專利名稱：Age－1多肽和相關(guān)分子以及方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及與衰老有關(guān)的多肽和核酸序列，以及它們使用的方法。
隨著美國和其它國家的人群的平均年齡的增加，人們對于努力延緩衰老進(jìn)程的興趣不斷增加。長期以來，大家公認(rèn)，觸發(fā)DNA損壞或者換句話說對細(xì)胞有毒性的環(huán)境因子可能對壽命有負(fù)面影響。在此過程中的遺傳作用也日益被接受，并且已導(dǎo)致研究參與和控制老化或衰老的基因。這些基因是有價(jià)值的，因?yàn)樗鼈兛梢跃幋a延緩衰老或死亡的治療產(chǎn)物?；蛘撸梢詫⑦@些蛋白用作拮抗型藥物設(shè)計(jì)或分離的靶，這些藥物本身延長壽命或延緩衰老相關(guān)條件的發(fā)動。
發(fā)明概述概括地說，本發(fā)明描繪基本純的AGE-1多肽的特征，該多肽具有的氨基酸序列至少50％(而且最好是70％或90％)與圖6(SEQ ID NO:1)的多肽相同。最好是，該AGE-1多肽包括在等同位置上包括下列圖6(SEQ ID NO:1)氨基酸序列中的50％(而且最好是70％或90％)相同的氨基酸氨基酸Gly-32、Leu-73、His-78、Phe-81、Glu-109、Phe-114、Leu-123、Leu-125、Phe-129、Lys-181、Ser-208、Lys-211、Arg-321、Leu-325、Leu-351、Ser-355、Met-373、Leu-381、Leu-393、Thr-432、Tyr-451、Glu-475、Pro-507、Ile-514、Gly-518、Glu-530、Val-538、Leu-582、Tyr-606、Pro-643、Phe-665、Leu-744、Leu-745、Arg-762、Leu-789、Arg-794、Ala-827、Arg-829、Trp-835、Ser-842、Asn-905、Gly-917、Asp-975、Ile-990、Asp-1006、His-1020、Lys-1104、Thr-1105、Gly-1130、Phe-1140和Lys-1144。特別推薦位于等同氨基酸827的丙氨酸。在另一個(gè)最佳實(shí)施方案中，該AGE-1多肽得自動物，例如，Caenhorabditis elegans或哺乳動物，例如人。
本發(fā)明也描繪AGE-1多肽的有用片段的特征；特別是，推薦的片段包括圖6(SEQ ID NO:1)的氨基酸387-641、387-1146、1-130、1-150、1-658或1-404。
在相關(guān)的方面，本發(fā)明描繪編碼任一上述AGE-1多肽的純化DNA(例如，cDNA)或包括AGE-1核酸序列的純化DNA，該核酸序列至少30％(并且最好是40％、50％、70％、80％或90％)與圖4(SEQ ID NO:2)的核酸序列相同。另外，本發(fā)明描繪包括與圖4(SEQ ID NO:2)、圖4(SEQID NO:2)的核苷酸64-852基本相同的AGE-1核酸序列的純化DNA；與核苷酸865-912基本相同的AGE-1核酸序列的純化DNA；包括與圖4(SEQ ID NO:2)的核苷酸919-975基本相同的AGE-1核酸序列的純化DNA；包括與圖4(SEQ IDNO:2)的核苷酸1003-3090基本相同的AGE-1核酸序列的純化DNA；包括與圖4(SEQ ID NO:2)的核苷酸3094-3501基本相同的AGE-1核酸序列的純化DNA；或包括與圖4(SEQ ID NO:2)的核苷酸2620-2655基本相同的AGE-1核酸序列的純化DNA。本發(fā)明也描繪載體和細(xì)胞，它們均包括本發(fā)明的純化DNA；以及產(chǎn)生重組AGE-1多肽的方法，該方法包括提供用編碼用于在細(xì)胞中表達(dá)定位的AGE-1多肽的DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、在表達(dá)該DNA的條件下培養(yǎng)該轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、以及分離該重組的AGE-1多肽。本發(fā)明還描繪通過本發(fā)明純化DNA的這種表達(dá)產(chǎn)生的重組AGE-1多肽、以及特異性識別并結(jié)合AGE-1多肽的基本純的抗體。
另外，本發(fā)明描繪鑒別AGE-1調(diào)制化合物的方法。第一個(gè)方法涉及能降低AGE-1基因表達(dá)的調(diào)制化合物的鑒別，包括(a)提供表達(dá)該AGE-1基因的細(xì)胞和(b)將該細(xì)胞與候選化合物接觸，與該候選化合物接觸后的AGE-1表達(dá)的降低鑒別調(diào)制化合物。第二個(gè)方法涉及能降低AGE-1活性(例如激酶活性)的調(diào)制化合物的鑒別；該方法包括(a)提供表達(dá)AGE-1多肽的細(xì)胞和(b)將該細(xì)胞與候選化合物接觸，與該候選化合物接觸后的AGE-1活性(例如，激酶活性)的降低鑒別調(diào)制化合物。
在兩種方法的最佳實(shí)施方案中，該AGE-1基因編碼或AGE-1多肽包括與顯示在圖6(SEQ ID NO:1)中的氨基酸序列至少50％(并且最好是70％或90％)相同的氨基酸序列；并且該AGE-1基因或AGE-1多肽是來自動物(例如，C.elegans)，而且最好是來自哺乳動物(例如，人)。在其它最佳實(shí)施方案中，在線蟲或其它動物中實(shí)施該方法，或該方法涉及在體外分析AGE-1活性。
本發(fā)明還描繪通過上述方法鑒別的調(diào)制化合物以及增加哺乳動物壽命的方法，該方法包括給予哺乳動物(例如，人)這種化合物。另外，本發(fā)明描繪生產(chǎn)增加哺乳動物(例如，人)壽命的藥物的方法。
另外，本發(fā)明描繪確定動物壽命的方法。該方法涉及在來自動物的樣品中測定AGE-1基因表達(dá)或AGE-1活性(例如，激酶活性)，以及相對于野生型樣品的AGE-1表達(dá)或活性的降低是該動物壽命增加的指示。
在最佳實(shí)施方案中，該動物是哺乳動物(例如，人)；通過分析樣品中AGE-1多肽的量(例如，通過免疫學(xué)方法)測定AGE-1基因的表達(dá)；或通過分析樣品中AGE-1 mRNA的量(例如，通過用AGE-1-特異性核酸序列的雜交或PCR技術(shù))測定AGE-1基因的表達(dá)。
在本發(fā)明中也包括實(shí)施上述方法的試劑盒。這種試劑盒最好包括特異性地識別并結(jié)合AGE-1多肽的基本純的抗體，并且也可以包括檢測和定量抗體結(jié)合的工具。或者，該試劑盒可以包括可用于雜交或PCR目的的AGE-1核酸序列的全部或片段，以及也可以包括檢測和定量該雜交或擴(kuò)增產(chǎn)物的工具。
“AGE-1多肽”是指參與控制衰老的磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3-激酶)。
“蛋白”或“多肽”是指氨基酸的任何鏈，與長度或翻譯后修飾(例如，糖基化或磷酸化)無關(guān)。
“基本純”是指含至少60％(重量)(干重)目的化合物(例如，AGE-1多肽或AGE-1特異性抗體)的制劑。優(yōu)選該制劑含至少75％(重量)目的化合物，更優(yōu)選含至少90％(重量)目的化合物，而最優(yōu)選至少99％,(重量)目的化合物?？梢酝ㄟ^任何適當(dāng)?shù)姆椒ǎ缰鶎游?、聚丙烯酰胺凝膠電泳或HPLC分析測定純度。
“純化DNA”是指這樣的DNA，它與在它來源的有機(jī)體天然存在的基因組中直接連接的兩個(gè)編碼序列(一個(gè)在5’末端而一個(gè)在3’末端)不直接連接。因此該術(shù)語包括例如插入載體的重組DNA；插入自主復(fù)制型質(zhì)?；虿《镜闹亟MDNA；或插入原核或真核生物的基因組DNA的重組DNA，或以獨(dú)立于其它序列的單獨(dú)分子(如cDNA或通過PCR或限制性內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的基因組DNA片段)存在的重組DNA。它也包括編碼另一多肽序列的雜種基因部分的重組DNA。
“基本相同的”核酸是指其編碼的多肽僅僅由于以下原因而不同的核酸序列保守氨基酸取代，例如以一個(gè)氨基酸取代同種的另一個(gè)氨基酸(如纈氨酸取代甘氨酸，精氨酸取代亮氨酸等)；或位于氨基酸序列上不損害該多肽(分析多肽，如這里描述的)功能的位置的一個(gè)或多個(gè)非保守的取代、缺失或插入。最好是，該編碼的序列在氨基酸水平上與圖6(SEQ ID NO:1)或其AGE-1域(如這里描述)的序列至少30％相同。在其它最佳實(shí)施方案中，該編碼的序列在氨基酸水平上與圖6(SEQ ID NO:1)或其AGE-1域的序列至少40％、優(yōu)選50％、更優(yōu)選60％,、而最優(yōu)選70％相同。在另外的最佳實(shí)施方案中，該編碼的序列在氨基酸水平上與圖6(SEQ ID NO:1)或其AGE-1域的序列至少80％,、優(yōu)選85％,、更優(yōu)選90％、而最優(yōu)選95％相同。如果比較核酸序列，則“基本相同的”核酸序列是與圖4(SEQ ID NO:2)或編碼其AGE-1域的序列至少30％、更優(yōu)選40％、而最優(yōu)選50％相同的核酸序列。在其它最佳實(shí)施方案中，基本相同的核酸序列是與圖4(SEQ ID NO:2)或編碼其AGE-1域的序列至少75％、更優(yōu)選85％、而最優(yōu)選95％相同的核酸序列。核酸序列比較的長度將通常至少是50個(gè)核苷酸、優(yōu)選至少60個(gè)核苷酸、更優(yōu)選至少75個(gè)核苷酸，而最優(yōu)選110個(gè)核苷酸。
通常用序列分析軟件(如，遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組的序列分析軟件包，University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 UniversityAvenue,Madison,WI 53705,BLAST，或PILEUP/PRETTYBOX程序)測定同源性。這類軟件通過規(guī)定對各種取代、缺失和其它修飾的同源性程度，匹配相似的序列。保守取代通常包括在以下組內(nèi)的取代甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
“表達(dá)定位”是指將該DNA分子靠近指導(dǎo)該序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA序列定位(即有利于AGE-1蛋白的產(chǎn)生)。
“純化抗體”是指至少60％(重量)不含與其天然相連的蛋白和天然存在的有機(jī)分子的抗體。優(yōu)選該制劑是至少75％(重量)的抗體、更優(yōu)選至少90％(重量)的抗體、而最優(yōu)選至少99％(重量)的抗體。
“特異性結(jié)合”是指抗體識別并結(jié)合AGE-1多肽，但是基本不識別和結(jié)合天然包含AGE-1多肽的樣品(如，生物學(xué)樣品)中其它分子?！疤禺愋越Y(jié)合”AGE-1的抗體在這類生物學(xué)樣品中用一種或多種本領(lǐng)域可應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)技術(shù)(例如，蛋白質(zhì)印跡或免疫沉淀)足以檢測AGE-1蛋白產(chǎn)物。
“壽命”是指衰老的速度和/或生命周期。
“相對于野生型樣品”是指相對于來自一個(gè)或多個(gè)平均生命周期的個(gè)體的相同組織樣品?？梢酝ㄟ^在有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義數(shù)目的群體成員中分析AGE-1水平，確定平均生命周期的個(gè)體。
“免疫學(xué)方法”是指任何涉及基于抗體的檢測技術(shù)的分析，包括但不限于蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀、以及直接的和競爭的ELISA和RIA技術(shù)。
“用于檢測的工具”是指足以表明目的檢測事件的任何一個(gè)或一系列組分。這類工具涉及可以被分析或觀察的至少一個(gè)標(biāo)記，包括但不限于放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。
“AGE-1RNA”是指從AGE-1 DNA序列轉(zhuǎn)錄的信使RNA。
“雜交技術(shù)”是指任何涉及在核酸鏈之間特異性相互作用(基于互補(bǔ)性)的檢測分析，所述相互作用包括DNA-DNA、RNA-RNA和DNA-RNA間的相互作用。如果需要，這類雜交技術(shù)可以包括PCR擴(kuò)增步驟。
“激酶活性”是指AGE-1介導(dǎo)的磷脂酰肌醇P3(PIP3)的產(chǎn)生。
在這里用的“調(diào)制化合物”是指任何能或者降低AGE-1表達(dá)(即在轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后的水平上)或者降低AGE-1蛋白活性(即每單位AGE-1蛋白量活性的量，例如激酶活性的量)的化合物。
本發(fā)明的其它描繪和優(yōu)點(diǎn)將從以下的其詳細(xì)描述以及從權(quán)利要求書中明顯看出。
附圖簡述

圖1是顯示在age-1(hx546)動物中有缺陷的母本age-1基因活性的圖示。在圖中age-1(mg44)染色體用sqt-1(sc13)以順式標(biāo)記。age-1(mg44)純合親本的age-1(mg44)后代顯示在左邊。age-1(hx546)/sqt-1(sc13)age-1(mg44)雜合親本的后代顯示在中間。+/sqt-1(sc13)age-1(mg44)雜合親本的后代顯示在右邊。將sqt-1(sc13)遺傳標(biāo)記用于鑒別純合age-1(mg44)后代。當(dāng)用另一個(gè)標(biāo)記unc-4標(biāo)記另一個(gè)age-1等位基因m33(它也可能是無效的等位基因)和mg109時(shí)，觀察到類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。所示實(shí)驗(yàn)中，動物在25℃生長。請注意，age-1(hx546)/sqt-1(sc13)age-1(mg44)的sqt-1(sc13)age-1(mg44)后代在25℃發(fā)育停滯為持久幼蟲，外顯率為100％。這與作為對照的age-1(mg44)親本的age-1(mg44)子代相同。在age-1(mg44)親本的age-1(mg44)子代的情況下，我們也注意到這些動物的6％(n=30)在L1或L2期停滯。許多這些停滯的動物最終生長成持久樣幼蟲和不育的成體。相反，1％的+/sqt-1(scl3)age-1(mg44)的sqt-1(sc13)age-1(mg44)后代在25℃發(fā)育停滯為持久幼蟲。來自能育成體的age-1(hx546)/sqt-1(sc13)age-1(mg44)后代就像+/sqt-1(sc13)age-1(mg44)后代。這表明，對于非持久生長，age-1(hx546)表達(dá)足夠的合子age-1水平，而不是母本age-1水平。
在20℃，幾乎沒有age-1(hx546)/sqt-1(sc13)age-1(mg44)的sqt-1(sc13)age-1(mg44)后代停滯發(fā)育為持久幼蟲；大多數(shù)作為持久樣動物繼續(xù)發(fā)育，是黑的和不育的。首先已注意age-1(mg44)的這種溫度依賴性持久停滯(Gottlieb,S.和Ruvkun,G.Genetics 137,107-120(1994))。我們不能將高溫下更嚴(yán)重的表型認(rèn)為是age-1(hx546)的任何溫度敏感性引起的結(jié)果。與25度不同，在20度在age-1(hx546)中有可檢測的母本age-1活性age-1(hx546)/sqt-1(sc13)age-1(mg44)的4％的sqt-1(sc13)age-1(mg44)后代是能育的(數(shù)據(jù)未顯示)，不像age-1(mg44)母本的age-1(mg44)子代(Gottlieb,S.和Ruvkun,G.Genetics 137,107-120(1994))。相反，在20度，+/sqt-1(sc13)age-1(mg44)親本的93％的sqt-1(sc13)age-1(mg44)后代是能育的。
在該圖中，上標(biāo)a表示一個(gè)能育的Sqt成體是重組的sqt-1(sc13)age-1(mg44)/sqt-1(sc13)age-1(hx546)。從其它實(shí)驗(yàn)中的相同親代品系挑出兩個(gè)其它的sqt-1(sc13)age-1(mg44)/sqt-1(sc13)age-1(hx546)重組體(數(shù)據(jù)未顯示)。上標(biāo)b表示在F3中除了三個(gè)sqt-1(sc13)age-1(mg44)/sqt-1(scl3)重組體，所有可育的Sqt成體均產(chǎn)生Sqt持久型。
通過從原始的非持久型Sqt中挑出各個(gè)動物，然后檢測其同組動物(brood)，確定所述重組體的基因型。三個(gè)sqt-1(sc13)age-1(hx546)/sqt-1(sc13)age-1(mg44)重組體將age-1(hx546)定位在sqt-1(sc13)的右邊，因?yàn)檫@些重組體顯示，在age-1(hx546)/sqt-1(sc13)age-1(mg44)雜合子中，每次sqt-1(sc13)與age-1(mg44)重組分開，age-1(hx546)回收在sqt-1重組染色體上。也將age-1(hx546)相對于sqt-1(sc13)和lin-29進(jìn)行三因子作圖；根據(jù)缺乏age-1(m333)的母本拯救，兩個(gè)非Sqt的Lin重組體是Age，而10個(gè)非Lin的Sqt重組體是非Age。這表明age-1定位在lin-29的左邊。
為了進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，在20℃將age-1(hx546)雄體交配為sqt-1(sc13)age-1(mg44)雌雄同體。將F1非Sqt非Daf雜交后代(3/3)挑到單獨(dú)的平板。在25度、20度或15度挑選單個(gè)雜合子到平板上，并每天轉(zhuǎn)移(20°或25°)或每2-3天轉(zhuǎn)移(20°和15°)。然后對蟲計(jì)數(shù)，并在3天后(25°)、4天后(20°)或7天后(15°)記錄持久型和非持久型。為了遺傳作圖，將age-1(hx546)雄體與sqt-1(sc13)lin-29(n333)/mnC1雌雄同體交配，將單個(gè)的野生型雜交后代挑到單獨(dú)的平板。對于Sqt-非Lin和Lin-非Sqt的重組體，檢測分離的野生型、Sqt Lin動物和攜帶mnCl的無后代的平板。然后將推定的重組體挑到單個(gè)的平板，并且選出來自該雜合重組體的后代以建立純合子重組品系。然后記錄到10個(gè)Sqt-非Lin和2個(gè)Lin-非Sqt重組體在25℃不能母本互補(bǔ)age-1(m333)的持久組成性。將unc-4(e120)age-1(m333)/mnCl雄體與所述重組體交配。在交配前，用微注射針將Lin非Sqt重組體在陰門處打開。將野生型雌雄同體雜交后代挑至25℃，并且記錄其后代的unc-4(el20)age-1(m333)純合后代是否停滯為持久幼蟲。
圖2A是顯示age-1區(qū)的物理/遺傳圖譜的圖示，遺傳上定向的左邊朝向左邊。在該遺傳定向圖譜上，age-1是從右向左轉(zhuǎn)錄。C.elegans基因組項(xiàng)目設(shè)置該sqt-1 lin-29區(qū)間中的粘粒和YAC克隆。當(dāng)用該粘粒作為探針通過對Df/mnCl DNA的DNA印跡檢測時(shí)，mnDf75、mnDf76和mnDf86均互補(bǔ)age-1，而不能互補(bǔ)sat-1，在粘粒C24F2中斷裂(數(shù)據(jù)未顯示)。用從左邊部分重疊C24F2的粘粒W1OC3，在mnDf76中也檢測到斷裂點(diǎn)，但在mnDf75或mnDf86中沒有檢測到斷裂點(diǎn)。因此，age-1必定定位在這些缺陷的斷裂點(diǎn)的右邊。用對mnDf90純合(不能與sqt-1和age-1互補(bǔ))胚胎的kin-6引物的PCR分析，顯示該缺陷缺失kin-6左邊的DNA，將age-1置于kin-6的左邊。用粘粒B0334作為探針的DNA印跡，從age-1(mg55)/mnCl分離的DNA中檢測到一個(gè)斷裂點(diǎn)，但在從其它age-1等位基因或其它攜帶mnCl的品系分離的DNA中沒有檢測到斷裂點(diǎn)。該age-1轉(zhuǎn)錄物沒有按比例畫出。
圖2B是一DNA印跡分析的照片，顯示從野生型(N2)(1道)、age-1(mg55)mnCl(2道)和三個(gè)Df/mnCl對照品系(3、4和5道)分離的HindⅢ-消化的基因組DNA與由噬菌體5B的4kb SalI亞克隆制備的探針的雜交。該探針檢測編碼AGE-1的C-末端區(qū)的區(qū)域。含有mg55的品系攜帶來自mnCl上野生型age-1等位基因的5.2kbHindⅢ片段和來自age-1(mg55)等位基因的改變的3.1kb HindⅢ片段，表明mg55斷裂點(diǎn)是在粘粒B0334的最右邊(rightmost)部分中或其附近。
圖2C是顯示鄰近用于分離age-1基因顯示的基因組和cDNA克隆的age-1基因結(jié)構(gòu)的圖示。將該基因相對于該遺傳圖譜倒轉(zhuǎn)180°，以使轉(zhuǎn)錄是左至右取向。白色方塊代表預(yù)測的非翻譯區(qū)。句點(diǎn)代表通過RTPCR獲得的序列的區(qū)域，以檢驗(yàn)剪切點(diǎn)和獲得將cDNA B和C與A連接的序列。獨(dú)立的cDNA B和C出現(xiàn)在λ載體相反的方向，并因此代表獨(dú)立的克隆事件。它們在其N末端終止于相互的30bp內(nèi)，提示它們限定該age-1mRNA的真正的終點(diǎn)。第三個(gè)cDNA(未顯示)終止在cDNA C的5bp內(nèi)，并且是與cDNA C在相同的方向。基于它們不能互補(bǔ)sqt-1，分離所有在圖2A、2B和2C中表明的缺陷。在單個(gè)停滯的L1幼蟲(mnDf75、mnDf76、mnDf86)上進(jìn)行用來自sqt-1和kin-6的引物對的PCR，或進(jìn)行來自雜合缺陷/mnCl動物所產(chǎn)的單個(gè)死卵(mnDf90)的引物對的PCR。為了實(shí)施該單個(gè)蟲/卵PCR方案，選擇單個(gè)蟲或卵挑入2.5μl的有蛋白酶K的蟲裂解緩中液(50mMKCl,10mM Tris pH8.2,2.5mM Mg,0.45％NP-40,0.45％吐溫-20,0.01％明膠，60μg/ml蛋白酶K)中。加入礦物油，并將試管在干冰上冰凍，在60℃溫育1小時(shí)，并在95℃溫育15分鐘以裂解。然后加入2.5μl的蟲裂解緩沖液，并將該反應(yīng)分為sqt-1引物和kin-1引物的兩個(gè)PCR反應(yīng)。sqt-1引物為CTCTGGTTCATTTCCCAACC(SEQ ID NO:3)和TGTAACTCACCTAGTCTTCG(SEQ ID NO:4)。kin-1引物為AACAATTACAGGCCGATCC(SEQ ID NO:5)和ATGCCACGCAAGAAACTCAC(SEQID NO:6)。
從λACT中的Barstaead隨機(jī)引物cDNA文庫(RBⅡ)分離噬菌體B和C。從λgt10中的Ahringer期的胚胎文庫分離噬菌體A。從λDash載體中的Browning基因組文庫分離噬菌體φ5B。用硫氰酸鈲從混合階段的蟲中制備用于RTPCR實(shí)驗(yàn)的RNA。用Clontech的5’-AmplifinderRace試劑盒進(jìn)行cDNA制備和錨式連接。用對age-1的特異性引物(序列GAAAAGATGGAATGTGACCG)(SEQ ID NO:7)逆轉(zhuǎn)錄36μg的總RNA。用該試劑盒的錨式引物和用以下序列的引物進(jìn)行PCR:ATCTGAAGCGTTCTTATATC(SEQ ID NO:8)(我們隨后發(fā)現(xiàn)它有一個(gè)錯(cuò)誤)。再次用該錨式PCR引物和內(nèi)部引物TGCTCCATTTTCTCCGATCC(SEQ IDNO:9)進(jìn)行嵌套PCR。
圖3是age-1(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，它是通過對圖1中描述的cDNA克隆、擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄PCR片段和基因組區(qū)測序測定的。不進(jìn)行亞克隆而對PCR產(chǎn)生的模板測序，并通過對多個(gè)分離物測序而證實(shí)。不進(jìn)行亞克隆，通過PCR擴(kuò)增基因組區(qū)和對模板直接測序，測定age-1等位基因的序列。通過對獨(dú)立的擴(kuò)增模板測序，證實(shí)檢測的每個(gè)突變。將該AGE-1序列與小鼠p110α(登記號P42337)(SEQ ID NO:10)、人p110β(登記號P42338)(SEQ ID NO:11)以及人p110γ(登記號P48736)(SEQ ID NO:12)比較。通過Prettybox選出以灰色和黑色突出的區(qū)域，當(dāng)有高度氨基酸相似性的延伸區(qū)域時(shí)，通過Pileup程序進(jìn)行序列對比(Wisconsin軟件包的程序手冊，版本8，1994年9月，Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA53711)。在該4個(gè)序列的3個(gè)中不變的氨基酸以黑色方塊顯示。4個(gè)精確配對的3個(gè)突出區(qū)中相似的氨基酸以灰色方塊突出。在改變的氨基酸上顯示等位基因損壞。星號(*)表示改變?yōu)榻K止密碼子。圍繞age-1(mg55)的括號顯示我們定位了age-1(mg55)斷裂點(diǎn)的區(qū)域。
在這些實(shí)驗(yàn)中，用Promega fmol測序試劑盒在cDNA、RTPCR產(chǎn)物和來自該age-1突變等位基因的PCR擴(kuò)增的基因組區(qū)上進(jìn)行測序。然后將GCG程序、Translate、Pileup和Prettybox用于分析該序列。
圖4是age-1cDNA(SEQ ID NO:2)的核酸序列。
圖5是說明有小鼠p110α的AGE-1序列的圖示。該圖示是按比例的，并且延伸超過1146個(gè)氨基酸的AGE-1序列。給出了通過Gap程序在進(jìn)行序列對比的小鼠p110α的每個(gè)結(jié)構(gòu)域和AGE-1區(qū)之間享有的一致性百分比。標(biāo)記ras和p85的域已顯示在p110α中分別結(jié)合ras和p85。脂質(zhì)激酶域包括與所有脂質(zhì)激酶享有廣泛的同源性的AGE-1區(qū)。每個(gè)點(diǎn)突變的大約位置相對于Pileup程序預(yù)測的假定AGE-1域顯示。
圖6是AGE-1多肽(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。突出的氨基酸位置最好是在AGE-1變異中未改變(基于它們與人激酶p110α中氨基酸的一致性)。
詳細(xì)描述如以下更詳細(xì)描述的，在C.elegans中信息素誘導(dǎo)的神經(jīng)分泌信號系統(tǒng)在持久滯育期觸發(fā)發(fā)育停滯和壽命增加。age-1是該神經(jīng)內(nèi)分泌途徑中的關(guān)鍵基因，非停滯發(fā)育和正常的衰老都需要其活性。如本文所示，age-1編碼磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-激酶)催化亞基p110家族的一個(gè)成員。4個(gè)age-1突變等位基因影響該P(yáng)I3-激酶的同系物2個(gè)損傷是在N-末端至激酶域不同的位置上截短該蛋白的終止密碼子，并且因此可能決定age-1的無效表型。在一個(gè)基于其壽命增加分離的age-1突變中，母本的age-1活性被特異性地消除。母本的或合子的age-1基因活性的缺乏使生命周期延長，但是發(fā)育不停滯，而母本的和合子的age-1基因活性均缺乏導(dǎo)致在持久期停滯。這些數(shù)據(jù)提示，AGE-1介導(dǎo)的磷脂酰肌醇(3,4,5)P3(PIP3)信號降低導(dǎo)致壽命增加，而完全缺乏該信號導(dǎo)致發(fā)育停滯。在C.elegans和其它生物中的滯育在許多動物門中，神經(jīng)信號途徑使感覺輸入與生理和發(fā)育的內(nèi)分泌控制偶聯(lián)。例如，許多無脊椎動物在對信息素、光/黑暗周期或溫度觸發(fā)的神經(jīng)信號的應(yīng)答中停滯或改變它們的發(fā)育(Tauber,M.J.等，Seasonal Adaptation of Insects(New York,NY,1986),Wilson,E.0.,The Insect Societies(Cambridge,MA,1972))。線蟲Caenhorabditis elegans在特定的感覺神經(jīng)元被暴露于誘導(dǎo)持久的信息素后，在持久滯育期停滯發(fā)育(Riddle,D.L.載于The Dauer Larvain The Nematode Caenorhabditis e1egans.(Wood,W.B.編輯)393-412(Cold Spring Harbor,NY,1988))。持久幼蟲的形成包括行為的、生理的和形態(tài)的變化持久幼蟲暫停蛻皮周期和胚系發(fā)育、停止進(jìn)食，但是開始移動(dispersal)行為，并且分泌特化的封閉外皮(Riddle,D.L.載于The Dauer Larva in The NematodeCaenorhabditis elegans中。(Wood,W.B.編輯)393-412(Cold SpringHarbor,NY,1988))。當(dāng)信息素水平降低時(shí)，該持久恢復(fù)并重新進(jìn)入正常進(jìn)食和蛻皮周期，產(chǎn)生能育的成體動物。持久的形成在C.elegans中也中斷正常的衰老。持久停滯的幼蟲存活的時(shí)間可以比非持久動物的壽命長8倍以上，而在從該持久期恢復(fù)后不影響壽命。(Riddle,D.L.載于The Dauer Larva in The Nematode Caenorhabditis elegans中。(Wood,W.B.編輯)393-412(Cold Spring Harbor,NY,1988))。由于總體形態(tài)學(xué)變化和壽命的改變與持久形成相關(guān)，并且由于與其它無脊椎動物中滯育的已知內(nèi)分泌控制類似(Williams,C.M.,Biol.Bull.103:120-138(1952))，所以可能神經(jīng)內(nèi)分泌途徑與探測該持久信息素的感覺神經(jīng)元偶聯(lián)。
已分離了和表征了許多影響持久形成的突變(daf突變)(riddle,D.L.等，Nature 290:668-671(1981)；Vowels,J.J.和Thomas,J.H.,Genetics 130:105-123(1992)；Gottlieb,S.和Ruvkun,G.,Genetics 137:107-120(1994))。這些突變分為兩個(gè)主要類別持久組成型(daf-c)突變，甚至在缺乏誘導(dǎo)持久的信息素下它也導(dǎo)致動物進(jìn)入持久期；和持久缺陷型(daf-d)突變，甚至在高信息素的條件下，它也阻止持久形成)。已將這些突變鑒別的基因順序加入(order into)遺傳上位性途徑，所述遺傳上位性途徑可能在由信息素-感覺神經(jīng)元、分泌細(xì)胞和靶組織組成的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的發(fā)育或功能中代表所述步驟(Riddle,D.L.等，Nature 290:668-671(1981)；Vowels,J.J.和Thomas,J.H.等，Genetics 130:105-123(1992)；Gottlieb,S.和Ruvkun,G.,Genetics 137:107-120(1994)；Thomas,J.H.等，Genetics 134:1105-1117(1993))。這些基因的兩個(gè)-daf-1和daf-4編碼TGF-β受體的類似物，將該信號途徑與信息素信號傳導(dǎo)相聯(lián)系(Georgi,L.L.等，Cell61:635-645(1990)；Estevez,M.等，Nature365:644-649(1993))。
在介導(dǎo)持久神經(jīng)內(nèi)分泌途徑的功能的許多基因中，已經(jīng)將daf-2、daf-16和daf-23與壽命的調(diào)節(jié)最直接相聯(lián)系(Kenyon,C.等，Nature 366:461-464(1993)；Larsen,P.L.等，Genetics 139:1567-1583(1995)；Dorman,J.B.等，Genetics 141:1399(1995))。強(qiáng)的daf-2等位基因和非母本拯救的強(qiáng)的daf-23等位基因在缺乏信息素時(shí)誘導(dǎo)持久形成，而溫度敏感型daf-2等位基因或母本拯救的daf-23等位基因增加壽命2至3倍，不形成持久幼蟲(Kenyon,C.等，Nature 366:461-464(1993)；Larsen,P.L.等，Genetics 139:1567-1583(1995))。這提示可以將衰老的調(diào)節(jié)與持久形成去偶聯(lián)。daf-16突變既抑制daf-2和daf-23突變體的持久組成型表型，又抑制其壽命的增加(Kenyon,C.等，Nature 366:461-464(1993)；Larsen,P.L.等，Genetics 139:1567-1583(1995)；Dorman,J.B.等，Genetics 141:1399(1995))。其它daf突變不影響壽命，并且不被daf-16突變有效地抑制(Gottlieb,S.和Ruvkun,G.,Genetics 137:107-120(1994)；Kenyon,C.等，Nature 366:461-464(1993)；Larsen,P.L.等，Genetics 139:1567-1583(1995))。該遺傳上位性分析提示，調(diào)節(jié)壽命的daf-2、daf-16和daf-23亞途徑不是在該持久途徑的TGF-β信號組分下游作用，就是平行于TGF-β信號組成作用(Vowels,J.J.和Thomas,J.H.等，Genetics 130:105-123(1992)；Gottlieb,S.和Ruvkun,G.,Genetics 137:107-120(1994))。AGE-1的克隆和分析在遺傳篩選中分離增加壽命的age-1(hx546)(Klass,M.,MechAging Dev 22:279-286(1983)；Friedman,D.B.和Johrnsorn,T.E.,Genetics 118:75-86(1988))。age-1(hx546)動物的存活時(shí)間是野生型的兩倍，并且像daf-2和daf-23突變的增加的壽命表型一樣，daf-16中的突變抑制壽命的增加(Kenyon,C.等，Nature 366:461-464(1993)；Larsen,P.L.等，Genetics 139:1567-1583(1995)；Dorman,J.B.等，Genetics 141:1399(1995))。最近，Inoue和Thomas顯示，在高于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)中常規(guī)使用溫度的溫度27℃下，age-1(hx546)具有持久組成型表型，并且不能互補(bǔ)daf-23持久組成型等位基因。因?yàn)閺?qiáng)的daf-23等位基因(如，m333和mg44)在27℃的單倍性不充分(haploinsufficient)(數(shù)據(jù)未顯示)，所以在該溫度的互補(bǔ)試驗(yàn)難以解釋。我們在較低溫度下互補(bǔ)測試age-1(hx546)和持久組成型daf-23等位基因，在該溫度下沒有這種單倍不充分性(haploinsufficiency)(圖1)。結(jié)果表明，age-1(hx546)不能互補(bǔ)3個(gè)daf-23持久組成型突變等位基因，并且作圖到同一遺傳區(qū)間。因此將age-1確定為增加壽命的等位基因(hx546)和以前稱為daf-23的組成型突變等位基因(mg44、mg55、mmg109)，因?yàn)樵摱x的突變等位基因被稱為age-1(Klass,M.,Mech Aging Dev 22:279-286(1983)；Friedman,D.B.和Johnson,T.E.,Genetics 118:75-86(1988))。如以下所顯示，age-1(hx546)在母本的age-1基因活性中特異性地缺失，而較強(qiáng)的持久組成型age-1等位基因在母本和合子的age-1基因活性中均缺失。
將用sqt-1(sc13)順式標(biāo)記的age-1(mg44)無效等位基因(參見以下)用在該遺傳分析中(圖1)。只有在它們不接受母本的或合子的age-1貢獻(xiàn)時(shí)，攜帶該age-1等位基因的動物才正常停滯發(fā)育為持久幼蟲(Gottlieb,S.和Ruvkun,G.,Genetics 137:107-120(1994))。例如，+/age-1(mg44)母本的age-1(mg44)子代發(fā)育成能育的成體，所述成體然后產(chǎn)生一組(brood)停滯的age-1(mg44)持久幼蟲(圖1)。age-1(hx546)突變破壞這種母本拯救age-1(hx546)/age-1(mg44)母本的age-1(mg44)子代停滯發(fā)育成持久型(圖1)。對于另一個(gè)可能的無效等位基因age-1(m333)(見下)和age-1(mg109)觀察到類似的缺乏age-1(hx546)母本拯救(數(shù)據(jù)未顯示)。與age-1(hx546)突變僅表達(dá)母本的age-1一致，父本貢獻(xiàn)的age-1(hx546)等位基因可以由合子拯救age-1(mg44)純合母本后代的持久組成型表型age-1(hx546)雄體與age-1(mg44)/age-1(mg44)雌雄同體交配的age-1(hx546)/age-1(mg44)子代不會停滯發(fā)育成持久幼蟲，類似于來自與野生型雄體交配的+/age-1(mg44)后代(圖1)。遺傳作圖將age-1(hx546)置于sqt-1和lin-29之間的與daf-23相同的1.2圖單位遺傳區(qū)間中(圖1)(Gottlieb,S.和Ruvkun,G.,Genetics 137:107-120(1994))。
如以前的遺傳分析(Gottlieb,S.和Ruvkun,G.,Genetics 137:107-120(1994))和以下的分子分析顯示，大多數(shù)age-1等位基因的持久組成型表型是可能的無效表型。在大多數(shù)溫度下age-1(hx546)不是持久組成型(Klass,M.,Mech Aging Der 22:279-286(1983)；Friedman,D.B.和Johnson,T.E.,Genetics 118:75-86(1988)),可能因?yàn)樵摰任换虻暮献觓ge-1基因活性足以允許非停滯的發(fā)育。該突變體可能是長壽的，因?yàn)槟副矩暙I(xiàn)的age-1的減少導(dǎo)致衰老速度的減緩。同樣，在+/age-1(m333)親本的母本拯救的age-1(m333)純合后代中缺乏合子的表達(dá)，也導(dǎo)致沒有持久停滯的壽命延長(Larsen,P.L.等，Genetics 139:1567-1583(1995))。這些動物只有母本的age-1活性，因?yàn)閍ge-1(m333)是無效突變體(參見以下)。因此，正常的衰老可能取決于母本和合子的age-1活性在缺少合子age-1基因活性或拯救的母本age-1基因活性時(shí)，動物停滯在持久期。
圖1中說明的數(shù)據(jù)在以下的表格中顯示(表1)。表1 age-1產(chǎn)生的壽命的調(diào)節(jié)和持久的形成年齡表型父本 母本 合子基因型持久的形成 壽命(天) 相對于基因型 基因型 野生型的壽命+/+ +/+ 非持久型(1000) 8.1±0.2(90) 1.0mg44/+ mg44/mg44 非持久型(505)*20.7±0.2(26) 2.6mg44/mg44mg44/mg44 非持久型(505)hx546/hx546 hx546/hx546 非持久型(1000) 16.6±1.0(43) 2.0+/+ mg44/mg44mg44/4非持久型(100) 10.7±0.5(35) 1.3hx546/hx546 mg44/hx546 hx546/mg44非持久型(100) 19.8±1.1(54) 2.4mg44/hx546 mg44/mg44 持久型(406)age-1(mg44)染色體用sqt-1(sc13)順式標(biāo)記，并且age-1(mg44)/+品系具有mnCl平衡染色體(balances chromosome)作為+染色體。從L4期至動物對光接觸反應(yīng)的最后一天測定在25℃的壽命，并且表示為平均值±s.e。請注意，age-1(hx546)/sqt-1(sc13)age-1(mg44)的sqt-1(sc13)age-1(mg44)后代在25℃形成持久幼蟲，外顯率為100％。這同對照的age-1(mg44)親本的age-1(mg44)子代相同。在兩種情況下產(chǎn)生的持久幼蟲都有黑暗的腸、咽重建和表皮重建以及該階段的蛻皮周期特征的停滯3.5。相反，sqt-1(sc13)age-1(mg44)/+的99％的sqt-1(sc13)age-1(mg44)后代不形成持久幼蟲，顯示母本的age-1活性足以允許非持久型發(fā)育。這些動物壽命比野生型蟲長2.6倍。合子age-1(+)在缺少母本age-1時(shí)可以為正常的生活周期和非持久型發(fā)育提供足夠的活性，但是合子age-1(hx546)不能為正常的壽命提供足夠的活性。用其它的age-1等位基因m333和mg109觀察到相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。我們通過三因子作圖，將age-1(hx546)定位于1.2圖單位sqt-1 lin-29區(qū)間。在該區(qū)間中的20個(gè)重組體中，4個(gè)是在sqt-1和age-1(hx546)之間，而16個(gè)在age-1和lin-29之間。這顯示age-1(hx546)定位到與age-1(mg44)相同的遺傳區(qū)間。與該圖譜一致，從sqt-1(sc13)age-1(mg44)/age-1(hx546)蟲分離出基因型sqt-1(sc13)age-1(mg44)/sqt1(sc13)age-1(hx546)的sqt重組體。將野生型或age-1(hx546)雄體交配為sqt-1(sc13)age-1(mg44)雌雄同體。在25℃將雜交后代挑到獨(dú)立的平板，并且3天后記錄F2子代。為進(jìn)行遺傳作圖，從age-1(hx546)/sqt-1(sc13)1in-9(n333)雌雄同體挑出重組體。在25℃下，就不能母本互補(bǔ)age-1(m333)而形成持久方面測試重組體。*這些蟲的1％形成持久幼蟲，而20％成為不育的成體。
age-1定位的1.2圖單位sqt-1 lin-29區(qū)間由4個(gè)重疊群上大約700kb的DNA組成(Gottlieb,S.和Ruvkun,G.,Genetics 137:107-120(1994))。在該區(qū)域內(nèi)通過用5個(gè)小染色體Ⅱ缺陷，將物理圖譜和遺傳圖譜相關(guān)聯(lián)，在小染色體Ⅱ缺陷中某些互補(bǔ)age-1中的突變，而某些不能互補(bǔ)。age-1被確定位于粘粒C24F2的右側(cè)或在粘粒C24F2上，因?yàn)椴荒芑パa(bǔ)sqt-1，但互補(bǔ)age-1的mnDf75、mnDf76和mnDf86缺陷有粘粒C24F2可檢測的斷裂點(diǎn)(圖2A)。通過用PCR將age-1物理定位到克隆標(biāo)記kin-6(它位于粘粒C46F8上)的左側(cè)，以確定mnDf90(不能互補(bǔ)sqt-1和age-1的缺陷)純合的死卵包含kin-6的DNA，反之它們?nèi)笔qt-1(圖2A)。這些缺陷將age-1定位在粘粒C24F2和C46F8之間的大約240kb區(qū)間。在DNA印跡上采用來自該區(qū)間的粘粒作為探針，我們搜尋了與age-1(mg55)γ射線誘導(dǎo)的等位基因相關(guān)的斷裂點(diǎn)。因?yàn)閍ge-1(mg44)在遺傳雜交中顯示與染色體Ⅰ擬連鎖(Gottlieb,S.和Ruvkun,G.,Genetics 137:107-120(1994)),懷疑該等位基因與易位相關(guān)，并且是顯示age-1中斷裂點(diǎn)的最佳推測的候選等位基因。來自粘粒B0334的探針和來自重疊B0334最右邊區(qū)域的基因組克隆的探針檢測到age-1(mg55)/mnCl中的一個(gè)新斷裂點(diǎn)，但是在攜帶同一mnCl平衡染色體的對照DNA中沒有檢測到(圖2B和2C)。
C.elegans基因組項(xiàng)目(Sulston,J.等，Nature 356:37-41(1992)已測定了粘粒B0334的序列。在檢測到age-1(mg55)斷裂點(diǎn)的4kb區(qū)的DNA序列分析揭示了顯示與哺乳動物磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-激酶)p110催化亞基最后88個(gè)氨基酸有強(qiáng)的序列一致性的2個(gè)假定的外顯子(Hiles,I.D.等，Cell70:419-429(1992))。C.elegans基因組項(xiàng)目在粘粒或噬菌體中沒有克隆到預(yù)期包含其余age-1的B0334右邊的區(qū)域，并且用逆轉(zhuǎn)錄RNA的錨式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)分離和測定age-1編碼區(qū)的序列(圖2C)。為了證實(shí)age-1的剪接形式，與預(yù)期的剪切點(diǎn)的基因測序一起使用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RTPCR)。通過測定對應(yīng)于該預(yù)期編碼序列的基因組片段的序列，進(jìn)一步證實(shí)通過cDNA克隆和錨式PCR預(yù)期的序列。因?yàn)?個(gè)獨(dú)立的cDNA克隆終止于相互之間的30個(gè)堿基對內(nèi)，并且因?yàn)檫@些克隆編碼與哺乳動物p110(參見以下)共同延伸的蛋白，我們總結(jié)出裝配的age-1 cDNA可能是完整的。C.elegansage-1 cDNA的核酸序列顯示在圖4。
age-1 DNA序列的分析揭示1185個(gè)氨基酸的開放閱讀框架。age-1開放閱讀框架帶有4個(gè)框內(nèi)蛋氨酸殘基，它們是潛在的翻譯起始位點(diǎn)。而第二個(gè)蛋氨酸顯示與C.elegans翻譯開始共有序列比較匹配，Kozak翻譯起始規(guī)則偏愛mRNA中的第一個(gè)蛋氨酸(Kozak,M.,Nucleic Acids Research15:8125-8132(1987)；Kozak,M.,Proc.Natl.Acad.Sci.92:2662-2666(1995)；Krause,M.載于Caenorhabditis elegans Modern Biological Analysis of anOrganism中(Epstein,H.F.和Shakes,D.C.編輯)483-512(SanDiego,CA,1995))。從第一起始密碼子計(jì)數(shù)，預(yù)期age-1編碼1146個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(圖3和6)。從4個(gè)age-1 EMS-誘導(dǎo)的等位基因m333、mg44、mg109和hx546中，測定編碼該蛋白的age-1基因組區(qū)，揭示在從3個(gè)age-1等位基因分離的DNA中在該編碼區(qū)內(nèi)G→A的點(diǎn)突變(從EMS誘變的預(yù)期的突變)(參見以下)。在age-1(hx546)編碼區(qū)3’UTR中沒有檢測到改變。因?yàn)樵撏蛔兲禺愋缘赜绊懩副綼ge-1活性，所以它可能位于尚未測序的側(cè)翼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)中。因此4個(gè)age-1突變mg55、m333、mg44和mg109影響該開放閱讀框架，保證它對age-1基因活性的分配。
AGE-1蛋白與哺乳動物磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3-激酶)p110催化亞基家族密切相關(guān)(Hiles,I.D.等，Cell 70:419-429(1992)；Kapeller R.和Cantley,L.C.,Bioessays 16:565-576(1994))。PI3-激酶產(chǎn)生一個(gè)膜定位信號分子磷脂酰肌醇P3(PIP3)(Riddle,D.L.載于The Dauer Larva in The Nematode Caenorhabditis elegans(Wood,W.B.編輯)393-412(Cold Spring Harbor,NY,1988)中；Williams,C.M.,Biol.Bull.103:120-138(1952)；Riddle,D.L.等，Nature290:668-671(1981))，它被認(rèn)為是來自上游受體至尚未知的效應(yīng)分子的傳導(dǎo)信號(Kapeller R.和Cantley,L.C.,Bioessays 16:565-576(1994))。有三種已知的PI3-激酶類型。α和βp110類型由調(diào)節(jié)性p85或p55亞基導(dǎo)向活化的受體激酶(Kapeller R.和Cantley,L.Cl,Booessays 16:565-576(1994))。這些調(diào)節(jié)亞基具有識別那些受體和其它蛋白上的磷酸化酪氨酸的SH2域(Kapeller R.和Cantley,L.C.,Bioessays 16:565-576(1994)；Liscovitch,M.和Cantley,L.C.,Cell 81:659-662(1995)；Carpenter,C.L.等，Molecular andCellualar Biology 13:1657-65(1993)；Dhand,R.等，EMBO Journal13:511-21(1994)；Pons,S.等，Molecular and Cellular Biology15:4453-65(1995))。p110α或p1210β型通過它們的N-末端130個(gè)氨基酸與p85結(jié)合(Kapeller R.和Cantley,L.C.,Bioessays 16:565-576(1994)；Liscovitch,M.和Cantley,L.C.,Cell 81:659-662(1995)；Carpenter,C.L.等，Molecular and CellualarBiology 13:1657-65(1993))。p110α可以磷酸化p85亞基和脂質(zhì)(Carpenter,C.L.等，Molecular and Cellualar Biology 13:1657-65(1993)；Dhand,R.等，EMBO Journal 13:511-21(1994))；因此PI3-激酶也可以通過蛋白激酶級聯(lián)傳導(dǎo)信號。p110亞基的第三種類型p110γ與異三聚體的G-蛋白結(jié)合，并且可推測直接與蛇根堿受體偶聯(lián)(Stoyanov,B.等，Science 269:690-3(1995))。
Gap和Blast分析(Wisconsin軟件包的程序手冊，版本8,1994年9月，Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711)表明，AGE-1與小鼠p110α有29.6％相同，與人p110β有29.8％相同，而與人p110γ有28.0％相同。AGE-1的大區(qū)段顯示與該激酶中的p110 PI-3激酶蛋白和脂質(zhì)激酶中保守的上游域的序列一致性多達(dá)42％(圖3和5)。AGE-1與p110蛋白在介導(dǎo)p110α和β與p85相互作用的N-末端130個(gè)氨基酸中(Dhand,R.等，EMBOJournal 13:511-21(1994))的比較顯示，在該區(qū)域中AGE-1與p110α(22.0％的一致性)比與p110β(17.1％的一致性)或p110γ(9.8％的一致性)更相關(guān)。在該區(qū)域中，在AGE-1和p110α之間保守的許多氨基酸殘基在p110α和p110β之間也是保守的，它們在該區(qū)域享有45％的氨基酸一致性(圖3)。AGE-1與這些p110α激酶序列對齊(aligment)的隨機(jī)可能性是極低的對于p110α是e-113，對于p110β是e-101，而對于p110γ是e-93(與它比較，例如與PI4-激酶的隨機(jī)對齊的可能性是e-22或?qū)NA修復(fù)激酶為e-8)。在AGE-1中保守的區(qū)域提示，該蛋白可能與p85樣蛋氨酸激酶接合體偶聯(lián)，而不是與Gβγ樣接合體蛋白偶聯(lián)。然而，在這整個(gè)蛋白上，小鼠p110α更類似于其它哺乳動物p110類，而不是AGE-1(小鼠p110α與人p110β有42.0％相同，而與人p110γ有34.5％相同，與之比較，與AGE-1有30.1％相同)，提示AGE-1可能是分支的PI3-激酶類。
age-1母本作用持久組成型突變可能是無效的等位基因。age-1(mg44)是在激酶區(qū)和大多數(shù)保守域上游截?cái)郃GE-1的Trp405Amber突變(圖3)。該突變是限定age-1無效表型的好的候選物。age-1(m333)突變也是在大多數(shù)保守區(qū)上游截?cái)郃GE-1蛋白的Trp6590pal，并且也可能是無效的等位基因。age-1(mg55)斷裂點(diǎn)從AGE-1蛋白和age-13’UTR除去該激酶域的C末端部分(圖2A)。age-1(mg109)導(dǎo)致在AGE-1和哺乳動物PI3-激酶中保守的蛋白區(qū)中的Ala845Thr取代(圖3)。在該位置，AGE-l和哺乳動物p110α都有Ala，而p110β和γ在該位置有Lys(圖3)。age-1(mg109)表型的高度保守和嚴(yán)格性提示該區(qū)在AGE-1中執(zhí)行必需功能。
所有這些age-1等位基因，包括那些預(yù)期截?cái)嘣揂GE-1蛋白的age-1等位基因，顯示可由野生型母本基因活性拯救的持久組成型表型。另外，當(dāng)提供母本的而不是合子的age-1基因活性時(shí)，age-1(m333)等位基因(它可能是一個(gè)無效的等位基因)顯示壽命明顯增加(Larsen,P.L.等，Genetics 139:1567-1583(1995))。這些數(shù)據(jù)表明，AGE-1PI 3-激酶同系物在控制持久發(fā)育停滯和衰老的特定信號途徑中起作用，并且與更普通的AGE-1需要不一致。另外，這表明母本AGE-1介導(dǎo)的磷脂酰肌醇信號足以拯救合子AGE-1信號的缺乏，以在持久期停滯，而不是降低衰老。因?yàn)樵赼ge-1(hx456)中，減少母本AGE-1磷脂酰肌醇信號也導(dǎo)致壽命增加，這些數(shù)據(jù)提示正常的衰老依賴于來自母本AGE-1和合子AGE-1的磷脂酰肌醇信號。
AGE-1與哺乳動物PI3-激酶享有的強(qiáng)的序列相似性提示PIP3信號可能在調(diào)節(jié)持久發(fā)育和衰老中起作用的種種可能的作用。在哺乳動物中，PI3-激酶信號和神經(jīng)的發(fā)育以及激素信號有關(guān)。PI3-激酶抑制劑渥曼青霉素抑制來自PC12細(xì)胞中的Trk激酶受體和神經(jīng)突突起的神經(jīng)生長因子信號(Kimura,K.等，J.Biol.Chem 269:18961-7(1994)；Yao,R.和Cooper,G.M.,Science 267:2003-6(1995))。PI3-激酶也和肥大細(xì)胞的組胺分泌有關(guān)(Yano,H.等，J.Biol.Chem.268:25846-25856(1993))，并且與代謝控制激素胰島素下游的信號傳導(dǎo)有關(guān)(Levy-Toledano,R.等，J.Biol.Chem 269:31178-31182(1994))。因此，在神經(jīng)內(nèi)分泌途徑中可能需要的許多步驟上PI3-激酶功能有先例，這些步驟包括神經(jīng)元和靶組織的發(fā)育和分化、分泌事件以及在靶組織中的信號傳導(dǎo)。
AGE-1-介導(dǎo)的PIP3信號能在該持久神經(jīng)分泌途徑中或在該途徑的信息素信號傳導(dǎo)中起作用。遺傳上位性分析提示，age-1可能在daf基因的下游起作用，daf基因參與該持久信息素信號的感覺加工(sensory processing)，例如參與分泌神經(jīng)元或靶組織的發(fā)育或功能(Gottlieb,S.和Ruvkun,G.,Genetics 137:107-120(1994))。age-1無效突變體的持久停滯由母本拯救的觀察與早期age-1作用一致。在L1期通常檢測到持久信息素(Riddle,D.L.The Dauer Larva in TheNematode Caenorhabditis elegans.(Wood,W.B.編輯)393-412(ColdSpring Harbor,NY,1988))，提示如果在信息素信號傳導(dǎo)中由母本提供AGE-1功能，則age-1mRNA、蛋白質(zhì)或磷脂酰肌醇信號本身必須從胚系持續(xù)至該期。如果age-1介導(dǎo)該途徑的發(fā)育，則預(yù)期神經(jīng)元和靶組織可能在持久神經(jīng)內(nèi)分泌途徑起作用，而age-1在胚胎發(fā)生中起作用。
age-1突變體的壽命表型提示在衰老中磷脂酰肌醇的直接功能。age-1基因活性的破壞使得在持久入口缺乏的情況下壽命長，提示這些突變體的壽命不是簡單的持久入口的影響。更有可能的是，PI3-激酶活性的降低觸發(fā)一個(gè)子集的持久程序，包括衰老速率的降低，但不包括停滯發(fā)育。有氧代謝的自由基副產(chǎn)品已提示通過直接破壞包括DNA、蛋白質(zhì)和脂肪在內(nèi)的各種必需分子而導(dǎo)致衰老(Finch,C.E.,Longevity,Senescence,and the Genome(Chicago,IL,1990))。如果來自AGE-1的磷脂酰肌醇信號正常地調(diào)節(jié)自由基的水平，那么在突變體或持久幼蟲中降低age-1基因活性，可以導(dǎo)致壽命增加。實(shí)際上，age-1突變體和持久幼蟲顯示過氧化氫酶和超氧化物歧化酶水平增加，以及對產(chǎn)生自由基的藥物和治療有抗性(Larsen,P.,Proc.Natl.Acad.Sci.90:8905-8909(1993)；VanFleteren,J.R.,Biochem.J.292:605-608(1993))。有趣的是，在被哺乳動物中性粒細(xì)胞殺傷的細(xì)菌中，在超氧化物自由基的產(chǎn)生中需要渥曼青霉素敏感的PI 3-激酶(Okada,T.等，J.Biol.Chem.269:3563-3567(1994)；Thelen,M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.91:4960-4(1994))。
age-1鑒別為PI3-激酶提示，在該持久遺傳途徑中的其它基因可以在體內(nèi)鑒別PIP3信號的下游靶。daf-2在持久和衰老上位性途徑中在與age-1相同的點(diǎn)起作用(Vowels,J.J.和Thomas,J.H.,Genetics130:105-123(1992)；Gottlieb,S.和Ruvkun,G.,Genetics137:107-120(1994)；Kenyon,C.等，Nature 366:461-464(1993)；Larsen,P.L.等，Genetics 139:1567-1583(1995)；Dorman,J.B.等，Genetics 141:1399(1995))。DAF-2可能是PIP3,信號(諸如p85或p55的PI 3-激酶調(diào)節(jié)亞基)的下游正調(diào)節(jié)靶或上游受體。已經(jīng)用生化方法檢測了PIP3信號的正調(diào)節(jié)下游靶的候選物(Liscovitch和L.C.Cantley,L.,Cell 77:324-34(1994)；Toker,A.等，The Journalof Bio1ogical Chemistry 269:32358-67(1994)；Akimoto,K.等，The EMBO Journal 15:788-798(1996)；Jones,P.F.等，Proc.Natl.Acad Sci.80:4171-5(1991)；Franke,T.F.等，Cell 81:727-736(1995)；Burgering,B.M.T.和Coffer,P.J.,Nature376:599-602(1995))；通過檢測daf基因類似物可能確認(rèn)這類候選物的體內(nèi)功能。用生化方法尚未檢測到PIP3信號的負(fù)調(diào)節(jié)靶。遺傳數(shù)據(jù)表明，daf-16可能是PIP3信號的負(fù)調(diào)節(jié)靶；daf-16中的突變抑制在我們這里討論的由于喪失PIP3信號產(chǎn)生的age-1突變體壽命的增加和在持久期的停滯(Vowels,J.J.和Thomas,J.H.,Genetics130:105-123(1992)；Gottlieb,S.和Ruvkum,G.,Genetics137:107-120(1994)；Kenyon,C.等，Nature 366:461-464(1993)；Larsen,P.L.等，Genetics 139:1567-1583(1995)；Dorman,J.B.等，Genetics 141:1399(1995))。這些觀察提示，在非停滯的正常衰老生長的條件下，AGE-1的小膜結(jié)合PIP3產(chǎn)物負(fù)調(diào)節(jié)DAF-16活性以控制c.elegans的壽命。哺乳動物AGE-1多肽的克隆在我們分離新AGE-1基因和cDNA的基礎(chǔ)上，用本文描述的序列和標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離另外的哺乳動物AGE-1核酸序列(包括人AGE-1)成為可能。特別是，用全部的或部分的AGE-1序列，人們可以容易地設(shè)計(jì)AGE-1寡核苷酸探針，包括簡并的寡核苷酸探針(即為所有可能的給定氨基酸序列的編碼序列的混合物)。這些寡核苷酸可以基于該DNA的任一條鏈的序列。分離哺乳動物AGE-1序列的典型探針或引物最好對應(yīng)于氨基酸的保守區(qū)組(block)，例如，圖6(SEQ ID NO:1)的氨基酸852-864(IFKNGDDLRQDML)(SEQ ID NO:13)或氨基酸1111-1116(HIDFGH)(SEQ IDNO:14)。例如在Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology,1996,Wiley and Sons，紐約，NY；和Guide to MolecularCloning Techniques,1987,S.L.Berger和A.R.Kimmel編輯，Academic Press,New York中，提供了設(shè)計(jì)和制備這類探針的一般方法。這些寡核苷酸可用于AGE-1基因分離，或者將它們用作與AGE-1互補(bǔ)序列雜交的探針，或作為各種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)克隆策略的引物。如果利用PCR方法，可選地設(shè)計(jì)所述引物，以允許將擴(kuò)增的產(chǎn)物克隆入適當(dāng)?shù)妮d體。
雜交技術(shù)和方法對那些本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，并且已經(jīng)例如在Ausubel等，同上，和Guide to Molecular Cloning Techniques,同上進(jìn)行了描述。如果需要，可以將不同的寡核苷酸探針的組合物用于重組DNA文庫的篩選。用本領(lǐng)域已知的方法將寡核苷酸例如用32P標(biāo)記，并且用可檢測標(biāo)記的寡核苷酸探測來自重組DNA文庫的濾膜影印物。可以按照本領(lǐng)域已知的方法，如Ausubel等(同上)描述的方法，制備重組DNA文庫(例如，人cDNA文庫)，或可以從商業(yè)來源獲得。
為了檢測或分離密切相關(guān)的AGE-1序列，可以使用高嚴(yán)格性雜交條件；這類條件包括在大約42℃和大約50％甲酰胺下雜交；第一次洗滌在大約65℃、大約2×SSC和1％SDS下進(jìn)行；接著在大約65℃和大約0.1％SDS、1×SSC下進(jìn)行第二次洗滌。本文描述的、檢測與AGE-1基因具有較少上位性的AGE-1基因的較低嚴(yán)格性條件包括，例如在大約42℃在缺失甲酰胺下雜交；在大約42℃、大約6×SSC和大約1％SDS下進(jìn)行第一次洗滌；并且在大約50℃、大約6×SSC和大約1％SDS下進(jìn)行第二次洗滌。
如以上討論，在PCR克隆策略中，可以將AGE-1寡核苷酸用作引物。這類PCR方法是本領(lǐng)域公知，并且例如在PCR Technology,H.A.Erlich編輯，Stockton Press,London,1989；PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications,M.A.Innis,D.H.Gelfand,J.J.Sninsky和T.J.White編輯，Academic Press,Inc.，紐約，1990；和Ausubel等，同上中進(jìn)行了描述。此外，最好是將對應(yīng)于AGE-1序列中保守區(qū)的序列(例如，以上描述的那些區(qū)域)用來分離哺乳動物AGE-1序列。AGE-1多肽的表達(dá)通常，可以通過用適當(dāng)表達(dá)載體中的全部或部分的AGE-1編碼cDNA片段(如，以上描述的cDNA的一個(gè))轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，產(chǎn)生按照本發(fā)明的AGE-1多肽。
那些分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員會理解，可以將任何種類繁多的表達(dá)系統(tǒng)用于提供該重組蛋白。所用的準(zhǔn)確的宿主細(xì)胞對于本發(fā)明不是決定性的?？梢栽谠松锼拗?如，大腸桿菌)中，或在真核生物宿主(如，釀酒酵母；昆蟲細(xì)胞，如Sf9或Sf21細(xì)胞；或哺乳動物細(xì)胞，如COS1、NIH 3T3或HeLa細(xì)胞)中產(chǎn)生該AGE-1多肽?？蓮膹V泛的來源獲得這類細(xì)胞(如美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockland,MD；也可參見如Ausubel等，同上)。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的方法和表達(dá)載體的選擇將取決于選擇的宿主系統(tǒng)。如Ausubel等(同上)中描述了轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的方法；可以從如Cloning Vectors:A Laboratory Manual(P.H.Pouwels等，1985，增刊，1987)中提供的載體中選擇表達(dá)載體。
一個(gè)推薦的表達(dá)系統(tǒng)是桿狀病毒系統(tǒng)(例如，用Sf9細(xì)胞和Ausubel等(同上)的方法)。另一桿狀病毒系統(tǒng)利用載體pBacPAK9并可從Clontech(Palo Alto,CA)獲得。
或者，例如用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的哺乳動物細(xì)胞系，在哺乳動物系統(tǒng)中產(chǎn)生AGE-1多肽。公眾可獲得適用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞的多種載體，如參見Pouwels等，同上；構(gòu)建這類細(xì)胞系的方法也是公眾可獲得的，如在Ausubel等，同上中。在一個(gè)實(shí)施例中，將編碼AGE-1蛋白的cDNA克隆到包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因的表達(dá)載體中。通過在細(xì)胞培養(yǎng)基中包含0.01-300μM的氨甲喋呤，選擇整合到宿主細(xì)胞染色體的該質(zhì)粒，并因此選擇整合到宿主細(xì)胞染色體的該AGE-1蛋白編碼基因(如在Ausubel等同上中描述的方法)。可以在大多數(shù)細(xì)胞類型中完成該顯性選擇?？梢酝ㄟ^DHFR-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染基因的擴(kuò)增，增加重組蛋白的表達(dá)。在Ausubel等(同上)中描述了攜帶基因擴(kuò)增物的選擇細(xì)胞系的方法；這些方法通常涉及在含逐漸增加的氨甲喋呤水平的培養(yǎng)基中時(shí)間延長的培養(yǎng)。通常用于該目的的含DHFR的表達(dá)載體包括pCVSEⅡ-DHFR和pAdD26SV(A)(在Ausubel等，(同上)中描述)。在宿主細(xì)胞中，以上描述的任何宿主細(xì)胞或最好是DHFR-缺陷型CHO細(xì)胞系(如CHO DHFR-細(xì)胞，ATCC登記號為CRL9096)推薦用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的DHFR選擇或DHFR-介導(dǎo)的基因擴(kuò)增。
在其它可選擇的方法中，在體內(nèi)或最好是在體外用T7系統(tǒng)產(chǎn)生該AGE-1多肽(參見例如Ausubel等(同上)或其它標(biāo)準(zhǔn)技術(shù))。
一旦表達(dá)了重組AGE-1蛋白，則用親和層析分離AGE-1蛋白。在一個(gè)實(shí)施例中，可以將抗AGE-1蛋白抗體(如按本文描述產(chǎn)生的)結(jié)合于柱子上并用于分離AGE-1蛋白。在親和層析前，可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法裂解和分級分離包含AGE-1蛋白的細(xì)胞(參見如Ausubel等，同上)。
一旦分離該重組蛋白，如果需要，可以例如通過高效液相層析(參見例如Fisher,Laboratory Techniques In Biochemistry AndMolecular Biology，編輯，Work and Burdon,Elsevier,1980)將該重組蛋白進(jìn)一步純化。
可以通過化學(xué)合成產(chǎn)生本發(fā)明的多肽，特別是短的AGE-1多肽片段(如通過在Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，1984 ThePierce Chemical Co.,Rockford,IL中描述的方法)。
可以將多肽表達(dá)和純化的這些一般技術(shù)用于產(chǎn)生和分離有用的AGE-1片段和類似物(本文描述的)。抗AGE-1抗體用以上描述的AGE-1多肽，如以下方法產(chǎn)生抗AGE-1抗體。將編碼氨基酸1089-1164的AGE-1 cDNA片段與GST融合，并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在大腸桿菌中生產(chǎn)融合的蛋白。然后也通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在谷胱甘肽柱上純化融合蛋白，并用于免疫兔子。然后將獲得的抗血清本身通過Finney和Ruvkun(Cell 63:895-905,1990)的方法在GST-AGE-1親和柱上純化。蛋白質(zhì)印跡顯示，該抗血清特異性地鑒別GST-AGE-1。
可以通過這種或替代技術(shù)產(chǎn)生其它AGE-1-特異性抗體。例如，可以將本文描述的AGE-1多肽(或免疫原性片斷或類似物)用于產(chǎn)生其它多克隆抗血清或單克隆抗體；AGE-1的氨基酸550至965代表一個(gè)特別供選擇的免疫原性片段。通過重組技術(shù)或肽合成技術(shù)產(chǎn)生用于抗體生產(chǎn)的多肽(參見例如Solid Phase Synthesis,同上；Ausubel等，同上)。
對于多克隆抗血清，如果需要，可以將所述的肽與諸如Ausubel等(同上)描述的KLH之類的載體蛋白偶聯(lián)。將該KLH-肽與弗氏佐劑混合，并注射到豚鼠、大鼠或最好是兔子體內(nèi)?？梢酝ㄟ^任何肽抗原親和層析的方法純化抗體。
或者，可以用AGE-1多肽(或免疫原性片段或類似物)和標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)(例如參見Kohler等，Nature 256:495,1975；Kohler等，Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等，Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等，Monclone Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,NY,1981；Ausubel等，同上)制備單克隆抗體。
一旦產(chǎn)生多克隆抗體或單克隆抗體，則通過蛋白質(zhì)印跡或免疫沉淀分析(通過在Ausubel等，同上中描述的方法)，測試多克隆抗體或單克隆抗體的特異性AGE-1識別。特異性地識別AGE-1的抗體被認(rèn)為是在本發(fā)明中有用的抗體；這類抗體可以用于例如測定或監(jiān)測哺乳動物產(chǎn)生的AGE-1水平的免疫分析，或篩選調(diào)制AGE-1產(chǎn)生的化合物的免疫分析。也可以將抗AGE-1抗體用于鑒別表達(dá)該AGE-1基因的細(xì)胞。
從AGE-1無義等位基因m333和mg44(以上描述)獲得的樣品為抗血清特異性提供有用的陰性對照。調(diào)制AGE-1表達(dá)或活性的分子的鑒定和給予AGE-1 cDNA的分離和它與衰老進(jìn)程相關(guān)的知識也促進(jìn)了降低AGE-1表達(dá)或活性的分子(即AGE-1拮抗劑)的鑒定。按照一種方法，在向AGE-1-表達(dá)細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入拮抗分子后測定AGE-1表達(dá)。或者，可以將候選拮抗劑直接給予動物(例如線蟲或小鼠)并用于篩選拮抗劑。
然后，例如通過標(biāo)準(zhǔn)的RNA印跡分析(Ausubel等，同上)，用AGE-1核酸(或片段)作為雜交探針測定AGE-1的表達(dá)。將在存在候選物分子時(shí)的AGE-1表達(dá)水平與對在相同培養(yǎng)基或測試動物中的相同細(xì)胞、但在缺乏候選物分子時(shí)測定的水平比較。推薦的用于抗衰老的調(diào)制劑是那些導(dǎo)致AGE-1表達(dá)降低的調(diào)制劑。
或者，用同樣的一般途徑與標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)檢測技術(shù)的組合(如蛋白質(zhì)印跡或與AGE-1-特異性抗體(例如本文描述的AGE-1抗體)的免疫沉淀)，在AGE-1蛋白產(chǎn)生水平測定候選調(diào)制劑對表達(dá)的影響。此外，有用的抗衰老調(diào)制劑鑒定為那些導(dǎo)致AGE-1多肽產(chǎn)生降低的調(diào)制劑。
候選調(diào)制劑將可以是純化的(或基本純化的)分子，或可以是化合物混合物(如得自細(xì)胞的抽提物或上清液)的一個(gè)成分。在混合的化合物的分析中，針對逐步縮小的候選化合物庫(如通過諸如HPLC或FPLC的標(biāo)準(zhǔn)純化技術(shù)產(chǎn)生的；Ausubel等，同上)測試AGE-1表達(dá)，直至證明單個(gè)的化合物或最少的化合物混合物調(diào)制AGE-1表達(dá)。
或者，或另外，可以篩選那些拮抗天然的或重組AGE-1活性的候選化合物。在推薦的方法中，將存在候選化合物時(shí)或用候選化合物處理后的激酶活性(例如PI3-激酶活性)與在等同條件下缺乏該化合物時(shí)的活性比較。此外，這種篩選可以用候選化合物庫開始，從中以分步方式分離一個(gè)或多個(gè)有用的調(diào)制劑化合物。
通過任何標(biāo)準(zhǔn)測定可以測定激酶活性，例如可以通過在TLC平板上監(jiān)測該酶將32P-ATP轉(zhuǎn)移至PIP底物的能力(如例如由Whitman等，Nature322:644-646,1988描述的)測定激酶活性，或可以通過Kimura等(J.Biol.Chem.269:18961-18967,1994)的方法測定激酶活性。如果需要，在分析活性前，例如通過與AGE-1-特異性抗體的免疫沉淀，可以從樣品中分離該酶。本文描述的AGE-1突變體(例如mg44、m333和mg109)在這些體外測定中已降低活性，并且可以作為對照樣品使用。
候選AGE-1拮抗劑包括肽和非肽分子(如例如在細(xì)胞抽提物、哺乳動物血清或已培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的生長培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)的肽或非肽分子)。因?yàn)樽羁赡艿腁GE-1底物是PIP2及其產(chǎn)物PIP3，所以模擬PIP2和PIP3之間轉(zhuǎn)換狀態(tài)的藥物(所謂的轉(zhuǎn)換類似物)是下調(diào)AGE-1-介導(dǎo)的PIP3合成并且因此增加壽命的好候選物。因?yàn)锳GE-1底物和產(chǎn)物均是膜結(jié)合分子，所以干擾AGE-1作用的藥物可以是疏水性的、降低或消除通常與膜通透性有關(guān)的問題。
可以證實(shí)發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞AGE-1表達(dá)或活性水平上有效的拮抗劑在動物模型(例如線蟲或小鼠)中有用。
促進(jìn)AGE-1表達(dá)降低或AGE-1活性降低的分子被認(rèn)為在本發(fā)明中特別有用；可以將這種分子用作例如降低天然的細(xì)胞AGE-1水平或活性并因此增加該宿主動物(例如人)的壽命的治療。
可以將治療用的AGE-1拮抗劑與藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑以單位劑量形式混合?？梢允褂贸Ｒ?guī)的藥學(xué)規(guī)程以提供給予病人AGE-1的適當(dāng)?shù)闹苿┗蚪M合物。雖然最好是靜脈注射，但是可以采用任何合適的給藥途徑，例如胃腸外、皮下、肌內(nèi)、顱內(nèi)、眼眶內(nèi)、眼、心室內(nèi)、囊內(nèi)、脊柱內(nèi)、腦池內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、氣霧劑或口服給予。治療制劑可以為液體溶液或懸液的形式；對于口服給藥，制劑可以為片劑或膠囊形式；而對于鼻內(nèi)制劑，可以為散劑、滴鼻劑或氣霧劑形式。
在例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences.”中可找到制備制劑的本領(lǐng)域公知的方法。胃腸外給藥的制劑可以包含例如賦形劑、無菌水或鹽水、諸如聚乙二醇的聚烷二醇、植物來源的油或氫化萘?？梢允褂蒙锵嗳莸摹⑸锟山到獾谋货ゾ酆衔?、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物以控制所述化合物的釋放。AGE-1拮抗劑的其它潛在有用的胃腸外傳遞系統(tǒng)包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物顆粒、滲透泵、可移植灌注系統(tǒng)和脂質(zhì)體。吸入制劑可以包含諸如乳糖的賦形劑，或可以是含例如聚氧乙烯-9-月桂醚、甘膽酸鹽和脫氧膽酸鹽的水溶液，或可以是以滴鼻劑或凝膠形式給予的油性溶液。
如果需要，可以將采用AGE-1拮抗劑的治療與任何其它抗衰老治療聯(lián)合應(yīng)用。AGE-1殺蟲劑也可以將AGE-1拮抗劑用作新的殺蟲劑，例如以控制昆蟲或線蟲。因?yàn)锳GE-1控制滯育，可以將拮抗其作用的化合物用于不合時(shí)宜地觸發(fā)滯育，伴隨進(jìn)食行為和繁殖的中止(Tauber等，SeasonalAdaptation of Insects,1986,New York,NY,Oxford UniversityPress，第411頁)。這類以無脊椎動物滯育事件為靶的殺蟲劑對于增加農(nóng)業(yè)產(chǎn)量是有用的，同時(shí)對人類健康的危害比通?；谏窠?jīng)遞質(zhì)的殺蟲劑更小。壽命的測定由于AGE-1多肽和核酸序列在衰老中的作用，因此它們對于測定有機(jī)體(例如人)壽命是有用的。特別是，因?yàn)榻档虯GE-1與增加壽命相關(guān)，AGE-1產(chǎn)生水平或活性的降低提供宿主有機(jī)體衰老將更緩慢或壽命增加的指示?？梢酝ㄟ^任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分析AGE-1表達(dá)或其活性的水平。
例如，可以通過標(biāo)準(zhǔn)RNA印跡分析監(jiān)測生物學(xué)樣品中的表達(dá)，或可以通過PCR幫助監(jiān)測(例如參見Ausubel等，同上；PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification，編輯，H.A.Ehrlich,Stckton Press,NY)。
或者，可以將免疫測定用于檢測或監(jiān)測AGE-1蛋白水平?？梢詫GE-1特異性的多克隆或單克隆抗體(如以上描述產(chǎn)生的)用于任何標(biāo)準(zhǔn)的免疫測定程式(如ELISA、蛋白質(zhì)印跡或RIA測定)，以測定AGE-1多肽水平；再與野生型AGE-1水平比較，而AGE-1產(chǎn)生的降低是壽命增加的指示。如在Ausubel等，同上中描述了免疫測定的實(shí)例。免疫組化技術(shù)也可以用于AGE-1檢測。例如，可以從個(gè)體獲得組織樣品，用抗AGE-1抗體和任何標(biāo)準(zhǔn)檢測系統(tǒng)(如包括與辣根過氧化物酶結(jié)合的二級抗體的檢測系統(tǒng))將切片染色，以檢測AGE-1的存在。在如Bancroft和Stevens,Theory and Practice of HistologicalTechniques,Churchill Livingstone,1982和Ausubel等，同上中可以找到與這類技術(shù)有關(guān)的一般指導(dǎo)。
錯(cuò)配檢測分析也提供檢測AGE-1突變并因此測定壽命的機(jī)會。可以將該類型的方法用于在產(chǎn)前篩選中檢測AGE-1變異。
最后，可以使用聯(lián)合方法，以評價(jià)AGE-1蛋白產(chǎn)生(例如通過免疫學(xué)技術(shù))開始，并且也包括設(shè)計(jì)來鑒別更多細(xì)微AGE-1突變(例如點(diǎn)突變)的基于核酸的檢測技術(shù)。對于那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，可以應(yīng)用多種標(biāo)準(zhǔn)的錯(cuò)配檢測分析，并且可以使用任何推薦的技術(shù)。通過該方法，可以檢測在AGE-1中或者導(dǎo)致AGE-1表達(dá)喪失或者AGE-1生物學(xué)活性喪失的突變。在該聯(lián)合方法的變化中，用任何適當(dāng)?shù)募っ阜治鱿到y(tǒng)(如Whitman等，Nature 322:644-646(1988)；或Kimura等，J.Biol.Chem.269:18961-18967(1994)的分析)測定作為激酶活性的AGE-1活性(而不是產(chǎn)生)。AGE-1互作多肽AGE-1序列的分離也促進(jìn)與該AGE-1蛋白互作的多肽的鑒定。通過任何標(biāo)準(zhǔn)的雙雜種系統(tǒng)分離編碼這類多肽的序列(例如參見Fields等，Nature 340:245-246(1989)；Yang等，Sciences 257:680-682(1992)；Zervos等，Cell 72:223-232(1993))。例如，可以將全部或部分的該AGE-1序列融合到DNA結(jié)合域(如GAL4或LexA DNA結(jié)合域)。確定該融合蛋白本身不激活攜帶適當(dāng)?shù)腄NA結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)道基因(例如lacZ或LEU2報(bào)道基因)的表達(dá)后，將該融合蛋白用作相互作用靶。然后將與激活域(例如酸性激活域)融合的候選互作蛋白與AGE-1融合物在宿主細(xì)胞中共表達(dá)，并且通過其接觸AGE-1序列并刺激報(bào)道基因表達(dá)的能力鑒別互作蛋白。通過用與相同激活域融合的非相關(guān)測試蛋白(或，如果需要，為更多組的這類測試者蛋白)實(shí)施對照實(shí)驗(yàn)，消除假陽性相互作用。
一旦鑒別了AGE-1蛋白-蛋白的相互作用，可以篩選破壞該相互作用的化合物。這些化合物為AGE-1拮抗劑提供好候選物，并且可以通過任何以上描述的方法測試和證實(shí)?？梢詫⑼ㄟ^該方法鑒別的化合物用于任何上述目的。
其它實(shí)施方案在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明包括與圖6(SEQ ID NO:1)的AGE-1多肽基本相同的任何蛋白；這類同系物包括基本純化的天然存在的其它哺乳動物AGE-1多肽(例如人AGE-1多肽)以及等位基因變異體；天然突變體；誘導(dǎo)的突變體；在高嚴(yán)格條件下，或其次的，在低嚴(yán)格條件下(如在2×SSC、40℃下洗滌，用長度至少為40個(gè)核苷酸的探針)由與圖4(SEQ ID NO:2)的AGE-1 DNA序列雜交的DNA編碼的蛋白；以及針對AGE-1多肽的抗血清特異性結(jié)合的蛋白。
本發(fā)明還包括任何天然存在的AGE-1多肽的類似物。類似物可以由于氨基酸序列的差異、由于翻譯后修飾或由于二者，而與天然存在的AGE-1蛋白不同。本發(fā)明的類似物通常會顯示與天然存在的AGE-1氨基酸序列的同一性至少為50％，更優(yōu)選為60％，而最優(yōu)選為85％或甚至95％。修飾包括多肽在體內(nèi)和在體外的化學(xué)衍生，如乙?；Ⅳ然?、磷酸化或糖基化；這類修飾可以發(fā)生在多肽合成或加工期間或用分離的修飾酶處理后。類似物也可以由于一級序列的改變而與天然存在的AGE-1多肽不同。這些包括天然的和誘導(dǎo)的(例如通過輻射或暴露于ethanemethylsulfate或通過Sambrook、Fritsch和Maniatis(Molecular C1oning:A Laboratory Manual(第二版)，CSH Press)或Ausubel等(同上)描述的位點(diǎn)特異性誘變導(dǎo)致隨機(jī)誘變產(chǎn)生的遺傳變異體。也包括包含諸如D-氨基酸的非L-氨基酸殘基、或諸如β或γ氨基酸的非天然存在的或合成的氨基酸的環(huán)化肽、分子和類似物。
除了全長多肽，本發(fā)明也包括AGE-1多肽片段。本文使用的術(shù)語“片段”指至少20個(gè)相鄰氨基酸，優(yōu)選至少30個(gè)相鄰氨基酸，更優(yōu)選至少50個(gè)相鄰氨基酸，而最優(yōu)選至少60至80個(gè)或更多的相鄰氨基酸?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法產(chǎn)生AGE-1多肽的片段，或可以從正常蛋白加工獲得(如從新生多肽中除去生物學(xué)活性不需要的氨基酸，或通過可選擇的RNA剪接或可選擇的蛋白質(zhì)加工事件除去氨基酸)。推薦的按照本發(fā)明的片段包括但不限于圖6(SEQ ID NO:1)的氨基酸387-641、387-1146、1-130、1-150、1-658或1-404。
對于某些目的，可以將該AGE-1多肽的全部或部分序列與另一蛋白融合(例如通過重組方法)。在一個(gè)實(shí)施例中，可以將AGE-1與綠熒光蛋白GFP(Chalfie等，Sciences 263:802-805,1994)融合。這種融合蛋白對于例如體內(nèi)監(jiān)測用候選的或已知的拮抗劑處理后AGE-1表達(dá)水平(例如通過熒光顯微鏡)是有用的。
可以將本發(fā)明的方法用于測定任何動物(例如人、寵物或家畜)的壽命或篩選AGE-1調(diào)制化合物。當(dāng)處理或診斷非人類哺乳動物時(shí)，該AGE-1多肽、核酸或抗體最好是對該物種特異性的。
在本說明書中提到的全部出版物和專利申請通過引用結(jié)合到本文中，其程度就象具體地和分別表示每個(gè)獨(dú)立的出版物或?qū)＠暾埻ㄟ^引用結(jié)合到本文中一樣。
其它的實(shí)施方案在以下的權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1．基本純的AGE-1多肽或其片段制劑，所述多肽具有與圖6(SEQID NO:1)的多肽至少50％的氨基酸序列相同。
2．權(quán)利要求1的多肽，其中所述AGE-1多肽包括在相同位置上與圖6(SEQ ID NO:1)的以下氨基酸相同的氨基酸G1y-32、Leu-73、His-78、Phe-8、Glu-109、Phe-114、Leu-123、Leu-125、Phe-129、Lys-181、Ser-208、Lys-211、Arg-321、Leu-325、Leu-351、Ser-355、Met-373、Leu-381、Leu-393、Thr-432、Tyr-451、Glu-475、Pro-507、Ile-514、Gly-518、Glu-530、Val-538、Leu-582、Tyr-606、Pro-643、Phe-665、Leu-744、Leu-745、Arg-762、Leu-789、Arg-794、Ala-827、Arg-829、Trp-835、Ser-842、Asn-905、Gly-917、Asp-975、Ile-990、Asp-1006、His-1020、Lys-1104、Thr-1105、Gly-1130、Phe-1140和Lys-1144。
3．權(quán)利要求1的多肽，其中所述AGE-1多肽在等同的氨基酸827包括丙氨酸。
4．權(quán)利要求1的多肽，其中所述AGE-1得自動物。
5．權(quán)利要求4的多肽，其中所述動物是C.elegans。
6．權(quán)利要求4的多肽，其中所述動物是哺乳動物。
7．權(quán)利要求6的多肽，其中所述哺乳動物是人。
8．編碼權(quán)利要求1的AGE-1多肽的純化DNA。
9．包含AGE-1核酸序列的純化DNA，它與圖4(SEQ ID NO:2)核酸序列至少有30％相同。
10．包含AGE-1核酸序列的純化DNA，其中所述DNA序列選自與圖4(SEQ ID NO:2)的核苷酸64至852、核苷酸865至912、核苷酸919至975、核苷酸1003至3090、核苷酸3094至3501或核苷酸2620至2655基本相同的核酸序列。
11．包含權(quán)利要求8、9或10的純化AGE-1 DNA的載體。
12．包含權(quán)利要求8、9或10的純化AGE-1 DNA的細(xì)胞。
13．產(chǎn)生重組AGE-1多肽的方法，所述方法包含以下步驟(a)提供用權(quán)利要求8、9或10的DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，所述DNA編碼在所述細(xì)胞中表達(dá)定位的AGE-1多肽；(b)在表達(dá)所述DNA的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞；以及(c)分離所述重組AGE-1多肽。
14．按照權(quán)利要求13的方法產(chǎn)生的重組AGE-1多肽。
15．特異性地識別并與AGE-1多肽結(jié)合的基本純的抗體。
16．鑒定能降低AGE-1基因表達(dá)的AGE-1調(diào)制化合物的方法，所述方法包含以下步驟(a)提供表達(dá)權(quán)利要求8、9或10的AGE-1 DNA的細(xì)胞；以及(b)將所述細(xì)胞與候選化合物接觸，與所述候選化合物接觸后AGE-1表達(dá)的降低鑒定調(diào)制化合物。
17．鑒定能降低AGE-1活性的AGE-1調(diào)制化合物的方法，所述方法包含以下步驟(a)提供表達(dá)AGE-1多肽的細(xì)胞；和(b)將所述細(xì)胞與候選化合物接觸，與所述候選化合物接觸后AGE-1表達(dá)的降低鑒定調(diào)制化合物。
18．權(quán)利要求16或17的方法，其中所述AGE-1基因編碼與圖6(SEQ ID NO:1)顯示的氨基酸序列至少有50％相同的氨基酸序列，或AGE-1多肽包括與圖6(SEQ ID NO:1)顯示的氨基酸序列至少有50％相同的氨基酸序列。
19．權(quán)利要求16或17的方法，其中所述AGE-1基因或AGE-1多肽來自動物。
20．權(quán)利要求16或17的方法，其中所述方法在線蟲或其它動物中實(shí)施。
21．權(quán)利要求16或17的方法，其中所述方法涉及在體外分析AGE-1活性。
22．通過權(quán)利要求16或17的方法鑒定的AGE-1調(diào)制化合物。
23．增加哺乳動物壽命的方法，所述方法包含給予哺乳動物治療有效量的權(quán)利要求22的化合物。
24．測定動物壽命的方法，包括在來自所述動物的樣品中測定AGE-1基因表達(dá)或AGE-1活性，相對于野生型樣品的AGE-1表達(dá)或活性的降低指示所述動物壽命增加。
25．權(quán)利要求24的方法，其中所述動物是哺乳動物。
26．權(quán)利要求24的方法，其中所述哺乳動物是人。
27．權(quán)利要求24的方法，其中通過分析所述樣品中AGE-1多肽的量測定AGE-1基因表達(dá)。
28．權(quán)利要求24的方法，其中所述方法涉及分析激酶活性。
全文摘要
公開了基本純的AGE－1多肽和編碼這些多肽的純化DNA、載體和細(xì)胞。也公開了用所述AGE－1序列測定壽命和分離類似物的方法。
文檔編號A61P43/00GK1232497SQ97198399
公開日1999年10月20日 申請日期1997年8月7日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月7日
發(fā)明者G·魯弗昆, J·莫里斯, H·蒂森鮑姆 申請人:綜合醫(yī)院公司