Sculponin R在制備治療腎癌藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及化合物Sculponin R的新用途，具體涉及Sculponin R在制備治療腎 癌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] Hua-Yi Jiang等人首次分離純化出化合物Sculponin R，并將成果發(fā)表在著名 天然產(chǎn)物雜志 Journal ofNatural Product 上（Enmein-type 6, 7-sec〇-ent_Kauranoids from Isodon sculponeatus，J. Nat. Prod.，2013, 76, 2113-2119) 〇
[0003] 目前尚未有該化合物關(guān)于治療腎癌的活性報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種Sculponin R的醫(yī)藥用途。
[0005] 上述目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0006] Sculponin R在制備治療腎癌藥物中的應(yīng)用，所述Sculponin R化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下，
[0008] 進(jìn)一步地，所述腎癌為腎癌786-0和0S-RC -2。
【具體實(shí)施方式】
[0009] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容。
[0010] 實(shí)施例1 :Sculponin R的分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0011] Sculponin R的制備方法同文獻(xiàn)報(bào)道的制備方法（Enmein-type 6, 7-sec〇-ent_Kauranoids from Isodon sculponeatus，J.Nat.Prod.，2013,76， 2113-2119)。
[0012] 結(jié)構(gòu)確證：白色無定形粉末，分子式為CmH26O7，不飽和度為8。核磁共振氫譜 數(shù)據(jù) S H (ppm，DMS0-d6,400MHz) :H-1 (5. 32, t，J = 8. 4)，H-2 (2. 44, m)，H-2 (2. 12, m)， H-3 (3. 79, d，J = 4. 4)，H-5 (3. 99, d，J = 3. 3)，H-6 (5. 88, d，J = 3. 3)，H-9 (2. 22, d，J = 10.6)，H-Il (4.43, m)，H-12 (2. 62, overlap)，H-12 (1.65, m)，H-13 (2.49, m)，H-14 (2. 84， m)，H-14(2. 61，overlap)，H-17(l. 50, s)，H-18(l. 26, s)，H-19(l. 04, s)，H-20(4. 73, d，J =9. 2)，H-20(4. 19, d，J = 9. 2);核磁共振碳譜數(shù)據(jù) S c(ppm，DMS0-d6,100Hz) :71. 5(CH， 1-C)，34. 7 (CH2, 2-C)，81. 6 (CH，3-C)，42. I (C，4-C)，52. 8 (CH，5-C)，109. I (CH，6-C)， 171. 2(C，7-C)，56. 3(C，8-C)，54. 0(CH，9-C)，51. 3(C，10-C)，64. I (CH，11-C)，33. 9(CH2， 12-C)，41. 4 (CH，13-C)，31. I (CH2,14-C)，211. 8 (C，15-C)，78. 0 (C，16-C)，19. I (CH3,17-C)， 20. 9 (CH3,18-C)，28. 2 (CH3,19-C)，76. 2 (CH2, 20-C)。結(jié)構(gòu)確證數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道一致，因此可 以確定本發(fā)明制備的化合物即為文獻(xiàn)報(bào)道的Sculponin R。
[0013] 實(shí)施例2 :Sculponin R的藥理作用試驗(yàn)
[0014] -、材料和儀器
[0015] 786-0腎癌細(xì)胞株、0S-RC-2腎癌細(xì)胞株均購自中科院細(xì)胞庫。Sculponin R自 制，HPLC歸一化純度大于98%。RPMI-1640培養(yǎng)基、lOOU/mL青霉素及100 y g/mL鏈霉素、 IXPBS緩沖液、胰酶-EDTA購于美國HyClone。胎牛血清購于美國Gibco。細(xì)胞增殖與毒性 檢測試劑盒（中國）?；|(zhì)膠購于美國BDBioscience。
[0016] HERAcell240i恒溫孵箱、GmbHD-37520低溫離心機(jī)、1510酶標(biāo)儀為芬蘭Thermo公 司產(chǎn)品。頂T-2倒置相差顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。DFC480正置顯微鏡為德國徠卡 公司產(chǎn)品。MDF-U53V-80°C超低溫冰箱為日本SANYO公司產(chǎn)品。YDS-50B-80液氮儲存罐購 自中國成都液氮容器廠。BC-185GE 4°C冰箱為中國益友公司產(chǎn)品。Minispinplus小離心機(jī) 為Eppendorf公司產(chǎn)品。powerpac300電泳儀為美國Biorad公司產(chǎn)品。Las4000mini凝膠 成像儀為日本FUJIFILM公司。
[0017] 二、試驗(yàn)方法
[0018] 1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0019] (1)常規(guī)培養(yǎng)及細(xì)胞傳代：786-0及0S-RC-2腎癌細(xì)胞株均培養(yǎng)在改良型 RPMI-1640培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)時(shí)加入了 10%胎牛血清及1%青霉素和鏈霉素，構(gòu)成完全培 養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為37°C、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱。正常情況下786-0及0S-RC-2細(xì)胞均為貼 壁生長。每天在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，一般隔天換液一次。換液時(shí)先吸去 培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，加PBS洗漆2次后再加入完全培養(yǎng)基。細(xì)胞密度達(dá)到80-90 %且 細(xì)胞形態(tài)仍保持良好時(shí)進(jìn)行傳代，傳代周期一般為3天。細(xì)胞傳代步驟如下：1)先棄去培養(yǎng) 瓶內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗2次；2)培養(yǎng)瓶內(nèi)加ImL胰蛋白酶-EDTA，37°C孵育約3分鐘，倒置顯微 鏡下觀察細(xì)胞變圓并脫落后，加入3mL完全培養(yǎng)基終止消化，并用吸管將成團(tuán)的細(xì)胞吹散； 3)細(xì)胞懸液移至15mL離心管中，1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄去上清，加入完全培養(yǎng)基吹散 細(xì)胞沉淀，分裝到3個(gè)培養(yǎng)瓶中，置于37°C、5% CO2中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0020] (2)細(xì)胞凍存：細(xì)胞處于對數(shù)生長期，狀態(tài)良好并且細(xì)胞密度達(dá)到80~90 %凍存 細(xì)胞，步驟如下：1)配制細(xì)胞凍存液：將改良型RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO按7:2:1 比例混合、震蕩混勻；2)消化、離心細(xì)胞（具體見細(xì)胞傳代步驟）；3)離心后吸去上清液，加 入凍存液并吹勻，調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)約I X 107mL，移至I. 2mL凍存管中。在凍存管標(biāo)記凍存日期 及細(xì)胞株信息，用封口膜封口。置于4°C冰箱30分鐘，移至-20 °C冰箱2小時(shí)，再移至-80 °C 冰箱過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮中保存。
[0021] (3)細(xì)胞復(fù)蘇：1)水浴鍋預(yù)熱到37°C準(zhǔn)備；2)從-80°C冰箱或液氮中取出細(xì)胞，迅 速放入37°C的水浴鍋中并搖動，使其內(nèi)液體在1-2分鐘內(nèi)融化；3)將融化后的細(xì)胞懸液移 置15mL離心管中，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，離心后棄去上清并加入完全培養(yǎng)基。4)將細(xì) 胞置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日觀察細(xì)胞狀態(tài)并換液。
[0022] (4)細(xì)胞計(jì)數(shù)：1)細(xì)胞消化，吹散制備細(xì)胞懸液，方法同細(xì)胞傳代。用加樣器吸取 20 y L懸液沿蓋玻片邊緣燒靠外側(cè)滴加，使懸液由于氣壓影響均勻吸入計(jì)數(shù)察，健康活細(xì)胞 呈規(guī)則圓形、透明狀。計(jì)算計(jì)數(shù)板4個(gè)角的4大格內(nèi)細(xì)胞數(shù)（格子邊線上的細(xì)胞只記上邊、 不計(jì)下邊；只記左邊、不記右邊）。細(xì)胞密度=4大格細(xì)胞總數(shù)X0. 25X 107mL。
[0023] 2、細(xì)胞增殖曲線繪制
[0024] (1)當(dāng)786-0及0S-RC-2細(xì)胞處于對數(shù)生長期，密度80~90%時(shí)，制備細(xì)胞懸液 并細(xì)胞計(jì)數(shù)，方法同上。調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度為IXIO5AiL; (2)接種細(xì)胞懸液ImL接種于于 24孔板上，然后再根據(jù)不同條件加藥，保證每孔細(xì)胞數(shù)基本一致。同一種細(xì)胞同一種加藥 條件設(shè)計(jì)計(jì)數(shù)6天，每天計(jì)數(shù)3個(gè)孔，即每種條件需設(shè)置18個(gè)孔；（3)將培養(yǎng)板置于37°C、 5% 0)2中培養(yǎng)；(4)從接種次日開始計(jì)數(shù)，記為第1天（第0天細(xì)胞數(shù)記為接種細(xì)胞數(shù)，即 IXIO5)。每孔加200yL胰酶-EDTA，消化、吹散、計(jì)數(shù)即可。每隔24小時(shí)取3個(gè)孔進(jìn)行細(xì) 胞計(jì)數(shù)；（5)根據(jù)計(jì)數(shù)所得數(shù)據(jù)繪制細(xì)胞生長曲線。
[0025] 3、WST-8細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)
[0026] (1)收集對數(shù)生長期的786-0及0S-RC-2細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液、細(xì)胞計(jì)數(shù)，方法同 上。調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度為4X IO4mL; (2)每孔中加入50 y L細(xì)胞懸液（即2000個(gè)細(xì)胞/ 孔），然后各逾加入含有設(shè)計(jì)值2倍濃度藥物的完全培養(yǎng)基50 y L混勾，這樣使藥物終濃度 恰好為設(shè)計(jì)值，且保證了各孔細(xì)胞數(shù)的一致性。每個(gè)條件設(shè)置5個(gè)復(fù)孔；（3)將細(xì)胞置于 5% C02、37°C條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育；(4)分別在24小時(shí)和48小時(shí)后終止培養(yǎng)，吸取 孔內(nèi)培養(yǎng)基，更換新鮮完全培養(yǎng)基，每孔加入10 y LWST-8溶液，用加了新鮮完全培養(yǎng)基和 WST-I溶液但沒有接種細(xì)胞的孔作為空白對照；（5)避光條件下置于搖床5分鐘搖勾，后繼 續(xù)放入37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時(shí)；(6)酶標(biāo)儀下測定450nm吸光度值；(7)