鈣黃綠素在防治甲型流感藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及鈣黃綠素在制備抑制甲型流感病毒藥物中的 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 流行性感冒（以下簡(jiǎn)稱流感）是由黏液病毒科的RNA病毒引起的急性病毒性呼吸 道傳染病，它具有感染性強(qiáng)，傳播速度快等特點(diǎn)。每年世界范圍內(nèi)流感都會(huì)導(dǎo)致25-50萬人 口死亡，給全球人類經(jīng)濟(jì)和健康帶來巨大損失，是人類至今尚不能有效控制的世界性傳染 病。流感病毒又根據(jù)其核蛋白（Nucleoprotein, NP)和膜蛋白（Membrane protein, MP)中 抗原特性和基因特性不同，病毒被分為甲（A)，乙（B)和丙（C)三型。其中，甲型流感病毒感 染范圍廣，危害大，最常見也最容易引起世界大流行和地區(qū)流行。
[0003] 由于甲型流感病毒是引起流感流行的主要病原體，因此也成為流感預(yù)防與治療的 主要關(guān)注點(diǎn)。與其他兩種類型流感病毒一樣，甲型流感病毒表面有兩種類型糖蛋白，分別是 血凝素（Hemagglutinin, HA)和神經(jīng)氨酸酶（Neuraminidase, NA)。而甲型流感病毒根據(jù) HA和NA的抗原特性和基因特性不同將其分為很多亞型，迄今為止，發(fā)現(xiàn)血凝素有15個(gè)亞 型（H1-15)，神經(jīng)氨酸酶有9個(gè)亞型（N1-9)。研究發(fā)現(xiàn)，NA在流感病毒的感染、復(fù)制、成熟、 脫殼、釋放等過程都發(fā)揮了重要的作用，使得以NA為靶點(diǎn)研發(fā)而成的神經(jīng)氨酸酶抑制劑 (NAI)成為抗流感病毒最有效的藥物。目前已在臨床上市的NAI包括扎那米韋（Zanamivir ; 商品名：樂感清)、奧司他韋（Oseltamivir ;商品名：達(dá)菲）和帕拉米韋（Peramivir)。然而， NA突變而造成的耐藥病毒株的出現(xiàn)和現(xiàn)有藥物的副作用，使得研究和發(fā)現(xiàn)新的種類的NAI 顯得尤為迫切。
[0004] 藥物的設(shè)計(jì)與開發(fā)是一件耗資巨大而效率很低的工作，據(jù)國(guó)際上的統(tǒng)計(jì)，研制成 功一種新藥，平均需要花費(fèi)10-12年的時(shí)間，耗資2. 0-3. 5億美元，并且這一費(fèi)用正以每年 20%的速度遞增。造成這種狀況的一個(gè)重要原因就是缺乏深入的理論指導(dǎo)，因此，迫切需要 應(yīng)用新的理論方法和技術(shù)加以改進(jìn)。在此，我們應(yīng)用計(jì)算機(jī)技術(shù)與新藥設(shè)計(jì)、開發(fā)過程相結(jié) 合的計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)，通過虛擬篩選的方法獲得了新穎的具有NA抑制活性的化 合物一一鈣黃綠素，以此來尋找抑制流感NA，從而抑制流感病毒的新藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供鈣黃綠素在制備防治甲型流感病毒藥物中的應(yīng)用。鈣黃 綠素能夠有效的抑制神經(jīng)氨酸酶的活性，從而抑制流感病毒在體內(nèi)的繁殖，進(jìn)而減輕或治 愈流感患者。本發(fā)明對(duì)化合物鈣黃綠素對(duì)H1N1，H3N2,安徽H7N9 (野生型）和上海H7N9 (耐藥型）的神經(jīng)氨酸酶進(jìn)行了體外酶學(xué)抑制性的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其IC5。分別為54. 69± 11. 56， 48. 97±13. 59,59. 08±5. 37 ymol/L 和 38. 22±4. 26 ymol/L，我們又對(duì)這幾種流感病毒感 染MDCK細(xì)胞并加以此種化合物進(jìn)行了細(xì)胞存活率的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)此化合物均能提高病毒感 染后的細(xì)胞存活率。最后我們對(duì)此種化合物鈣黃綠素對(duì)流感小鼠模型的體重變化、致死率 及肺指數(shù)進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)鈣黃綠素能明顯緩解流感病毒對(duì)小鼠的癥狀。本發(fā)明為開發(fā)以 神經(jīng)氨酸酶為靶點(diǎn)的新藥提供基礎(chǔ)，為鈣黃綠素應(yīng)用于人類流感的治療提供了參考。
【附圖說明】
[0006] 圖1是不同濃度鈣黃綠素對(duì)H1N1，H3N2,安徽H7N9和上海H7N9流感病毒神經(jīng)氨 酸酶的抑制作用。
[0007] 圖2是不同濃度鈣黃綠素與H1N1，H3N2,安徽H7N9和上海H7N9共同作用后，混合 液對(duì)MDCK細(xì)胞的損傷作用。
[0008] 圖3是不同濃度鈣黃綠素對(duì)感染了 H1N1，H3N2,安徽H7N9和上海H7N9的MDCK細(xì) 胞的治療作用。
[0009] 圖4是不用濃度鈣黃綠素對(duì)感染了 HlNl流感病毒的小鼠體重的影響。
[0010] 圖5是不用濃度鈣黃綠素對(duì)感染了 H3N2流感病毒的小鼠體重的影響。
[0011] 圖6是不用濃度鈣黃綠素對(duì)感染了安徽H7N9流感病毒的小鼠體重的影響。
[0012] 圖7是不用濃度鈣黃綠素對(duì)感染了上海H7N9流感病毒的小鼠體重的影響。
[0013] 圖8是不用濃度鈣黃綠素對(duì)感染了 H1N1，H3N2,安徽H7N9和上海H7N9流感病毒 的小鼠肺中病毒載量的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 以下通過實(shí)例形式的【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0015] 實(shí)施例1。
[0016] 我們用含有甲型流感病毒的 HlNl (A/New Caledonia/20/1999)，H3N2 (A/ Fujian/411/2002)，含有重組野生型甲型流感病毒H7N9 (A/Anhui/1/2013)和耐藥型甲 型流感病毒H7N9 (A/Shanghai/1/2013)的神經(jīng)氨酸酶在pH 6.5 MES緩沖液（32.5mM) 中進(jìn)行配制，我們將49 y L的NA液及其與不同濃度的I y L鈣黃綠素的混合物加入到反應(yīng) 緩沖液中，在37°C孵箱中放置30min，然后加入50 y L 20剛MU-NANA底物緩沖液，在酶標(biāo) 儀上進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為360nm，發(fā)射波長(zhǎng)為450nm，檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)8min。檢測(cè)結(jié)果為，鈣黃 綠素對(duì)幾種流感病毒神經(jīng)氨酸酶的活性抑制一半時(shí)的濃度（ICm)分別為54. 69±11. 56， 48. 97±13. 59,59. 08±5. 37 ymol/L 和 38. 22±4. 26 ymol/L。
[0017] 實(shí)施例2。
[0018] 為了檢測(cè)鈣黃綠素在細(xì)胞水平的抗流感作用，我們用兩種不同的處理對(duì)其進(jìn)行 實(shí)驗(yàn)：首先將鈣黃綠素按濃度梯度稀釋成不同濃度，I將上述溶液與100 TCID5。的甲型 HlNl，H3N2,安徽H7N9和上海H7N9流感病毒等體積孵育2小時(shí)，總體積為200 y L。然后將 混合液加入到MDCK細(xì)胞中孵育2h ; II將100 TCID5。的甲型H1N1，H3N2,安徽H7N9和上海 H7N9流感病毒在MDCK細(xì)胞中孵育2小時(shí)，在加入不用濃度的鈣黃綠素孵育2小時(shí)。2種不 同處理稀釋液都用維持液（10 y g/ml胰酶的DMEM)。2小時(shí)后，換一次上述的維持液繼續(xù)培 養(yǎng)24小時(shí)。24小時(shí)后換含有2%血清的維持液，連續(xù)觀察2~3天，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞病變 效果。上述實(shí)驗(yàn)均在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)。
[0019]結(jié)果如圖2和圖3所示，在不同處理?xiàng)l件下，加入鈣黃綠素與流感病毒時(shí)，隨著鈣 黃綠素濃度的增加，細(xì)胞存活率也隨著增加。說明鈣黃綠素可以抑制流感病毒，保護(hù)MDCK 細(xì)胞免受病毒破壞，而且保護(hù)效應(yīng)也隨著鈣黃綠素濃度的增加呈現(xiàn)濃度依賴性。
[0020] 實(shí)施例3。
[0021] 為了檢測(cè)鈣黃綠素在小鼠流感模型中的保護(hù)作用，我們采用50yL IOLD5。的甲 型H1N1，H3N2,安徽H7N9和上海H7N9流感病毒滴鼻感染小鼠。實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為6組， 分別為NC組；10 LD5。組；10 LD 5Q+50mg/kg Tamif Iu組；鈣黃綠素低、中、高劑量組：10 LD5Q+50, 100, 200mg/kg鈣黃綠素。每組10只，病毒攻擊前1天開始給藥，均采用灌胃給藥 的方式，每天2次，連續(xù)7天，每只小鼠灌胃0.2ml。每天記錄小鼠生存狀態(tài)，體重變化。然 后在15天時(shí)，處死小鼠，記錄肺重，對(duì)肺組織研磨加入PBS，后測(cè)定其NA活性。
[0022] 結(jié)果如圖4、圖5、圖6和圖7所示，說明鈣黃綠素可以抑制流感感染小鼠體重的減 輕程度，改善小鼠的生存狀態(tài)，使小鼠逐漸恢復(fù)到健康水平。
[0023] 結(jié)果如下表所示，說明不同濃度的鈣黃綠素能顯著降低流感小鼠的肺指數(shù)。
[0024] 以上結(jié)果均說明，鈣黃綠素能對(duì)感染流感的小鼠起到治療的作用，使小鼠逐漸恢 復(fù)到健康水平。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 化合物鈣黃綠素在防治甲型流感藥物中的應(yīng)用。2. 如權(quán)利要求1中鈣黃綠素以作為單一成分在防治甲型流感藥物的應(yīng)用。3. 如權(quán)利要求1中鈣黃綠素以作為復(fù)方藥物中的一種成分在防治甲型流感藥物的應(yīng) 用。4. 如權(quán)利要求1中鈣黃綠素以口服給藥方式的應(yīng)用。5. 如權(quán)利要求1中鈣黃綠素以注射給藥方式的應(yīng)用。6. 如權(quán)利要求1中鈣黃綠素以噴霧吸入方式的應(yīng)用。
【專利摘要】鈣黃綠素在制備甲型流感病毒藥物中的應(yīng)用，屬于藥物應(yīng)用領(lǐng)域，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)施的：首先將鈣黃綠素與取自H1N1，H3N2，安徽H7N9和上海H7N9病毒的神經(jīng)氨酸酶液在37℃培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，然后加入熒光底物緩沖溶液進(jìn)行檢測(cè)，隨后發(fā)現(xiàn)鈣黃綠素對(duì)這幾種流感病毒的神經(jīng)氨酸酶均有抑制作用，然后我們檢測(cè)了鈣黃綠素在細(xì)胞水平上的抗甲型流感病毒的作用，發(fā)現(xiàn)鈣黃綠素也能對(duì)感染甲型流感病毒的細(xì)胞起到防治作用，最后，我們檢測(cè)了鈣黃綠素對(duì)小鼠流感模型的影響，發(fā)現(xiàn)加入鈣黃綠素后，可以明顯抑制甲型流感病毒感染小鼠體重的減輕程度，使小鼠逐漸恢復(fù)到健康水平，并且能顯著降低流感小鼠的肺指數(shù)。
【IPC分類】A61K31/365, A61P31/16
【公開號(hào)】CN105193785
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510723092
【發(fā)明人】王燁, 房學(xué)迅, 于淼, 于大海, 王溪竹
【申請(qǐng)人】王燁
【公開日】2015年12月30日
【申請(qǐng)日】2015年10月29日