáng)度= 螢火蟲螢光強(qiáng)度/海洋腔腸螢光強(qiáng)度，即主要利用熒光素酶相對(duì)表達(dá)活性反映外加藥物是 否通過