注射 至遞送部位，例如使用注射器或者通過導(dǎo)管或中心靜脈導(dǎo)線。
[0224] 選擇用于治療配制物的施用方案取決于幾個(gè)因素，包括該實(shí)體的血清或組織周 轉(zhuǎn)率、癥狀的水平、以及該實(shí)體的免疫原性。優(yōu)選地，施用方案將遞送至患者的治療化合物 的量最大化并與可接受的水平的副作用相協(xié)調(diào)。因此，所遞送的配制物的量部分取決于特 定的實(shí)體以及要治療的病癥的嚴(yán)重性。
[0225] 在一個(gè)實(shí)例中，源自STRO-Γ細(xì)胞的上清液或可溶因子、STRO-I +細(xì)胞或其后代被 作為單一的丸劑遞送。或者，源自STRO-Γ細(xì)胞的上清液或可溶因子、STRO-I+細(xì)胞或其后 代通過連續(xù)的灌輸而施用，或者通過例如1天、1周、或每周1-7次的間隔來給藥。優(yōu)選的 給藥方案涉及避免了顯著的不期望副作用的最大劑量或給藥頻率。每周的總劑量取決于所 使用化合物的類型和活性。適當(dāng)?shù)膭┝坑膳R床醫(yī)師確定，例如，使用本領(lǐng)域中已知或者懷 疑會影響治療或者預(yù)計(jì)會影響治療的參數(shù)。通常，以稍低于最佳劑量的劑量開始，之后以 小的增量增加直至達(dá)到期望的效果或者相對于任何負(fù)面的副作用的最佳效果。重要的診斷 量度包括糖尿病癥狀的那些。
[0226] 根據(jù)本發(fā)明用于治療或延緩胰功能異常的進(jìn)展的實(shí)例，優(yōu)選在對病癥的診斷后 施用STRO-Γ細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因子，例如使用本領(lǐng)域已知的標(biāo) 準(zhǔn)方法和/或本文所述的方法來診斷，例如葡萄糖耐受。
[0227] 對于那些用于預(yù)防或延緩胰功能異常的發(fā)作的實(shí)例，優(yōu)選在病癥的臨床診斷前 施用STRO-Γ細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或源自其的可溶因子，例如，當(dāng)對象患有受損葡 萄糖耐受和/或受損的禁食糖血時(shí)，和/或在自身免應(yīng)答之前的或伴有自身免應(yīng)答的I型 糖尿病的情況，如由T細(xì)胞群體和/或B細(xì)胞群體的擴(kuò)展所指示出的和/或由自身抗體的 產(chǎn)生所指示出的（例如，在I型糖尿病的發(fā)作或進(jìn)展中針對胰β-胰島細(xì)胞的細(xì)胞毒T細(xì) 胞的擴(kuò)展和/或針對一或多種胰β_胰島細(xì)胞標(biāo)記物的自身抗體的擴(kuò)展）。用于對自身免 疫應(yīng)答的發(fā)作進(jìn)行確定或預(yù)測的方法對技術(shù)人員來說是顯見的和/或在本文中有描述。例 如，檢測到針對源自胰β-細(xì)胞或在胰β-細(xì)胞表面的抗原自身抗體，表明了對象針對所 述細(xì)胞的免疫應(yīng)答。一種此類測定檢測對象血清中的胰島細(xì)胞抗體。此測定包括使含有胰 島細(xì)胞的胰的切片接觸來自測試對象的血清。繼而用結(jié)合人免疫球蛋白的經(jīng)標(biāo)記的二抗來 檢測來自對象的血清中的免疫球蛋白（其能夠結(jié)合胰β_胰島細(xì)胞）。用于檢測胰島細(xì)胞抗 體的適宜的方法（其中使用熒光標(biāo)記物）在例如Bottazzo et al，Lancet 2:1279-83,1974 中有描述。作為選擇，或者此外，使用測定法來檢測結(jié)合對象中特定抗原的自身抗體。舉 例來說，Brooking et al. (Clin Chim Acta 331:55-59, 2003)描述了基于ELISA的測定法， 用于檢測針對GAD65的自身抗體。所描述的測定法在微量滴定平板上使用低濃度的GAD抗 原以捕獲樣品中的自身抗體。加入液態(tài)的生物素化GAD并且其被自身抗體的第二結(jié)合位點(diǎn) 所捕獲，而且被檢測到產(chǎn)生非同位素的可探測信號的是經(jīng)生物素化的GAD65。Nagata et al, Ann. New York Acad. Sci 1037:10-15, 2004描述了 ELISP0T測定法，其可用于檢測針對 胰島素、IA-2和GAD65的自身抗體的存在。
[0228] 用于監(jiān)測治療/預(yù)防的方法
[0229] 用于監(jiān)測治療/預(yù)防的方法在本說明書的基礎(chǔ)上對于技術(shù)人員來說將會是很顯 然的。例如，血液葡萄糖水平和/或胰島素水平和/或淀粉酶水平用本領(lǐng)域公知的方法和 /或本文所述的方法進(jìn)行評估。
[0230] 在另一個(gè)實(shí)施例中，在處理之后獲得胰的樣品（例如，活組織檢查），以及β細(xì) 胞（例如，表達(dá)胰島素的細(xì)胞）和/或α細(xì)胞（例如，表達(dá)胰高血糖素的細(xì)胞）和/或 胰島和/或rox-i表達(dá)細(xì)胞的數(shù)目，例如使用免疫組織化學(xué)、免疫熒光、或核酸擴(kuò)增測定法 如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)。此類測定法在本文中有描述。
[0231] 本發(fā)明將在下述非限制性的實(shí)施例中進(jìn)行進(jìn)一步的描述。
[0232] 實(shí)施例1
[0233] 用STRO-Γ細(xì)胞治療糖尿病小鼠
[0234] L 1材料和方法
[0235] 小鼠中鏈脲菌素（STZ)-誘導(dǎo)的糖尿病
[0236] 在第1-4天于4-h的午前禁食后，每天用35mg/kg的β -細(xì)胞毒素，鏈脲菌素 (STZ ;Sigma-Aldrich，St. Louis，MO)經(jīng)腹膜內(nèi)（i. ρ.)注射7-8周齡的雄性免疫缺陷NOD/ scid 小鼠（NOD. CB17_Prkdcseld/J;Animal Research Centre, Perth, Australia)。將 STZ 溶 解于pH 4. 5的檸檬酸鈉緩沖液中，并在制備好后的15min之內(nèi)注射。將小鼠保持在無菌 條件下。
[0237] 細(xì)胞的灌輸和治療組
[0238] 將經(jīng)免疫磁性選擇的來自積累的骨髓細(xì)胞的人STRO-Γ基質(zhì)細(xì)胞基本上按照 Gronthos 和 Zannetino (Methods Mol Biol. 449:45_57,2008)所述的那樣進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)展， 并且得自 Angioblast Systems, USA。將傳代 4，在 ProFreeze?-CDM(Lonza, USA)中低溫保 存的STRO-?；|(zhì)細(xì)胞解凍，并對每個(gè)小鼠將2. 5x 10 6的細(xì)胞配制到200 μ 1的媒介物中 用于立即注射。在第10天，STZ處理后，將每個(gè)NOD/scid小鼠，用單一劑量的細(xì)胞經(jīng)胸 壁注射入經(jīng)麻醉小鼠的左心室（動脈途徑）。對照小鼠則通過動脈或靜脈途徑注射200 μ 1 的媒介物（含有 7. 5% DMSO 和 a -MEM 的 ProFreeze?-CDM)。
[0239] 對血液葡萄糖和胰島素的測定
[0240] 在 4_h 的午前禁食后，用葡萄糖計(jì)（Optimum Xceed? Diabetes Monitoring System ;Abbott Diagnostics, Victoria, Australia)測定尾靜脈血液中的血液葡 萄糖。通過使用小鼠特異的ELISA試劑盒（Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA Mercodia, Uppsala, Sweden),在第32天處死小鼠前通過對麻醉的小鼠進(jìn)行心臟內(nèi)穿刺 (puncture)而獲得的血液中測定血液胰島素。
[0241] 組織樣品的制備
[0242] 通過斷頸法對小鼠實(shí)施安樂死，將胰摘除并對稱地切開，將一半在10% 的中性福爾馬林中固定，而將另一半包埋入Tissue-Tek OCT Compound(Sakura Finetek, Torrance, CA)并在干冰上冷凍且儲存于-70°C。胰被特定地用于本研究中大部分 的分析，而其它組織如肺、肝、心臟、脾、胃、腸/盲腸、膀胱、睪丸和腦則被收集用于組織病 理學(xué)。
[0243] 胰組織的組織學(xué)和免疫熒光染色
[0244] 對于胰的組織學(xué)，將經(jīng)福爾馬林固定的石蠟包埋的（FFPE)切片用蘇木精和曙 紅（H&E)染色。將裝載至顯微鏡載玻片上的FFPE組織切片（5 μ m)去石蠟化，并通過在 高壓鍋中的檸檬酸鹽緩沖液中加熱而進(jìn)行抗原恢復(fù)（antigen retrieval)。在抗原恢復(fù) 后用10%的正常山羊血清將該切片封閉2h并用于使用如下抗體（先前經(jīng)測試和驗(yàn)證可 檢測經(jīng)抗原恢復(fù)的組織中的小鼠特異性分子）的免疫熒光檢測：豚鼠抗-胰島素抗體 (1:100 ;Millipore，USA)、小鼠抗-胰高血糖素抗體（10μ g/ml ;克隆 K79bB10 ;AbCAM)、小 鼠抗-PDX-I抗體（10 μ g/ml ;克隆267712 ;R&D Systems)。在2h的初抗溫育步驟之后， 用1 %的正常山羊血清/PBS將載玻片洗滌3次5min并在室溫與物種特異性二抗（1:400 ; 山羊抗-小鼠 Alexa Fluor 555 ;Molecular Probe或山羊-抗-膝鼠羅丹明；Jackson Laboratories或山羊-抗-小鼠 IgGl-FITC ;AbCAM)進(jìn)一步溫育90min。對照省略掉初抗。 胰組織中平滑肌肌動蛋白（SM)的染色通過使用小鼠抗-SM-FITC mAb (2mg/ml ;克隆1A4 ; AbCAM)的直接熒光染色來進(jìn)行。
[0245] 免疫染色的評估
[0246] 在Zeiss Observer Zl顯微鏡（Germany)中觀察載玻片并用AxioCam MRm拍攝圖 片。用Axio Vision Rel 4. 7軟件分析所拍攝的胰組織（經(jīng)H&E或者針對胰島素、胰高血 糖素、PDX-I和SM的抗體染色并且經(jīng)熒光探針檢測）的圖片。來自每個(gè)實(shí)驗(yàn)動物的每個(gè) 5mm的H&E切片被用于計(jì)數(shù)胰島的總數(shù)目以及分析胰島的大?。娣e和直徑量度）并且針 對每個(gè)相應(yīng)的經(jīng)圖像分析所測量的總切片面積進(jìn)行歸一化（normalize)。此外，每個(gè)經(jīng)抗 原恢復(fù)的5 μ m FFPE切片（由抗-胰島素、胰高血糖素或Η)Χ-Ι抗體染色）被計(jì)數(shù)陽性染 色的細(xì)胞的總數(shù)目并且針對相應(yīng)的經(jīng)測量的總切片面積或總胰島面積來進(jìn)行歸一化。通過 圖像分析對不同直徑的胰微血管的分布進(jìn)行計(jì)數(shù)以及測量，并且針對其相應(yīng)的經(jīng)檢驗(yàn)的 切片面積進(jìn)行歸一化。所有的圖像均在20-40X的物鏡放大倍數(shù)下進(jìn)行分析。
[0247] 通過半-定量RT-PCR的RNA分析
[0248] 來自實(shí)驗(yàn)組胰的RNA樣品是在Trizol試劑中從來自每個(gè)冷凍組織的總共IOOmm 的切片中提取的。用 illustra RNAspin Mini RNA Isolation試劑盒（GE Healthcare, UK) 從該Trizol組織提取物中純化RNA。用分光光度計(jì)對總RNA進(jìn)行定量并將Iyg用 olig〇-dT(pdT12_18)和MMLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。在表1所給出的擴(kuò)增條件下用Tth Plus DNA聚合酶（Roche Applied Science)以及用針對鼠基因 MafA、Ngn3、和Pdx-I的引物來將 cDNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。β-肌動蛋白基因被用于對靶基因的表達(dá)進(jìn)行歸一化。用Kodak ID 3. 5軟件通過對UV-照射下可見條帶的光密度測定分析來對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量。
[0249] 表 L PCR 條件
[0250]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于在有需要的對象中改善胰功能的方法，該方法包括給所述對象施用STRO-Γ細(xì) 胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述STRO-Γ細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可 溶因子的施用促進(jìn)胰β細(xì)胞和/或胰島的再生。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中所述STRO-Γ細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其 的可溶因子的施用在所述對象中降低血液葡萄糖水平和/或提高血液/血清胰島素水平。
4. 權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的方法，其中所述STRO-Γ細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍 生自其的可溶因子的施用在所述對象中提高胰β細(xì)胞的數(shù)目和/或相對于胰α細(xì)胞提高 胰β細(xì)胞的數(shù)目和/或降低胰α細(xì)胞的數(shù)目和/或提高胰島的數(shù)目。
5. 權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的方法，其中所述STRO-Γ細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍 生自其的可溶因子的施用在所述對象的胰中提高胰和十二指腸同源異型框因子-I(PDX-I) 的表達(dá)和/或提高表達(dá)rox-i的細(xì)胞的數(shù)目。
6. 權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的方法，其中所述STRO-Γ細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍 生自其的可溶因子的施用在所述對象的胰中誘導(dǎo)或促進(jìn)動脈發(fā)生或血管發(fā)生。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或6的方法，其中所述對象患有與胰的內(nèi)分泌和/或外分泌功能相 關(guān)的胰功能異常。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述胰功能異常關(guān)聯(lián)或引起異常水平的胰島素、胰高 血糖素、促生長素抑制素、胰多肽、胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原、彈性蛋白酶、羧肽酶、胰脂 肪酶或淀粉酶。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述異常水平的胰高血糖素是由分泌胰高血糖素的腫 瘤所引起的。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述胰功能異常關(guān)聯(lián)或引起營養(yǎng)的吸收障礙。
11. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述胰功能異常關(guān)聯(lián)胰炎、胰機(jī)能不全，獲得性自身 免疫缺陷綜合癥、癌癥、囊性纖維化或Zollinger Ellison綜合癥。
12. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述胰功能異常導(dǎo)致低血糖或高血糖、降低的血清氨 基酸水平、蛋白尿、或者壞死松解性游走性紅斑。
13. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述胰功能異常關(guān)聯(lián)或引起碳水化合物代謝病。
14. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述碳水化合物代謝病通過由胰所產(chǎn)生的胰島素的 降低所引起或者通過由胰所產(chǎn)生的淀粉酶的降低所引起。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法，其中所述碳水化合物代謝病是糖尿病。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的方法，其中將所述STRO-Γ細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和 /或衍生自其的可溶因子直接施用至對象的血流中。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中動脈內(nèi)施用所述STRO-Γ細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和 /或衍生自其的可溶因子。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)的方法，其中施用于對象的所述STRO-I+細(xì)胞是 STRO-Ib"、和/或表達(dá)組織非特異性堿性磷酸酶（TNAP)，和/或所述后代細(xì)胞和/或可溶 因子衍生自是STRO-I b^ /或表達(dá)TNAP的STRO-I +細(xì)胞。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的方法用于治療或延緩胰功能異常的進(jìn)展，其中所述 STRO-Γ細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子在病癥的診斷后施用。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1-19任一項(xiàng)的方法，另外包括監(jiān)測或探測胰功能異常的發(fā)病和/或 進(jìn)展、和/或血液葡萄糖水平、和/或血液/血清胰島素水平、和/或β細(xì)胞的數(shù)目、和/ 或α細(xì)胞的數(shù)目、和/或胰島的數(shù)目、和/或rox-ι表達(dá)細(xì)胞的數(shù)目、和/或rox-i表達(dá)的 量和/或血管的數(shù)目。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的方法，其中所述STRO-I +細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/ 或衍生自其的可溶因子以組合物的形式施用，所述組合物包含所述STRO-Γ細(xì)胞和/或其 后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子以及載體和/或賦形劑。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述組合物另外包含誘導(dǎo)或增強(qiáng)先祖細(xì)胞分化成血 管細(xì)胞的因子，或者所述組合物包含組織特異性定型細(xì)胞。 23. STRO-Γ細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子、或者含有STRO-I +細(xì) 胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子的組合物，其用于： (i) 治療胰功能異常；和/或 (ii) 改善胰功能；和/或 (iii) 誘導(dǎo)或促進(jìn)胰β細(xì)胞和/或胰島的再生；和/或 (iv) 降低血液葡萄糖水平和/或提高血液/血清胰島素水平；和/或 (V)提高胰β細(xì)胞的數(shù)目和/或用于相對于胰α細(xì)胞提高胰β細(xì)胞的數(shù)目和/或用 于減少胰α細(xì)胞的數(shù)目和/或用于提高胰島的數(shù)目；和/或 (vi) 提高胰和十二指腸同源異型框因子-i(PDx-i)表達(dá)和/或用于提高胰中的rox-i 表達(dá)細(xì)胞的數(shù)目；和/或 (vii) 誘導(dǎo)或促進(jìn)胰中的動脈發(fā)生或血管發(fā)生。 24. STRO-Γ細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子、或者含有STRO-I +細(xì) 胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子的組合物用于： (i) 治療胰功能異常；和/或 (ii) 改善胰功能；和/或 (iii) 誘導(dǎo)或促進(jìn)胰β細(xì)胞和/或胰島的再生；和/或 (iv) 降低血液葡萄糖水平和/或提高血液/血清胰島素水平；和/或 (V)提高胰β細(xì)胞的數(shù)目和/或用于相對于胰α細(xì)胞提高胰β細(xì)胞的數(shù)目和/或用 于減少胰α細(xì)胞的數(shù)目和/或用于提高胰島的數(shù)目；和/或 (vi) 提高胰和十二指腸同源異型框因子-i(PDx-i)表達(dá)和/或用于提高胰中的rox-i 表達(dá)細(xì)胞的數(shù)目；和/或 (vii) 誘導(dǎo)或促進(jìn)胰中的動脈發(fā)生或血管發(fā)生， 的用途 25. STRO-Γ細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子在制備用于： (i) 治療胰功能異常；和/或 (ii) 改善胰功能；和/或 (iii) 誘導(dǎo)或促進(jìn)胰β細(xì)胞和/或胰島的再生；和/或 (iv) 降低血液葡萄糖水平和/或提高血液/血清胰島素水平；和/或 (V)提高胰β細(xì)胞的數(shù)目和/或用于相對于胰α細(xì)胞提高胰β細(xì)胞的數(shù)目和/或用 于減少胰α細(xì)胞的數(shù)目和/或用于提高胰島的數(shù)目；和/或 (Vi)提高胰和十二指腸同源異型框因子-I(PDX-I)表達(dá)和/或用于提高胰中的rox-1 表達(dá)細(xì)胞的數(shù)目；和/或 (Vii)誘導(dǎo)或促進(jìn)胰中的動脈發(fā)生或血管發(fā)生， 的藥物中的用途。
【專利摘要】用于在有需要的對象中改善胰功能的方法,該方法包括給所述對象施用STRO-I+細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞和/或衍生自其的可溶因子。本發(fā)明的方法可用于治療和/或預(yù)防和/或延緩由胰功能異常引起的或與其相關(guān)的疾病的發(fā)作,例如,由胰不正常的內(nèi)分泌或外分泌功能引起的疾病。PTA-728220051219
【IPC分類】A61K35-12, A61P5-48, C12N5-077, A61P1-18
【公開號】CN104546912
【申請?zhí)枴緾N201410727242
【發(fā)明人】S·伊泰斯庫, R·克里希南
【申請人】中胚有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2009年11月19日
【公告號】CA2744228A1, CN102307992A, CN102307992B, CN103800370A, EP2350266A1, EP2350266A4, EP2350266B1, US8894972, US20110243902, US20150064148, WO2010057260A1