一種天然多糖基水凝膠及制備和在眼結(jié)膜修復(fù)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織工程領(lǐng)域，特別涉及一種化學(xué)交聯(lián)的天然多糖基可注射用水凝膠及其制備方法和在組織工程材料中，特別是眼結(jié)膜修復(fù)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)膜是眼表的重要組成部分，處于眼球的表面，直接與外界接觸，很容易受到各種外傷，如眼部酸、堿等化學(xué)傷或熱燒傷等。對(duì)于這些缺乏正常結(jié)膜組織的疾病，臨床上還缺乏有效的治療手段。目前常用的治療方法是用正常的結(jié)膜或結(jié)膜替代物進(jìn)行結(jié)膜重建，包括自體結(jié)膜移植、唇粘膜移植、羊膜移植、異體結(jié)膜移植等。但由于可用于移植的自體結(jié)膜有限，且具有良好組織配型的異體結(jié)膜的獲得相當(dāng)困難，而羊膜作為一種生物膜僅提供上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境而不能提供上皮細(xì)胞，無(wú)法真正替代結(jié)膜，故對(duì)于大面積結(jié)膜缺損很難恢復(fù)理想的結(jié)構(gòu)與功能。
[0003]天然多糖材料如甲殼素、殼聚糖及其衍生物、透明質(zhì)酸及其衍生物、海藻酸鈉及其衍生物等多糖是自然界中生物復(fù)合體中主要的有機(jī)成分，來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，且這些材料由于具有良好的生物相容性和生物可降解性等在組織工程研宄中受到眾多研宄者的青睞，因此以天然多糖材料為原料進(jìn)行組織工程結(jié)膜研宄是模擬天然組織的有效方法。
[0004]近年來(lái)，可注射水凝膠因其所具有的類細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)、載細(xì)胞的能力、物理性能易調(diào)控、可微創(chuàng)植入并原位成型等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了深入的研宄，但其用于眼表重建的研宄則相對(duì)較少，主要是在藥物緩釋、基因載體、軟骨修復(fù)等方面有廣泛的應(yīng)用。目前使用得較多的可注射水凝膠制備方法主要為紫外光引發(fā)交聯(lián)或引入化學(xué)交聯(lián)劑，如公開(kāi)號(hào)為CN103524795A的專利申請(qǐng)中，該溫敏型可注射殼聚糖水凝膠產(chǎn)品需引入京尼平交聯(lián)劑；公開(kāi)號(hào)為CN103937014A的專利申請(qǐng)中，該殼聚糖雙網(wǎng)絡(luò)可注射水凝膠需引入雙醛類化合物或雙環(huán)氧類化合物為交聯(lián)劑制備而成。但是，無(wú)論是紫外光交聯(lián)(光引發(fā)劑)或引入化學(xué)交聯(lián)劑，都會(huì)對(duì)細(xì)胞有一定的潛在毒性影響。而物理交聯(lián)的可注射水凝膠回復(fù)性差，且力學(xué)強(qiáng)度差，不適于手術(shù)操作。因此，為了減少對(duì)正常組織的損害，解決結(jié)膜移植材料短缺及免疫排斥反應(yīng)等難題，開(kāi)發(fā)一種原料來(lái)源充分、容易操作、低免疫原性或無(wú)免疫原性的新型組織工程支架材料，再配以合適的種子細(xì)胞，以期能夠定向誘導(dǎo)分化為正常的結(jié)膜上皮用于眼表重建是當(dāng)今眼科醫(yī)學(xué)材料發(fā)展的重要方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種化學(xué)交聯(lián)的天然多糖基可注射用水凝膠。本發(fā)明的水凝膠來(lái)源豐富、操作簡(jiǎn)便、凝膠時(shí)間短，反應(yīng)條件溫和、凝膠性能可控，可在人體生理?xiàng)l件下進(jìn)行且無(wú)需其他化學(xué)交聯(lián)劑即可實(shí)現(xiàn)凝膠化。且本發(fā)明水凝膠還可含有種子細(xì)胞、生長(zhǎng)因子或藥物等。
[0006]本發(fā)明另一目的在于提供一種上述化學(xué)交聯(lián)的天然多糖基可注射用水凝膠的制備方法。該制備方法以改性天然多糖為原料，通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)，利用不同的官能團(tuán)摩爾比及凝膠前驅(qū)液濃度，控制凝膠的溶脹率、強(qiáng)度、降解速率等，制備得到凝膠性能可控的水凝膠。
[0007]本發(fā)明再一目的在于提供上述化學(xué)交聯(lián)的天然多糖基可注射用水凝膠在組織工程材料中的應(yīng)用，特別適用于眼結(jié)膜修復(fù)中。
[0008]本發(fā)明的目的通過(guò)下述方案實(shí)現(xiàn):
[0009]一種化學(xué)交聯(lián)的天然多糖基可注射用水凝膠，由包含以下步驟的方法得到:
[0010]將?；烊欢嗵遣牧纤芤杭尤霂€基化天然多糖材料水溶液中，混合均勻，加入β -甘油磷酸鈉溶液調(diào)節(jié)PH至中性，37°C孵育，得到化學(xué)交聯(lián)的天然多糖基可注射用水凝膠。
[0011]所述的酰化天然多糖材料可為馬來(lái)?；瘹ぞ厶?、馬來(lái)?；瘹す烟?、衣康酰化殼聚糖和衣康?；细示厶侵械闹辽僖环N，優(yōu)選為馬來(lái)?；瘹ぞ厶?、馬來(lái)?；瘹す烟呛鸵驴吊；瘹ぞ厶侵械闹辽僖环N。
[0012]所述的馬來(lái)?；瘹す烟怯神R來(lái)酸酐與殼寡糖反應(yīng)得到。
[0013]所述的衣康?；瘹ぞ厶怯梢驴邓狒c殼聚糖反應(yīng)得到。
[0014]所述的衣康?；细示厶且驴邓狒c葡甘聚糖反應(yīng)得到。
[0015]所述的巰基化天然多糖材料可為巰基化透明質(zhì)酸、巰基化海藻酸鈉、巰基化殼聚糖和巰基化硫酸軟骨素中的至少一種，優(yōu)選為巰基化透明質(zhì)酸、巰基化海藻酸鈉和巰基化殼聚糖中的至少一種。
[0016]所用?；烊欢嗵遣牧虾蛶€基化天然多糖材料的量以雙鍵與巰基官能團(tuán)摩爾比為準(zhǔn)，可為4:1?1:4，優(yōu)選為2:1?1:2。
[0017]所述的?；烊欢嗵遣牧纤芤旱臐舛瓤蔀?.1?5g/100mL，優(yōu)選為0.375?1.5g/100mLo
[0018]所述的巰基化天然多糖材料水溶液的濃度可為I?6g/100mL，優(yōu)選為2?4g/100mLo
[0019]所用β -甘油磷酸鈉溶液的濃度可為30?58g/100mL，優(yōu)選為45?58g/100mL。
[0020]所述孵育的時(shí)間可為0.25?24h，優(yōu)選為24h。所述孵育優(yōu)選在恒溫水浴箱中進(jìn)行。
[0021]本發(fā)明所述?；烊欢嗵遣牧纤芤汉蛶€基化天然多糖材料水溶液通過(guò)將酰化天然多糖材料或巰基化天然多糖材料加入水中溶解得到。
[0022]所述將?；烊欢嗵遣牧纤芤杭尤霂€基化天然多糖材料水溶液中優(yōu)選在攪拌下進(jìn)行。
[0023]所述加入β -甘油磷酸鈉溶液調(diào)節(jié)pH優(yōu)選在攪拌下逐滴加入。
[0024]所述的酰化天然多糖材料水溶液和/或所述的巰基化天然多糖材料水溶液還可包含有種子細(xì)胞、生長(zhǎng)因子和藥物等中的至少一種。
[0025]本發(fā)明所述的化學(xué)交聯(lián)的天然多糖基可注射用水凝膠還可包含有種子細(xì)胞、生長(zhǎng)因子和藥物中的至少一種。
[0026]本發(fā)明制備方法以改性天然多糖為原料，酰化天然多糖材料和巰基化天然多糖材料，通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)，利用不同的官能團(tuán)摩爾比及溶液濃度，控制凝膠的溶脹率、強(qiáng)度、降解速率等，制備得到凝膠性能可控的水凝膠。本發(fā)明的水凝膠來(lái)源豐富、操作簡(jiǎn)便、凝膠時(shí)間短，反應(yīng)條件溫和、凝膠性能可控，可在人體生理?xiàng)l件下進(jìn)行且無(wú)需其他化學(xué)交聯(lián)劑即可實(shí)現(xiàn)凝膠化。且該水凝膠具有促進(jìn)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的雙重特性可有效保護(hù)手術(shù)創(chuàng)面，減少手術(shù)創(chuàng)面出血，具有消炎抗菌作用，促進(jìn)傷口愈合，可應(yīng)用作為組織工程材料，特別適用于眼結(jié)膜修復(fù)中，具有可注射性，且反應(yīng)迅速、可在5?15min內(nèi)凝膠化，原位成型、手術(shù)操作性強(qiáng)、手術(shù)過(guò)程中自動(dòng)粘合，無(wú)需縫合固定，對(duì)任何形狀、位置的創(chuàng)面都可有效的保護(hù)。
[0027]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
[0028](I)本發(fā)明的化學(xué)交聯(lián)的天然多糖基可注射用水凝膠制備反應(yīng)體系條件溫和、容易操作和控制；
[0029](3)本發(fā)明的化學(xué)交聯(lián)的天然多糖基可注射用水凝膠原料來(lái)源豐富，成本低；
[0030](4)本發(fā)明的化學(xué)交聯(lián)的天然多糖基可注射用水凝膠可利用不同的官能團(tuán)摩爾比及溶液濃度，控制凝膠的溶脹率、強(qiáng)度、降解速率等，制備得到凝膠性能可控的水凝膠；
[0031](5)本發(fā)明的化學(xué)交聯(lián)的天然多糖基可注射用水凝膠具有促進(jìn)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的雙重特性可有效保護(hù)手術(shù)創(chuàng)面，減少手術(shù)創(chuàng)面出血，且具有消炎抗菌作用，促進(jìn)傷口愈合。
[0032](6)本發(fā)明的化學(xué)交聯(lián)的天然多糖基可注射用水凝膠反應(yīng)迅速，原位成型，手術(shù)操作性強(qiáng)，手術(shù)過(guò)程中可以自動(dòng)粘合，無(wú)需縫合固定，對(duì)任何形狀、位置的創(chuàng)面都可有效的保護(hù)。
【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1為實(shí)施例1的馬來(lái)?；瘹ぞ厶?巰基化透明質(zhì)酸可注射水凝膠的凝膠過(guò)程示意圖。其中，(a)為凝膠化前；(b)為凝膠化后。
[0034]圖2為實(shí)施例1的馬來(lái)?；瘹ぞ厶?巰基化透明質(zhì)酸可注射水凝膠的凝膠原理示意圖。
[0035]圖3為實(shí)施例1的馬來(lái)?；瘹ぞ厶?巰基化透明質(zhì)酸可注射水凝膠的微觀掃描電鏡圖。其中，(a)凝膠表面；(b)為凝膠斷面。
[0036]圖4為實(shí)施例1制備的馬來(lái)酰化殼聚糖/巰基化透明質(zhì)酸可注射水凝膠于37°C凝膠過(guò)程中的流變學(xué)分析。其中，(a)為巰基與雙鍵官能團(tuán)摩爾比為1:1，T = 37°C時(shí)的凝膠化過(guò)程；(b)為巰基與雙鍵官能團(tuán)不同摩爾比時(shí)的儲(chǔ)存模量分析圖。
[0037]圖5為在實(shí)施例2的馬來(lái)酰化殼寡糖/巰基化透明質(zhì)酸可注射水凝膠薄膜上培養(yǎng)人羊膜上皮細(xì)胞的倒置顯微鏡圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0039]實(shí)施例1:馬來(lái)?；瘹ぞ厶?巰基化透明質(zhì)酸可注射水凝膠的制備
[0040]將0.4g巰基化透明質(zhì)酸加入1mL去離子水中，充分溶解后得到巰基化透明質(zhì)酸質(zhì)量體積比為0.04g/mL的A液；將0.15g馬來(lái)酰化殼聚糖加入1mL去離子水中，充分溶解后得到馬來(lái)?；瘹ぞ厶琴|(zhì)量體積比為0.015g/mL的B液；在磁力攪拌下將等體積的B液緩慢倒入A液中，混合均勻；混合液在室溫下磁力攪拌下逐滴加入58wt.%的β -甘油磷酸鈉溶液調(diào)節(jié)PH至7，然后于37°C恒溫水浴箱中孵育處理24h成淡黃色透明凝膠。對(duì)所制備的馬來(lái)?；瘹ぞ厶?巰基化透明質(zhì)酸可注射水凝膠進(jìn)行測(cè)試與分析。通過(guò)采用倒置小瓶的方法測(cè)得凝膠時(shí)間為15min，凝膠過(guò)程示意圖如圖1，原理圖見(jiàn)圖2 ;凝膠凍干后的樣品進(jìn)行掃描電鏡觀察，如圖3，可見(jiàn)表面為一層薄聚合物層，這可能是由于凍干過(guò)程中引起的表面孔隙的塌陷，斷面可見(jiàn)凝膠內(nèi)部為相互貫穿的多孔結(jié)構(gòu)，有利于細(xì)胞迀移、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳輸及代謝產(chǎn)物的排出。流變學(xué)分析，如圖4，可見(jiàn)凝膠點(diǎn)約在670s (儲(chǔ)存模量大于損耗模量)，凝膠點(diǎn)及儲(chǔ)存模量與前驅(qū)體濃度及官能團(tuán)摩爾比有關(guān)。
[0041]實(shí)施例2:馬來(lái)?；瘹す烟?巰基化透明