生產(chǎn)二酮基哌嗪和含有二酮基哌嗪的組合物的方法
【專利說明】生產(chǎn)二鋼基脈睫和含有二鋼基脈睫的組合物的方法
[0001] 本申請(qǐng)請(qǐng)求保護(hù)于2013年2月1日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/759, 922的優(yōu)先權(quán) 權(quán)益，將其全部內(nèi)容引入本文作為參考。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本文提供了生產(chǎn)二酬基贓嗦，例如天冬氨酸-丙氨酸二酬基贓嗦值A(chǔ)-DKP)的方 法，包括采用膚酶（例如二膚基膚酶IV值PP-IV))的方法。還提供了用于制備蛋白質(zhì)和膚 的藥物組合物的方法，其提高了二酬基贓嗦在該組合物中的含量。此外，提供了用于處理含 二酬基贓嗦和白蛋白的物流的方法，W生產(chǎn)治療用途的二酬基贓嗦組合物和純化的白蛋白 組合物。除了包含低白蛋白含量的第一治療性的二酬基贓嗦組合物，還可生產(chǎn)W高白蛋白 濃度為特征的第二治療性組合物。
【背景技術(shù)】
[0003] 白蛋白是可溶的、單體的、球狀蛋白（分子量約66kDa)且其是在哺乳動(dòng)物血漿中 發(fā)現(xiàn)的最豐富的蛋白質(zhì)，其W0. 03-0. 05克/毫升的正常濃度范圍存在。白蛋白在屯、血管 系統(tǒng)中起著多種重要的作用，包括維持血液滲透壓。高濃度的白蛋白通過從周圍組織的細(xì) 胞內(nèi)間隙轉(zhuǎn)移液體至血管內(nèi)系統(tǒng)，導(dǎo)致血漿容積膨脹。此外，白蛋白作為遞送類固醇激素、 血晶素和脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮作用。白蛋白還有助于維持血液抑并參與凝血途徑。
[0004] 由于運(yùn)些基本功能，血流中正常白蛋白濃度對(duì)維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。血液白蛋 白濃度的降低或增高均可造成嚴(yán)重的健康問題。血液中低白蛋白濃度，低白蛋白血癥，可由 W下疾病所導(dǎo)致，例如肝功能不全和腎功能異常，W及創(chuàng)傷、重度燒傷和敗血病。已證明從 白蛋白治療中獲益的其他病癥包括，但不限于，營養(yǎng)不良，饑餓，腎病綜合征，膜腺炎和腹膜 炎。出于該原因，含有己氏滅菌的白蛋白的溶液通常在手術(shù)室和緊急醫(yī)療處理情況下作為 復(fù)蘇液施用。
[0005] 用于危重疾病中的市售人血清白蛋白化SA)溶液有時(shí)是在特定情況下，例如燒 傷、急性肺損傷（ALI)和休克用于恢復(fù)血容量。對(duì)于運(yùn)些病人而言，HSA給藥是有爭議的， 最新證據(jù)表明，與更便宜的替代品，例如鹽水相比，死亡率充其量是沒有減少而已。此外，市 售HSA溶液的異質(zhì)性已經(jīng)被證明并包括HSA分子的氧化和截?cái)唷Ｔ谑惺跦SA溶液的加工和 儲(chǔ)存過程中，該蛋白質(zhì)截?cái)喟l(fā)生在該蛋白質(zhì)的N端并導(dǎo)致HSA的前兩個(gè)氨基酸，Asp-Ala的 裂解。由于HSA的N端特有的性質(zhì)，運(yùn)個(gè)二膚還被轉(zhuǎn)化成環(huán)狀二膚，稱其為天冬氨酸-丙氨 酸二酬基贓嗦值A(chǔ)-DKP)，也稱為3-甲基-2, 5-二酬基贓嗦-6-乙酸。已發(fā)現(xiàn)，DA-DKP大量 存在于市售的HSA溶液中，且DA-DKP本身對(duì)體外的活化PBMC和T淋己細(xì)胞具有免疫抑制 作用。
[0006] 由HSA形成DA-DKP的機(jī)理目前尚不清楚，但是N端的自發(fā)降解和/或設(shè)及膚酶 的酶促反應(yīng)在理論上可能起著作用。二膚基膚酶IV值PP-IV)，也稱為腺巧脫氨酶絡(luò)合蛋白 質(zhì)2或CD26 (分化簇26)，是一種膚酶，其優(yōu)選地從蛋白質(zhì)的N端裂解Xaa-Pro和Xaa-Ala 二膚。據(jù)報(bào)道，DPP-IV在免疫和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞表面W及在可溶形式的血清中具有活性。 DPP-IV的主要功能被認(rèn)為是修飾生物活性膚、細(xì)胞因子和其他細(xì)胞表面蛋白質(zhì)，用于調(diào)節(jié) 免疫反應(yīng)和細(xì)胞分化。此外，已經(jīng)闡明了一個(gè)新的機(jī)理，其設(shè)及DPP-IV介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì) 巧CM)的降解，從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞侵入到成膠基質(zhì)中。
[0007] DKP已經(jīng)顯示出具有其自身獨(dú)特的治療用途，包括有治療人自身免疫疾病的潛 力。例如，DA-DKP已經(jīng)顯示出對(duì)活化的外周血單核細(xì)胞和T淋己細(xì)胞具有顯著的免疫 抑制作用。關(guān)于HSA、DA-DKPW及與其有關(guān)的治療性治療的其他公開可見于美國專利號(hào) 6, 555, 543 ;美國專利號(hào)7, 732, 403和美國專利申請(qǐng)?zhí)朥S2013-0090292A1，其全部內(nèi)容引 入本文作為參考。
[0008] 因此，考慮到DKP用于治療人自身免疫和其他病癥中的潛在治療用途W(wǎng)及白蛋白 在治療低白蛋白血癥、血容量不足和各種其他病癥中的重要性，因此需要高品質(zhì)的治療性 DKP組合物和高品質(zhì)的白蛋白復(fù)蘇液。本公開內(nèi)容設(shè)及W有效、高產(chǎn)率的操作生產(chǎn)運(yùn)兩種治 療組合物的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 市售的人血清白蛋白化SA)的施用有可能被指定的用于患者，例如多重創(chuàng)傷患 者。由于其異質(zhì)性，其他組分（例如蛋白酶）可促成市售HSA的治療效果。一種運(yùn)樣的蛋白 酶（二膚基膚酶IV值PP-IV))可從白蛋白的N端釋放已知的免疫調(diào)節(jié)分子，天冬氨酸-丙 氨酸二酬基贓嗦值A(chǔ)-DKP)。例如，通過科恩分級(jí)分離法制備的市售HSA溶液顯示出具有 DPP-IV活性。
[0010] 本公開的一個(gè)方面是生產(chǎn)DKP，例如DA-DKP。在一個(gè)實(shí)施方案中，DA-DKP在DPP-IV 的存在下由白蛋白生產(chǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述DPP-IV是內(nèi)源性的，例如在人血漿或 HSA中。在一個(gè)實(shí)施方案中，血漿或HSA被加熱。盡管不希望受到理論的束縛，但認(rèn)為所述 加熱可通過提高該溶液的溫度使更接近DPP-IV活性的最佳溫度和/或通過熱降解來提高 DPP-IV的濃度。
[0011] 本公開的另一方面是處理包含白蛋白和DKP(例如DA-DKP)的進(jìn)樣流W生產(chǎn)組合 物的方法，該方法包括加工該進(jìn)樣流W生產(chǎn)第一白蛋白缺乏流和第一白蛋白富集流，其中 所述第一白蛋白缺乏流包含存在于進(jìn)樣流中的DKP的第一部分，而第一白蛋白富集流包含 存在于進(jìn)樣流中的DKP的第二部分。將第一白蛋白富集流反應(yīng)W生產(chǎn)額外的DKP，從而導(dǎo)致 包含白蛋白和DKP的反應(yīng)流。將該反應(yīng)流處理W生產(chǎn)第二白蛋白缺乏流和第二白蛋白富集 流，其中所述第二白蛋白缺乏流包含存在于該反應(yīng)流中的DKP的一部分，而該第二白蛋白 富集流包含存在于該反應(yīng)流中的DKP的第二部分。
[0012] 在本公開的一些實(shí)施方案中，所生產(chǎn)的白蛋白富集流可具有治療價(jià)值，包括但不 限于，在治療低白蛋白血癥和血容量不足中的作用。在本公開的一些實(shí)施方案中，所生產(chǎn)的 缺乏白蛋白、含DKP的物流可具有治療價(jià)值，包括但不限于，在治療炎性病癥中的作用。
[0013] 本公開的另一方面，如上所述，是處理包含白蛋白和DKP的進(jìn)樣流W生產(chǎn)治療性 組合物的方法，還包括分析步驟，其中該分析步驟包括分析白蛋白富集流W得到至少一個(gè) 度量，將所述至少一個(gè)度量與至少一個(gè)參考值相比較，其中當(dāng)所述至少一個(gè)度量大于或小 于該參考值時(shí)，重復(fù)該反應(yīng)和加工步驟直至隨后的白蛋白富集流的所述至少一個(gè)度量不大 于或大于所述至少一個(gè)參考值。例如，該度量可W是該物流中白蛋白的量或DA-DKP的量。
[0014] 本公開的另一方面是包含DKP的組合物，其含有比市售的人血清白蛋白（"HSA") 審IJ劑中白蛋白的濃度要小的白蛋白，所述市售制劑中白蛋白的濃度為在5重量％白蛋白溶 液中每升HSA約50克白蛋白（g/L)或在25重量％白蛋白溶液中約250g/L。在本公開的 一些實(shí)施方案中，白蛋白在含DKP的組合物中的濃度可小于約250g/L、小于約200g/L、小于 約lOOg/L、小于約50g/l、小于約40g/l、小于約30g/l、小于約20g/l、小于約lOg/L小于約 5邑/1、小于約4g/l、小于約3g/l、小于約2g/l、小于約Ig/l、小于約0. 9g/l、小于約0.Sg/ L小于約0. 7g/l、小于約0. 6g/l、小于約0. 5g/l、小于約0. 4g/l、小于約0. 3g/l、小于約 0. 2g/l、小于約0.Ig/l、小于約0. 09g/l、小于約0. 08g/l、小于約0. 07g/l、小于約0. 06g/ L小于約0. 05g/l、小于約0. 04g/l、小于約0. 03g/l、小于約0. 02g/l、小于約.Olg/l、小于 約.009g/l、小于約.008g/l、小于約.007g/l、小于約.006g/L或小于約.005g/L。在本公 開的另一實(shí)施方案中，白蛋白在含DKP組合物中的濃度可為約0邑/1，或不能檢測(cè)量。
[0015] 在本公開的一些實(shí)施方案中，包含DKP的組合物可具有治療價(jià)值，包括但不限于， 在治療炎性病癥中的作用。
[0016] 此外，本公開提供了合成DKP的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括在有效導(dǎo) 致DKP形成的條件下，加熱哺乳動(dòng)物血漿。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括將血漿與酶接 觸，所述酶在有效生產(chǎn)DKP的條件下裂解蛋白質(zhì)或膚的兩個(gè)N端氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案 中，該方法包括將血漿與DPP-IV接觸，所述DPP-IV在有效生產(chǎn)DA-DKP的條件下裂解蛋白 質(zhì)或膚的兩個(gè)N端氨基酸。
[0017] 本公開還提供制備蛋白質(zhì)或膚的改進(jìn)的藥物組合物的方法。該方法包括處理血漿 W增加DKP(例如DA-DKP)在蛋白質(zhì)或膚的藥物組合物中的含量。
[0018] 本公開還提供了改進(jìn)的蛋白質(zhì)或膚的藥物組合物。該改進(jìn)是，所述組合物包含增 加量的DKP。
[0019] 上述內(nèi)容是簡要的概述W提供對(duì)本文所公開的方面、實(shí)施方案和結(jié)構(gòu)的初步理 解。運(yùn)個(gè)概述既不是本文的方面、實(shí)施方案和結(jié)構(gòu)的廣泛概述也不是詳盡的概述。其既不 旨在確定關(guān)鍵或重要原理，也不是描述該方面、實(shí)施方案或結(jié)構(gòu)的范圍，而是W簡化形式呈 現(xiàn)所選概念，用W引入下文更加詳盡的描述?？蒞理解，其他方面、實(shí)施方案和結(jié)構(gòu)可能參 與，單獨(dú)或組合，一或多個(gè)上述或下文詳述的特征。
【附圖說明】
[0020] 附圖被并入并形成說明書的一部分用W說明W下實(shí)例，即所述方面、實(shí)施方案或 結(jié)構(gòu)如果制成并使用且不應(yīng)被理解為限制該方面、實(shí)施方案或結(jié)構(gòu)僅為所說明和描述的實(shí) 施例。其他特征和優(yōu)勢(shì)將通過下面更詳盡的各個(gè)方面、實(shí)施方案或結(jié)構(gòu)的說明變得顯而易 見。
[002。 圖1表明在5%市售HSA溶液中的DPP-IV活性。DPP-IV活性（N= 3)表示為：在 37°C培養(yǎng)24小時(shí)的過程中，所產(chǎn)生的對(duì)硝基苯胺（pNA，iiM)的總量。使用DPP-IV抑制劑 (抑二膚素A，diprotinA)導(dǎo)致完全抑制DPP-IV的活性（數(shù)據(jù)未顯示）。
[002引圖2表明溫度對(duì)在5%市售服A的溶液攸L Be虹ing)中的DPP-IV活性的影響。DPP-IV活性（N=3)表示為：在37°C(實(shí)屯、柱）和60°C(垂直線）培養(yǎng)2小時(shí)的過程中， 所產(chǎn)生的對(duì)硝基苯胺（pNA，iiM)的總量。
[002引圖3表明在通過不同制備方法生產(chǎn)的服A溶液中的DPP-IV活性。DPP-IV活性(N= 3)表示為：在37°C培養(yǎng)24小時(shí)的過程中，所產(chǎn)生的對(duì)硝基苯胺（pNA，iiM)的總量。 DPP-IV活性是在使用科恩分級(jí)分離法制成的市售服A溶液中（實(shí)屯、棒，地SA)W及在水稻 中制成的重組HSA溶液中（垂直線，rHSA)測(cè)定的。
[0024] 圖4表明在W60°C加熱的5 %市售服A中制成的DA-DKP。DA-DKP的生產(chǎn)（N= 3) 是在W60°C加熱的5%市售HSA中的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定的，其存在（▲)或不存在（)DPP-IV抑制劑。分離5%市售服A溶液的低分子量部分（<5kDa)并用LCMS分析DA-DKP含 量。星號(hào)（*)代表相比于凈（neat) 5%HSA的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（p<0. 05)。
[00巧]圖5表明本公開的一個(gè)實(shí)施方案，包括兩個(gè)加工步驟和一個(gè)反應(yīng)步驟，其產(chǎn)生兩 個(gè)單獨(dú)的含DKP的產(chǎn)物流和一個(gè)含白蛋白的產(chǎn)物流。
[0026] 圖6表明本公開的一個(gè)實(shí)施方案，類似于圖5,包含含白蛋白的再循環(huán)流。
[0027] 圖7表明本公開的實(shí)施方案，類似于圖5,包含在第二加工步驟過程中協(xié)助DKP回 收的稀釋流。
[002引 參考數(shù)碼
[0029] 往-組么
[0030] 100 -加工步驟
[003U 110 -反應(yīng)步驟
[0032] 120 -進(jìn)樣流
[0033] 130 -白蛋白富集流
[0034] 140 -白蛋白缺乏流
[00對(duì) 150 -酶或催化劑
[0036] 160 -最終白蛋白富集產(chǎn)物流
[0037] 170 -白蛋白富集再循環(huán)流
[0038] 180 -稀釋流
[0039] 連施方案描沐
[0040]W下詳細(xì)說明是通過舉例而非限定來介紹本發(fā)明的。該描述將清楚地使本領(lǐng)域技 術(shù)人員能夠?qū)嵤┎⑹褂帽景l(fā)明。
[0041] 對(duì)于說明書中的"一個(gè)實(shí)施方案"、"實(shí)施方案""示例實(shí)施方案"等，指的是，所述 實(shí)施方案可包括特定的特征、結(jié)構(gòu)或特性，但每個(gè)實(shí)施方案不一定包括該特定的特征、結(jié)構(gòu) 或特性。此外，該短語不一定指的是同一實(shí)施方案。此外，當(dāng)特定的特征、結(jié)構(gòu)或特性結(jié)合 實(shí)施方案進(jìn)行描述時(shí)，應(yīng)認(rèn)為，無論是否進(jìn)行了明確闡述，將該特征、結(jié)構(gòu)或特性與其他實(shí) 施方案組合是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)的。
[0042] 如本文所用至少一個(gè)"、"一個(gè)或多個(gè)"和"和/或"是開放式表述，其在操作時(shí)既 可W是結(jié)合的也可W是分開的。例如，W下各表述"A、B和C中至少一個(gè)"、"A、B或C中至 少一個(gè)"、"A、B和C中的一個(gè)或多個(gè)"、"A、B或C中的一個(gè)或多個(gè)"和"A、B和/或C"是指 單獨(dú)的A、單獨(dú)的B、單獨(dú)的C、A和B-起、A和C一起、B和C一起，或A、B和C一起。
[0043] 人血清白蛋白化SA)是最豐富的循環(huán)蛋白質(zhì)，其具有與配體結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)性質(zhì)、抗 氧化功能和酶活性。因?yàn)镠SA在調(diào)控危重疾病中的血容量和滲透壓中非常重要，因此在制 藥工業(yè)上大量的