專利名稱:生物學(xué)活性共聚物的制作方法
本發(fā)明涉及具有生物學(xué)活性的化合物，具體而言是涉及一系列對細(xì)胞和生物有著廣泛作用的嵌段共聚物。
本發(fā)明是一系列具有廣泛的長期生物學(xué)效應(yīng)的化合物。有關(guān)幾種這些生物學(xué)性的背景材料在以下給出。
免疫刺激化合物免疫系統(tǒng)是高度復(fù)雜的細(xì)胞和組織系統(tǒng)，需要大量不同類型的細(xì)胞共同作用。組成免疫系統(tǒng)的體系統(tǒng)分別屬于造血系統(tǒng)，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)或吞噬系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)。
造血系統(tǒng)位于骨髓中，負(fù)責(zé)提供各種免疫系統(tǒng)的副衛(wèi)細(xì)胞和前體。網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)由負(fù)責(zé)摧毀或中和可能進(jìn)入體內(nèi)的外來物質(zhì)的吞噬細(xì)胞組成。淋巴系統(tǒng)由淋巴細(xì)胞組成，并且負(fù)責(zé)全面調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和產(chǎn)生抗體。
淋巴系統(tǒng)的組織一般分為中央組織和外周組織。哺乳類的兩個中央淋巴組織是骨髓和胸腺。另外，家禽具有第三個中央淋巴器官，即腔上囊，它對產(chǎn)生免疫蛋白的細(xì)胞的發(fā)展是很重要的。據(jù)認(rèn)為，哺乳類在腸道上有腔上囊的等同物。淋巴結(jié)，脾，扁桃體，腸道淋巴組織(派伊爾氏淋巴集結(jié))和其他淋巴細(xì)胞的集結(jié)組成外周淋巴組織。
在哺乳類，如果從單個組織來考慮，骨髓是體內(nèi)最大的組織。成年人骨髓總重量的平均值約為3千克。骨髓充滿幾乎所用骨頭的中央髓部。骨髓有三種組織維管組織，脂肪組織和進(jìn)行造血及形成細(xì)胞的組織。維管組織是循環(huán)系統(tǒng)，它給生長著的細(xì)胞供應(yīng)養(yǎng)分和從其中排出廢物。造血組織負(fù)責(zé)形成血紅細(xì)胞，血小板，粒細(xì)胞和單核細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞前體。脂肪組織由脂肪細(xì)胞組成，這些細(xì)胞對骨髓的功能沒有什么作用。
另外的中央淋巴組織是胸腺;它是位于心臟上方的前胸腔中的兩葉片器官。在其他種類中，胸腺可以是沿頸部和胸部分布的幾個小葉。
胚胎學(xué)上，胸腺發(fā)生于第三和第四鰓囊。人的胸腺是在出生時就已發(fā)育完全的器管，其重量為15至20克。到青春期時重40克，此后，它就萎縮或退化，變得在功能上和結(jié)構(gòu)上都不重要了。胸腺隨著年令萎縮是各種類的一個特征，它與年令的增長和生長的停止相聯(lián)系。隨著胸腺的收縮以及依賴胸腺的免疫性的降低，與年令相關(guān)的疾病的發(fā)生率就增加了。胸腺重量隨年令而降低的現(xiàn)象被稱作退化，它伴隨有胸腺結(jié)構(gòu)的改變以及胸腺功能的普遍降低。胸腺的暫時退化也可以是感染或應(yīng)激的結(jié)果。胸腺的退化可用激素控制，閹割減緩?fù)嘶?，而注射皮質(zhì)甾類激素則加速其退化。許多研究已證實(shí)，隨年令增長的胸腺退化伴隨有T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性的降低及隨年令增長的疾病發(fā)生率的升高。許多疾病和治療都可能加速胸腺的退化，實(shí)際上還不知道能增加胸腺生長或逆轉(zhuǎn)退化的方法。
解剖學(xué)上看，胸腺是裝有淋巴細(xì)胞的上皮細(xì)胞囊，由維管系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)供給養(yǎng)份和排出廢物，并受自主神經(jīng)支配。上皮細(xì)胞和其他結(jié)構(gòu)細(xì)胞將胸腺分為連續(xù)葉突的復(fù)雜集合體，它們每個都大量載有淋巴細(xì)胞。上皮細(xì)胞產(chǎn)生激素并且調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的某些活性。在皮層或葉突的外層部分淋巴細(xì)胞的數(shù)量最大。內(nèi)層部分，即髓質(zhì)部分上皮細(xì)胞多，淋巴細(xì)胞較少，但淋巴細(xì)胞更為成熟。
淋巴細(xì)胞一般可分為T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。當(dāng)受到特殊抗原的刺激時，B淋巴細(xì)胞負(fù)責(zé)產(chǎn)生抗體(免疫球蛋白)。T淋巴細(xì)胞負(fù)責(zé)免疫系統(tǒng)的一般調(diào)節(jié)，而且還是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的主要調(diào)節(jié)者。它們還影響著骨髓細(xì)胞的增殖，并且可能還參與其他器官的生長和分化。
所有的淋巴細(xì)胞最終都由骨髓中的干細(xì)胞衍化而來。這些淋巴細(xì)胞前體分散到血液中，并隨血液流到許多器官中。然而，在胸腺或腔上囊(或其哺乳類的等同物)中發(fā)生的重要事件是，淋巴細(xì)胞銘記有特殊功能，并且調(diào)節(jié)向B或T淋巴細(xì)胞的發(fā)展。
對大多數(shù)哺乳動物淋巴細(xì)胞壽命的研究已將淋巴細(xì)胞分為兩部分，一部分是壽命為5至7天(大多數(shù)淋巴細(xì)胞)的短壽命淋巴細(xì)胞，另一部分是壽命以月甚至以年計算的少量的淋巴細(xì)胞。前者一般是B淋巴細(xì)胞，后者一般為T淋巴細(xì)胞。
在每一個具體情況中，B淋巴細(xì)胞對免疫現(xiàn)象的反應(yīng)與T淋巴細(xì)胞有很大的不同。T淋巴細(xì)胞由離開骨髓的淋巴母細(xì)胞在胸腺中形成。這一成熟表現(xiàn)在形態(tài)學(xué)上為細(xì)胞大小減少到直徑為約7微米。胸腺皮層富含各種大小的淋巴細(xì)胞。這些胸腺細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上無法與其他器官的淋巴細(xì)胞相區(qū)別，但是，它們是未成熟的，并且在有幾種細(xì)胞表面抗原存在時是抗原可識別的，包括ψ及T抗原，即區(qū)別B與T淋巴細(xì)胞的特殊的表面標(biāo)記抗原。
對淋巴細(xì)胞的計數(shù)證實(shí)，血液中全部淋巴細(xì)胞的65%至85%是T型。胸導(dǎo)管液的90%至95%是T型，而在派伊爾氏淋巴集結(jié)和腸的淋巴細(xì)胞50%至65%為T型。淋巴結(jié)中T淋巴細(xì)胞的數(shù)量在深皮質(zhì)處多，而在扁桃體及附器中少。
當(dāng)T淋巴細(xì)胞在適宜的條件下與可識別的抗原相接觸時，它們就通過了被稱作淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分裂和生長階段而大量產(chǎn)生它們自身?？乖仨毾缺痪奘杉?xì)胞“加工”，然后才能提供給T淋巴細(xì)胞。
T淋巴細(xì)胞實(shí)際上分為幾個亞單位，它們在免疫系統(tǒng)中起的作用是復(fù)雜的。T淋巴細(xì)胞負(fù)責(zé)被稱作細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的現(xiàn)象。在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中，識別細(xì)胞所帶抗原的T淋巴細(xì)胞開始產(chǎn)生并分泌影響免疫系統(tǒng)中其他類型細(xì)胞活性的各種蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)包括淋巴因子，其吸引，激活和粘著吞噬細(xì)胞于抗原和干擾素的位點(diǎn)上，從而抵抗病毒的侵染。
T淋巴細(xì)胞還是B淋巴細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)者。暴露于抗原的T淋巴細(xì)胞可具有對B淋巴細(xì)胞的正面或反面的作用，這取決于T淋巴細(xì)胞的亞類。主要的亞類是助細(xì)胞和另一種抑制細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞助細(xì)胞是B細(xì)胞對T淋巴細(xì)胞依賴的抗原完全反應(yīng)所必須的。T淋巴細(xì)胞依賴的抗原大多傾向于是復(fù)雜的抗原，如細(xì)菌蛋白，病毒蛋白和其他復(fù)雜的蛋白。
與T淋巴細(xì)胞助細(xì)胞不同，T淋巴細(xì)胞抑制細(xì)胞阻斷B和T淋巴細(xì)胞效應(yīng)細(xì)胞的發(fā)展。特異性T淋巴細(xì)胞抑制細(xì)胞已被證實(shí)在對許多蛋白質(zhì)的耐受性方面起很大的作用，在抗體和細(xì)胞介到的免疫反應(yīng)中均如此。此外，對某些抗原的遺傳學(xué)無應(yīng)答性歸因于抗原對T淋巴細(xì)胞抑制細(xì)胞具有比對T淋巴細(xì)胞助細(xì)胞更大的刺激。
因此，在正常健康的動物中，胸腺一般只在生命的早期是活性的。在胸腺呈活性的這些早期年月中，胸腺給動物提供為其以后生命年月所用的T淋巴細(xì)胞。在某些疾病中，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，胸腺在成年期中也能再次獲得某些活性。這就證實(shí)成熟的胸腺保留著行使功能的能力，而且其退化并不是完全永久性的。至少在有適宜的試劑存在下，其部分功能可以恢復(fù)。
成年個體獲得性T淋巴細(xì)胞缺乏疾病的特征在于循環(huán)T淋巴細(xì)胞被耗盡。這些疾病表現(xiàn)出的病癥包括沒有能力發(fā)動細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答以回答抗原的攻擊。獲得性T淋巴細(xì)胞缺乏病的一個例子是獲得性免疫缺乏綜合癥，或稱作愛滋病(AIDS)。
愛滋病是由人T淋巴細(xì)胞的淋巴細(xì)胞營養(yǎng)性病毒(LAV或HTL-Ⅲ)引起的一種疾病。該病毒特異性攻擊T-4淋巴細(xì)胞助細(xì)胞，該細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞的一個亞類，它在機(jī)體抗御傳染病中起主要作用。耗盡這一亞類淋巴細(xì)胞表現(xiàn)為隨機(jī)性感染如卡氏肺囊蟲(pneumocysticcarinii)和某些癌癥的發(fā)生率增高。特別是，病毒進(jìn)入T淋巴細(xì)胞并把病毒的編碼DNA摻入到宿主T淋巴細(xì)胞的DNA中。當(dāng)感染了的T淋巴細(xì)胞保持非活化狀態(tài)時，病毒就平靜地保留在宿主細(xì)胞的DNA中。這樣不會殺死細(xì)胞，但可以損害細(xì)胞的功能。當(dāng)被感染的T淋巴細(xì)胞被諸如特異性抗原刺激而活化后，在宿主DNA中的病毒DNA就被表達(dá)并且產(chǎn)生新的病毒顆粒。于是宿主細(xì)胞被殺死并解體，釋放出新的病毒顆粒，它們能侵襲并殺死其他T淋巴細(xì)胞。T-4淋巴細(xì)胞的損失是意義深遠(yuǎn)的，其發(fā)生甚至比病毒直接殺死細(xì)胞所能造成的更快。這就已導(dǎo)致某些研究人員假設(shè)侵染關(guān)閉了T-4淋巴細(xì)胞的生產(chǎn)。總之，正常成年個體的胸腺不再起作用，而且被殺死的T淋巴細(xì)胞不能被替換，因而使患者自身易受后來侵染的攻擊。特別顯著的是近來對年令為10個月至42歲的已死愛滋病患者的胸腺所做的研究。愛滋病死亡者的胸腺深度退化，其程度比同令的因其他疾病而亡的患者大得多。
治療愛滋病者需要一種試劑來去除病毒，并且需要其他試劑來導(dǎo)致身體替換那些被病毒殺死的T細(xì)胞。第一步是從患者身上去除愛滋病毒。這就需要其他藥劑的支持來導(dǎo)致免疫功能的恢復(fù)。迄今為止用巨噬細(xì)胞活化劑，干擾素誘導(dǎo)劑和淋巴因子所做的研究均使人失望，這可能是因?yàn)樗鼈兊陌袠?biāo)，即存在的淋巴細(xì)胞的數(shù)量不足。白細(xì)胞介素2能使非T細(xì)胞的一種細(xì)胞亞類恢復(fù)功能(天然殺傷細(xì)胞)，但對其他嚴(yán)重缺損的宿主無效。還可使用更為劇烈的方法。一種潛在的使免疫系統(tǒng)復(fù)蘇的方法是移植健康供者的骨髓。然而，這是個危險的方法，除非患者的供體是孿生，否則就可能對疾病宿主引起致死性移植。
另一需要重新建立免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)的領(lǐng)域，是整體放射性照射治療白血病。當(dāng)患者接受了大量的全身放射照射，全部免疫系統(tǒng)就被摧毀。照射后的常用治療方法是移植近親的骨髓。如果移植成功，新的骨髓就產(chǎn)生新的細(xì)胞，從而恢復(fù)體內(nèi)的紅細(xì)胞和白細(xì)胞。然而，該方法只在某些情況下是成功的，因此也是一種危險的方法。對腫瘤的局部放射性照射和其他幾種化學(xué)治療法也產(chǎn)生對T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性的抑制。
目前需要的是一種安全有效的重建T淋巴細(xì)胞功能的方法。重建T淋巴細(xì)胞功能的方法之一是對現(xiàn)存的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行處理從而使其恢復(fù)正常的免疫功能。在某些情況下對刺激T淋巴細(xì)胞已顯出有效的試劑包括巨噬細(xì)胞活化因子，干擾素誘導(dǎo)劑，淋巴因子和細(xì)胞因子。然而，對愛滋病或?qū)ζ渌輾淋巴細(xì)胞數(shù)量的放射性照射，由于T淋巴細(xì)胞嚴(yán)重缺損，這些方式均為無效。在這種情況下;一種導(dǎo)致胸腺產(chǎn)生新T淋巴細(xì)胞的有效方法就將是所要選取的方法。然而，迄今還設(shè)有使胸腺逆轉(zhuǎn)退化進(jìn)程并產(chǎn)生新T淋巴細(xì)胞的有效治療方法。
自身免疫病自身免疫病的特征是產(chǎn)生了對自己成分起免疫反應(yīng)的現(xiàn)象。通常，身體的組織由免疫系統(tǒng)防護(hù)外來的攻擊;但在自身免疫病中，自身防護(hù)機(jī)制被摧毀，接著免疫反應(yīng)就作用于身體的各個部分。自身免疫病絕大多數(shù)是慢性的，需要終身治療。已被識別的自身免疫病的數(shù)量大，而且包括從侵害單一器官系統(tǒng)直至侵害數(shù)個器官系統(tǒng)。隨著對疾病過程的分子基礎(chǔ)的逐漸了解。將會發(fā)現(xiàn)更多的病也有自身免疫成份。自身免疫病的具體例子在下面給出。
自身免疫病譜器官特異性橋本氏甲狀腺炎突眼性甲狀腺腫腎上腺青銅色皮病少年糖尿病(Ⅰ型)重度肌無力尋常天皰瘡交感神經(jīng)眼炎多發(fā)性硬化病自身免疫溶血性貧血活性慢性肝炎類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎非器官特異性系統(tǒng)性紅斑狼瘡系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種發(fā)炎性多系統(tǒng)病，其臨床特征是急性或隱襲性起始的復(fù)發(fā)病，其可侵害身體的各器官。臨床的征侯歸因于疾病侵害皮膚，腎臟，漿膜，關(guān)節(jié)和心臟。解剖學(xué)上，所有部位都有積聚著類血纖維蛋白的血管層病灶，在免疫學(xué)上，該病涉及自身免疫起源的抗體，特別是抗核抗體(ANA)。ANA直接抵抗DNA和RNA。自身抗體的發(fā)生看來是多重起源的，包括遺傳的，激素的，免疫學(xué)的和環(huán)境的因子。
所見形態(tài)上的改變是形成循環(huán)性免疫復(fù)合物以及它們在各組織中積聚的結(jié)果。雖然很多器官都可被侵害，但有些被侵害的更厲害。關(guān)節(jié)，腎臟，心臟和漿膜上的病灶是大多數(shù)的臨床征侯。SLE的起因是非常不同和無法預(yù)測的。急性突發(fā)癥伴以逐漸衰退可導(dǎo)致數(shù)月內(nèi)死亡。然而，通常病程的特征是病情發(fā)作并且緩和數(shù)年甚至數(shù)十年。一般在二十幾歲和三十幾歲發(fā)病，也可在其他年齡患病。
急性發(fā)病常用腎上腺皮質(zhì)甾類或免疫抑制藥物處理。這些藥物通常能控制急性患病。停止治療后，疾病會再度惡化。近來在預(yù)后方面已得到了改進(jìn)，約有70～80%的患者在突發(fā)性患病后存活了五年，60%存活了十年。終生都要用藥物控制該疾病。
一度曾認(rèn)為SLE是相當(dāng)罕見的疾病。由于診斷方法的改善，對它是中度或隱襲性疾病的認(rèn)識得到了提高，已證實(shí)其流行程度達(dá)到了萬分之一。女性有很大的優(yōu)勢，約為10∶1。
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是系統(tǒng)性，慢性，炎癥性疾病，它主要侵害關(guān)節(jié)，有時也侵害身體其他部位的器官和組織。該病的特征是非化膿性的增生性滑膜炎，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的損壞并逐漸使關(guān)節(jié)失效。該病的起因是在關(guān)節(jié)處發(fā)生的免疫過程所導(dǎo)致的自身頑固長久性的炎癥。同大多數(shù)自身免疫病一樣，起動免疫反應(yīng)的扳機(jī)尚未找到。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病涉及到細(xì)胞和激素介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。大多數(shù)患者的血清免疫球蛋白水平升高，而且基本上所有患者都有稱作類風(fēng)濕因子(RF)的抗體，其抵抗其他類的抗體成分。
關(guān)節(jié)炎發(fā)病的關(guān)鍵在于形成了抵抗其他自身抗體的抗體。為何會形成這些抗體在目前還是未知。曾經(jīng)假設(shè)過該過程是由于對一種不知道的抗原(可能是傳染物質(zhì))起作用的抗體或免疫球蛋白的形成所起動。當(dāng)抗體與抗原結(jié)合時，抗體分子上某一部分的構(gòu)象所發(fā)生的改變產(chǎn)生了新的抗原決定物。這種新的決定物質(zhì)的出現(xiàn)引起抵御抗體分子的抗體反應(yīng)，結(jié)果形成免疫球蛋白抗體或類風(fēng)濕因子。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病也可能涉及T細(xì)胞。在滑液膜上發(fā)現(xiàn)有大量的T細(xì)胞，其數(shù)量超過B細(xì)胞和漿細(xì)胞。另外，降低T細(xì)胞數(shù)量的過程(如胸導(dǎo)管排液)，導(dǎo)致癥狀的減輕。
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的最大損害性效果見于關(guān)節(jié)處。分類學(xué)上，其產(chǎn)生對稱的關(guān)節(jié)炎，主要在手，腳，踝，膝，腕，肘，肩，顳下領(lǐng)關(guān)節(jié)等小關(guān)節(jié)處，有時在脊柱的關(guān)節(jié)。臨床的過程是非常不同的。大約10年后，50%的患者的疾病變?yōu)榉€(wěn)定的或甚至退化。大多數(shù)的保留患者遵循慢性，減緩，復(fù)發(fā)的過程。10～15年后，約10%的患者變?yōu)橛谰眯圆?yán)重殘跛。這種病通常在青年時期突發(fā)，但也可在任何年令患病，一般女性比男性高3～5倍。
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種很普遍的疾病，據(jù)各種報道(根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn))，其侵害美國的0.5～3.8%的婦女和0.1～1.3%的男性。
多發(fā)性硬化病被認(rèn)為是另一種由自身免疫機(jī)制引起的疾病。其病因還不知道，但是看起來是多方面的。易感性和抗性可能由遺傳決定，環(huán)境中的某些東西在適當(dāng)?shù)哪炅钣绊懭梭w宿主，造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生化和結(jié)構(gòu)病變。涉及到系統(tǒng)性免疫反應(yīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的反應(yīng)。雖然多發(fā)性硬化病的起因和致病還不知道，但普遍相信它與免疫異常有些關(guān)系。已經(jīng)提出了三種可能的機(jī)制傳染，自身免疫，以及兩者相結(jié)合。也許關(guān)鍵在于免疫反應(yīng)的抑制和調(diào)控。
多發(fā)性硬化病的分布圖指出這種病從環(huán)境因子中獲得。對該病的地理分布已有約200份研究，并且表明高度流行區(qū)(30～80/10000)位于北緯45～65度的北歐，北美和加拿大南部，以及澳大利亞南部和新西蘭。相對照，在低發(fā)病區(qū)，包括亞洲大部和非洲，其發(fā)病率為十萬分之五或更低。
重度肌無力病是抗體作用于骨骼肌的乙酰膽堿受體而導(dǎo)致的自身免疫失調(diào)癥?，F(xiàn)今的材料證明至少存在有三種機(jī)制，它們能使乙酰膽堿受體抗體干擾神經(jīng)肌肉傳遞，從而引起重度肌無力病。乙酰膽堿受體抗體可以(直接或間接)干擾乙酰膽堿受體功能。在實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性重度肌無力病和人體重度肌無力病中，乙酰膽堿受體的損失程度與臨床病狀嚴(yán)重程度相平行，這就表明乙酰膽堿受體抗體誘導(dǎo)的乙酰膽堿受體的加速降解在重度肌無力病的發(fā)生中是很重要的。補(bǔ)體介導(dǎo)的突觸后區(qū)的損壞是第三種可能的原因。其他的失調(diào)，特別是那些被認(rèn)是起源于自身免疫的失調(diào)，可能同重度肌無力病相伴發(fā)生。甲狀腺病，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡和惡性貧血一般全部可與重度肌無力相伴發(fā)生，而且比根據(jù)偶然性所能預(yù)料到的要多。
重度肌無力在美國的發(fā)病率為1/20000。
治療自身免疫病的基礎(chǔ)是使用免疫抑制劑。這種治療的基礎(chǔ)是自我控制的免疫反應(yīng)的減弱，其初級目標(biāo)是控制異常疾病的征侯。用于獲得這一目標(biāo)的藥物遠(yuǎn)不能令人滿意，因?yàn)橛泻芏嗖焕母弊饔?，而且控制這種疾病更是難以達(dá)到。這個問題復(fù)合有疾病的長期性，使得有效的治療隨著時間的延長而更加困難。異常疾病的嚴(yán)重性的證實(shí)可從自愿接受伴有很大危險的作為疾病發(fā)展的治療中看到?，F(xiàn)有的治療的本性是明顯非選擇性的，對免疫系統(tǒng)的體液和細(xì)胞介導(dǎo)的分支均有廣泛的效應(yīng)。缺乏特異性會限制某些治療方法的有效性。化學(xué)免疫抑制劑的主要幾種是烷基化劑，抗代謝物，皮質(zhì)甾類，和抗生素，也將對它們進(jìn)行簡述。
皮質(zhì)甾類也稱作腎上腺皮質(zhì)甾類，是由腎上腺的髓部或外層產(chǎn)生的類似脂肪的化合物。腎上腺皮質(zhì)是造血器官，影響體內(nèi)大多數(shù)系統(tǒng)的功能。它負(fù)責(zé)調(diào)整身體以適應(yīng)改變的環(huán)境。用皮質(zhì)甾類治療自身免疫疾病是以它們對免疫系統(tǒng)的兩種初級效應(yīng)為基礎(chǔ)的，即消炎作用和摧毀感受性淋巴細(xì)胞。它們還能有效地將淋巴細(xì)胞從外周血液中重新返回到骨髓中。然而，使用皮質(zhì)甾類也不是沒有副作用的，在許多自身免疫疾病所需要的終身治療中更是如此。甾類的主要副作用是1.庫興氏綜合癥2.肌肉萎縮3.骨質(zhì)疏松癥4.甾類引起的糖尿病5.腎上腺萎縮6.干擾生長7.易被感染8.無菌骨壞死9.患白內(nèi)障10.胃潰瘍11.甾類精神病12.皮膚變更13.伴有失眠的神經(jīng)質(zhì)減小副作用須隔天給藥和降低頻率。
最近發(fā)展的免疫抑制劑是抗生素環(huán)孢素A。該抗生素對T細(xì)胞有極大的活性，而且看來對B細(xì)胞無直接作用。對將該藥用于治療自身免疫疾病進(jìn)行了評價，而且顯示出是有前途的。已觀察到的副作用有毛發(fā)生長，中度滯水，腎中毒，以及老年患者的神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)的征侯。
其他藥物是單獨(dú)地或與上述藥物結(jié)合使用，并且包括氯金酸鈉和抗瘧藥，如氯奎。另一類藥物，非甾類消炎藥廣泛地用于關(guān)節(jié)炎。這些藥物低劑量時能止痛，而大劑量重復(fù)使用可消炎。非甾類消炎藥作用迅速，停藥后其臨床效應(yīng)迅速降低。它們不能防止類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，而且也無法使其緩解。免疫刺激劑，如levamisol，已被用在許多自身免疫疾病中，但它的副作用一般都限制了其應(yīng)用。
促進(jìn)生長的化合物隨著世界性的對食物需求的不斷增長，一直就存在著對提高食物生長率的壓力。在五十年代，研究人員意外地發(fā)現(xiàn)抗生素組分在雞群中是“生長因子”。這一發(fā)現(xiàn)極大地改變了國家的畜牧業(yè)的生產(chǎn)，而且是藥品公司的一個經(jīng)濟(jì)恩惠。現(xiàn)在是在高度控制的條件下飼養(yǎng)動物，并喂以伴有各種生長促進(jìn)劑的專門化食物。
自從發(fā)現(xiàn)在飼料中加入少量的抗生素如青霉素，四環(huán)素和磺胺二甲嘧啶能加速牛和豬的生長以來，常規(guī)地給動物一些抗生素已成為全球所共用的了。在1979年，在美國飼養(yǎng)的約70%的肉牛和羊，90%的豬和幾乎100%的小雞都把抗生素作為它們每日食物的一部分。這樣的用藥量，約占美國銷售量的40%，據(jù)估計每年為消費(fèi)者節(jié)約了三十五億美元的食物開銷。
在最優(yōu)化促進(jìn)生長的現(xiàn)代條件下飼養(yǎng)的動物所接收的食物含有大量的蛋白質(zhì)，通常是大豆或棉籽餅，以及大量的谷物，例如玉米或一種叫作milo的高粱。所用的食物添加劑包括激素，例如二乙基己烯雌酚，它也能提高增重率，以及安定藥，它能防止由限制條件帶來的壓力而造成患病的重量損失。
牛一般需要十磅食物才能增重一磅。在最佳促進(jìn)生長的條件下并喂以富含營養(yǎng)的食物則只用6磅飼養(yǎng)就可增重1磅。
現(xiàn)代化飼養(yǎng)已極大地降低了飼養(yǎng)牲畜所要花費(fèi)的勞動力。在飼養(yǎng)小雞方面，強(qiáng)化方法已帶來巨大的效果，在1945年需16工作時來飼養(yǎng)100只小雞，而在1970年則降至1.4工作時，這在某種程度上是因?yàn)槭褂昧俗詣踊拗圃O(shè)備以及伴隨飼養(yǎng)和營養(yǎng)的進(jìn)步所致。
雖然激素和抗生素已很大程度地提高了食用動物的生長率，但是，使用這種添加劑也不是沒有問題的。普遍用作生長刺激劑的一種激素，即DES(二乙基乙烯雌酚)已被證實(shí)是致癌因子，并且在大多數(shù)國家中已禁止進(jìn)一步使用。
當(dāng)抗生素混入動物食物中時，化合物散布于環(huán)境中，使微生物能與抗生素相接觸。這種微生物對抗生素的長期暴露，對微生物產(chǎn)生發(fā)展抗生素抗生的生物壓力。其結(jié)果是能導(dǎo)致抵抗抗生素并引起特別嚴(yán)重的和難以治愈的疾病的微生物。
抗生素抗性微生物是潛在的嚴(yán)重的病原體，因?yàn)樗鼈冸y以控制。如果它們在動物或人身上引起疾病，這種病是不能用常規(guī)抗生素控制的。如果疾病是危急的，也可能就沒有時間來確定哪種抗生素對病原菌是有效的。當(dāng)肉中的抗生素抗性生物被用抗生素治療自身疾病的人所消費(fèi)時，問題就更為嚴(yán)重了?？股匾种坪粑篮湍c胃道中的許多常規(guī)微生物。這就使具有抗性的生物迅速增殖并且造成更為嚴(yán)重的疾病。來自食物的抗生素抗性生物與人們無效抗生素的治療相結(jié)合導(dǎo)致了過去幾年美國所報道的歸因于沙門氏菌食物中毒的大多數(shù)死亡。
飼料中抗生素抗性菌出現(xiàn)的增多以及由抗生素抗性菌引起的幾種嚴(yán)重流行病的后果是來自政府方面的禁止在動物食物中使用抗生素的壓力增加了。結(jié)果，對新的，安全有效的牲畜生長刺激劑的需求日益增加和迫切。
抗腫瘤化合物惡性的及癌性的腫瘤是由它們對局部組織的侵襲以及它們向身體其他部位傳播或轉(zhuǎn)移的能力來定義的。腫瘤的發(fā)生率很高;它是兒童和成年人的第二位致死因素。惡性腫瘤根據(jù)其定義(除非得到治療)總是致死的，這是因?yàn)樗那趾π院娃D(zhuǎn)移性特征。腫瘤由于侵犯其周圍的正常組織而局部增大。它們由于脫落惡性細(xì)胞而傳播到遠(yuǎn)處的部位。這些細(xì)胞通過血液和淋巴系統(tǒng)而運(yùn)動，自己附著，并開始作為新的群落而生長。
對控制腫瘤生長的因子所知甚少。實(shí)驗(yàn)室動物的腫瘤可以通過用單個腫瘤細(xì)胞而移植到第二宿主。這就說明腫瘤開始生長只需一個正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化(癌性)。然而，據(jù)信在腫瘤成功地開始生長之前，有很多轉(zhuǎn)化的細(xì)胞死亡或保持潛伏或休眠很長時間。用化學(xué)的，物理的和病毒試劑，放射性照射和長期刺激已經(jīng)實(shí)驗(yàn)性地在動物身上誘導(dǎo)了腫瘤。
白血病是稱呼造血器官腫瘤的術(shù)語。急性和慢性白血病，同其他類型的血液，骨髓細(xì)胞(骨髓瘤)和淋巴組織(淋巴組織瘤)的腫瘤一起造成全部癌癥死亡的約10%，兒童及30歲以下成年人癌癥死亡的約50%。假設(shè)在治療這些疾病方面沒有重大進(jìn)展的話，現(xiàn)在生活著的人們當(dāng)中將有至少四百萬人死于這些形式的癌癥。
對白血病和其他腫瘤的治療方法包括放射性治療和藥物療法以及兩者的結(jié)合。除了放射性療法以外，以下的藥物長春新堿，脫氫可的松，氨甲蝶呤，環(huán)磷酰胺和阿糖胞苷等常?；ハ嘟Y(jié)合用于治療急性白血病。對慢性白血病，諸如白消安，苯丙氨酸氮芥和苯丁酸氮芥可以相結(jié)合使用。所有常規(guī)抗癌藥物都是毒性高的，患者在治療過程中會感到相當(dāng)不適。強(qiáng)有力的治療的基礎(chǔ)是每個白血病細(xì)胞都被摧毀這一前提，否則，殘留的細(xì)胞就會增生并導(dǎo)致復(fù)發(fā)。
目前所用的大多數(shù)常規(guī)腫瘤的化學(xué)治療藥物都不是特異性殺死腫瘤細(xì)胞。依據(jù)的事實(shí)是在大多數(shù)癌中，癌細(xì)胞比正常細(xì)胞生長得快，因此耗用更多的毒性化學(xué)治療藥劑，從而特異性殺死癌細(xì)胞。使用常規(guī)化學(xué)治療藥物時要對其用量，濃度和它們的結(jié)合特別注意，從而使癌細(xì)胞被殺死而正常細(xì)胞存活下來。由于這一原因，用常規(guī)化療難以殺死全部癌細(xì)胞。
需要的是能特異性完全殺死癌細(xì)胞而對正常細(xì)胞無影響的化合物。理想的是具有只粘附腫瘤細(xì)胞的物理學(xué)特性這一優(yōu)點(diǎn)的新化合物。例如，腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞內(nèi)離子濃度的變化比正常細(xì)胞更為敏感。如果某化合物能對腫瘤細(xì)胞的內(nèi)部離子濃度產(chǎn)生不利于它們的改變，那么，這種化合物就能特異性地殺死腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞無不利影響。
離子載體性化合物離子載體定義的是能夠與金屬離子進(jìn)行化學(xué)計量的反應(yīng)并使離子穿過如細(xì)胞膜這樣的疏水性阻礙物的物質(zhì)。
通常認(rèn)為細(xì)胞膜是由點(diǎn)綴著球蛋白分子的磷脂雙分子層所組成。磷脂的親水性磷酸鹽部分排列在膜的外邊緣，而疏水性脂部分面向中心。細(xì)胞膜是選擇性可透過的，當(dāng)需要時，能讓水，某些營養(yǎng)成分和必須的金屬離子自由地進(jìn)到細(xì)胞中。然而，由于中心是非極性的脂類雙分子層，所以一般情況下膜對強(qiáng)極性分子是不可穿透的。
不同的離子載體一般都各自對某一種或某一類離子具有有親和性。最常見的轉(zhuǎn)運(yùn)通過細(xì)胞膜的離子是Na+，K+，Li+，Rb+，Cs+，Ca+2，Mg+2，Ba+2，Cu+2，F(xiàn)e+2，Ni+2，和Zn+2。例如，負(fù)電性真菌性抗生素離子載體A23187選擇性地與正電性鈣離子形成電中性的“遭遇復(fù)合物”。這種疏水性分子能夠穿過一些不同類型的細(xì)胞膜，而且當(dāng)該復(fù)合體進(jìn)入細(xì)膜后，就釋放出鈣離子。細(xì)胞內(nèi)游離鈣的這種增高已被證實(shí)能刺激許多物質(zhì)的分泌，例如嚙齒類肥大細(xì)胞分泌組胺，胰腺分泌胰島素，淀粉酶和人嗜堿細(xì)胞，垂體分泌激素后葉加壓素，神經(jīng)元分泌神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺，血小板分泌5-羥色胺，腎上腺分泌兒茶酚胺。此外，還證實(shí)A23187離子載體可活化海膽卵。
隨著世界性的對食物需求的不斷增長，對提高食物生產(chǎn)率一直存在著一種壓力。反 動物營養(yǎng)學(xué)家長期以來一直在尋找一種進(jìn)行和改進(jìn)反 發(fā)酵的方法。開始是用規(guī)定食物量的方式來達(dá)到這一目的，但在最近的十年里，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些由各種鏈霉菌產(chǎn)生的活性抗生素化合物能改善代謝效率。雖然開始時是給家禽用作抗球蟲劑，但是這些羧基聚醚抗生素化合物，包括monensin，lasalosid和salinomycin，narasin都顯示出離子載體活性。
自從發(fā)現(xiàn)它們以來，抗生素離子載體已被廣泛地用作飼料添加劑來提高家禽和反芻動物的生產(chǎn)效率。研究表明，當(dāng)把離子載體加到飼料中后，消化道內(nèi)病原體和其他微生物的生長被抑制，因此，提高了飼料中養(yǎng)份的利用率。
各種抗生素離子載體顯示出改善由谷物向肉轉(zhuǎn)換的效率，這是通過提高瘤胃的代謝率，改善氮的代謝，減緩食物消化失調(diào)如慢性乳酸中毒和氣脹病而達(dá)到的。造成這些效應(yīng)的原因是將瘤胃中的微生物由對消化食物發(fā)酵效率低的細(xì)菌轉(zhuǎn)變?yōu)楦嗟男矢叩募?xì)菌。瘤胃微生物種群的改變是由細(xì)菌對通過它們的膜的離子流的不同感受性所帶來的。這種流入的離子造成細(xì)菌細(xì)胞增大和大量增多。
雖然抗生素離子載體已極大地提高了飼養(yǎng)動物的生產(chǎn)效率，但這些添加劑的使用也不是沒有問題?？股鼗斓絼游镲曫B(yǎng)中時，這些化合物就擴(kuò)散到環(huán)境中并暴露于微生物。長期的這種暴露就造成微生物對抗生素產(chǎn)生抗性，并進(jìn)而引起特別嚴(yán)重和難以治愈的疾病。
由于抗生素抗性微生物是難以控制的，所以它們是潛在的嚴(yán)重的病原體。如果這些生物在動物或人體中引起疾病，則這類疾病是常規(guī)抗生素所無法控制的。如果疾病是嚴(yán)重性的，則也許就沒有時間來確定哪種抗生素對病原菌有效。當(dāng)肉中的抗生素抗性生物被服用抗生素治病的人們所攝入后，問題就變得特別嚴(yán)重?？股匾种坪粑篮臀改c道中的許多常規(guī)微生物。這就使具有抗性的生物能迅速繁殖并造成更為嚴(yán)重的疾病。食物中抗生素抗性生物同人體無效抗生素治療的結(jié)合造成了美國過去幾年所報道的沙門氏菌食物中毒死亡的大多數(shù)。
據(jù)信，目前還沒有一類具有如此廣泛的生物活性的化合物，即這類化合物能為治療疾病提供一個新的強(qiáng)有力的武器庫并提高世界性食物供應(yīng)。
根據(jù)本發(fā)明，所提供的是能以多種不同方式影響生物系統(tǒng)的一類新的生物學(xué)活性共聚物。本發(fā)明的生物學(xué)活性共聚物能夠刺激生物的生長，刺激生物的運(yùn)動活性，刺激動物的胸腺生產(chǎn)T細(xì)胞，外周淋巴組織和骨髓細(xì)胞。
本發(fā)明的生物學(xué)活性共聚物還對單個細(xì)胞具有很多種效應(yīng)。這些化合物具有離子載體活性，即它們使某些要被運(yùn)輸?shù)碾x子穿過細(xì)胞膜。這些化合物能造成非溶胞性的肥大細(xì)胞解體，然后釋放出組胺。此外，還發(fā)現(xiàn)這一類生物學(xué)活性共聚物的某些成員能特異性殺傷某些癌細(xì)胞系。這些生物學(xué)活性共聚物還能有效地抵抗某些微生物。
本發(fā)明的生物學(xué)活性共聚物可給動物口服以對動物消化道中的某些微生物產(chǎn)生特異性效應(yīng)。例如，某些生物學(xué)活性化合物可給雞服用以殺死引起球蟲病的各種球蟲。
生物學(xué)活性共聚物還可加到牛的飼料中以改變瘤胃中常規(guī)微生物種群。正常條件下，微生物消化牛吃的纖維素，終產(chǎn)物是甲烷。甲烷基本上是不能被牛利用的。給?？诜景l(fā)明的生物活性共聚物，則該共聚物特異地影響瘤胃的微生物，從而瘤胃的微生物種群發(fā)生改變，結(jié)果是提高了丙酸的生產(chǎn)，降低了乳酸和甲烷的生產(chǎn)。?？梢岳米约捍x產(chǎn)生的丙酸鹽，從而提高了食物的轉(zhuǎn)換率。
本發(fā)明共聚物的生物學(xué)效應(yīng)根據(jù)共聚物的結(jié)構(gòu)不同而不同。這些聚合物具有能為達(dá)到最優(yōu)生物學(xué)效應(yīng)而改變其結(jié)構(gòu)的能力，從而能設(shè)計出在其他系統(tǒng)中所無法達(dá)到的準(zhǔn)確的合成性化合物。
本發(fā)明的生物學(xué)活性共聚物包括親水性聚氧乙烯(POE)和疏水性聚氧丙烯(POP)共聚物。該嵌段共聚物建立在四功能乙二胺起始物上。在本發(fā)明生物學(xué)活性共聚物的優(yōu)選實(shí)施方案中，包括本發(fā)明生物學(xué)活性共聚物的嵌段共聚物具有下述結(jié)構(gòu)
其中由聚氧丙烯(C3H6O)b(POP)組成的八嵌段共聚物的疏水部分的平均聚合分子量在大約5000至7000道爾頓之間;
a是這樣的數(shù)值，即由聚氧乙烯(C2H4O)a(POP)所代表的親水部分占總分子量的約10%至40%;
b是這樣的數(shù)值，即聚氧丙烯(C3H6O)b(POP)占八嵌段共聚物總分子量的約60%至90%。
在本發(fā)明生物學(xué)活性共聚物的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該嵌段共聚物包括建立在乙二胺基起始物上的親水性聚氧乙烯聚合物。然后將疏水性聚氧丙烯(POP)聚合物加到親水性聚氧乙烯段上。其結(jié)果是得到具有下式的八嵌段共聚物親水物｜-疏水物-｜親水物
其中a是這樣的數(shù)值，即由聚氧乙烯所代表的親水部分占化合物總分子量的約10%至40%;
由聚氧丙烯所組成的八嵌段共聚物的疏水部分的平均聚合分子量約為5000至7000道爾頓;
b′是這樣的數(shù)值，即聚氧丙烯部分占八嵌段共聚物化合物總分子量的約60%至90%。
通常采用皮下，靜脈和肌肉注射的方式將有效劑量的本發(fā)明的生物學(xué)活性共聚物施用到動物或人體中。如果想要對消化道的微生物產(chǎn)生作用，也可將本發(fā)明的生物學(xué)活性共聚物口服。消化道一般只吸收很少量的共聚物。
本發(fā)明的目的是要提供具有多種生物學(xué)活性的化合物。
本發(fā)明的另一目的是要提供刺激T細(xì)胞免疫系統(tǒng)的化合物。
本發(fā)明的再一目的是要提供能刺激成體動物胸腺生長的化合物。
本發(fā)明的又一目的在于提供能刺激骨髓細(xì)胞生產(chǎn)的化合物。
本發(fā)明的再一目的是刺激骨髓并提高骨髓從放射性照射和其他損害毒性中的恢復(fù)。
本發(fā)明的另一目的是提供能加速并延長生長的化合物。
本發(fā)明的另一目的是提供能刺激動物和人體運(yùn)動活性的化合物。
本發(fā)明的另一目的在于提供具有離子載體活性的化合物。
本發(fā)明的另一目的在于提供能引起非溶胞性肥大細(xì)胞解體的化合物。
本發(fā)明的另一目的在于提供能特異性殺傷某些腫瘤細(xì)胞系的化合物。
本發(fā)明的又一目的是提供能殺傷消化道中微生物的化合物。
本發(fā)明的另一目的是特異性地免疫抑制動物抗原或不完全抗原。
本發(fā)明的又一目的在于提供能改變反芻動物代謝從而提高食物轉(zhuǎn)換率的化合物。
在閱讀了以下揭示的優(yōu)選方案的詳細(xì)說明和附加的權(quán)利要求
書之后，本發(fā)明的這些和其他的目的，特征及優(yōu)點(diǎn)就明顯了。
本發(fā)明包括一類具有多種生物學(xué)功能的生物學(xué)活性共聚物，它們對治療動物和人類的疾病是有用的，而且可以提高食物生產(chǎn)效率。
本發(fā)明的生物學(xué)活性共聚物包括帶有疏水片段的表面活性化合物和小部分的建造在起始化合物上的親水物。典型的起始化合物帶有一個或一個以上的活性氫，氫上縮合有疏水性或親水性聚合物。用作生產(chǎn)本發(fā)明生物學(xué)活性共聚物的起始化合物包括(但不限于)甲胺，乙胺，丙胺，丁胺，戊胺，苯胺，烯烴基胺，特別是脂族低級胺，和乙二胺，丙鄰二胺，二亞乙基三胺，三亞乙基四胺，四亞乙基五胺，六亞甲基二胺，苯二胺等等。烷醇胺類，如單乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺，異丙醇胺，三(t-丙醇)胺，2-苯基-1-丁醇，N-丁基-二(2-丙醇)也可用作起始物。再者，也可使用含雜氮原子的雜環(huán)化合物，如哌嗪，2-甲基哌嗪，2，5-二甲基哌嗪，咪唑并咪唑，吡唑烷，吡唑烷酮，乙內(nèi)酰脲，二甲基乙酰內(nèi)脲等等。羥胺和其衍生物以及氨基苯酚和其衍生物也可用作生產(chǎn)本發(fā)明生物學(xué)活性共聚物的起始物。
本發(fā)明的組成成份是在以活性氫化合物為基礎(chǔ)的共軛聚氧丙烯-聚氧乙烯化合物的表面活性混合物，其中的具有限定分子量的氧丙烯基鏈在活性氫化合物起始物的活性氫原子位置與其相連結(jié)，然后，氧乙烯基的鏈再接到氧丙烯鏈的尾端。此外，具有限定分子量的氧乙烯鏈可以活性氫原子位置與活性氫化合物起始物相連接，然后，氧丙烯鏈可以接在氧乙烯鏈的未端。
該組份的制備是將環(huán)氧乙烷或環(huán)氧丙烷與起始化合物的活性氫相縮合。當(dāng)?shù)谝磺抖蔚膯误w被加到起始物分子上后，則第二嵌段如環(huán)氧丙烷或環(huán)氧乙烷就與第一嵌段末尾的活性氫相縮合。應(yīng)該理解的是環(huán)氧丁烷可以全部或部分地取代本發(fā)明生物學(xué)活性共聚物中的環(huán)氧丙烷。
應(yīng)當(dāng)注意的是，在制備本發(fā)明生物學(xué)活性共聚物的氧丙烯鏈時，不是必須用純凈的環(huán)氧丙烯。例如，可用含少量的，即不超過約重量5%的環(huán)氧乙烷的環(huán)氧丙烷來制備疏水性活性氫化合物同環(huán)氧丙烷的縮合物。同樣，同疏水性環(huán)氧丙烷-活性氫化合物的縮合物相縮合的環(huán)氧乙烷也可以含有少量的，即不超過約重量5%的環(huán)氧丙烷。
還應(yīng)注意到的是，除非另有注明，則在本說明書和權(quán)利要求
書中所述的分子量指的是疏水物分子量的理論平均值，其與每摩爾活性氫化合物所用環(huán)氧丙烷總克數(shù)相等。在烯烴基氧化物化學(xué)領(lǐng)域中已被完全承認(rèn)的是，用烯烴基氧化物與活性氫化合物相縮合而得到的聚氧烯烴基組合物實(shí)際上是化合物的混合物而不是單一分子化合物。該混合物含有非常相近的類似體，其中在統(tǒng)計學(xué)上，氧合烯烴基的平均數(shù)值與所用的烯烴基氧化物的摩爾數(shù)相等，而混合物中每一成員則含有不等數(shù)目的氧合烯烴基。因此，本發(fā)明的組合物是化合物的“混合物”，由聚氧丙烯鏈的分子量和氧乙烯基的數(shù)目所限定。
本發(fā)明的生物學(xué)活性共聚物包括帶有4個疏水段和少量親水物的表面活性化合物。典型的實(shí)例是具有8節(jié)或八嵌段結(jié)構(gòu)并具有疏水性或親水性中心結(jié)構(gòu)的核和親水性或疏水性外部結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)如附圖13所示
分子整體的水溶性差，是一種非離子型或弱陽離子表面活性劑。據(jù)認(rèn)為起生物活性作用的是分子的立體構(gòu)型和生理化學(xué)性質(zhì)，而不是其化學(xué)性質(zhì)和組成成份。
本發(fā)明的生物學(xué)活性化合物包括建立在烯烴基二胺起始物上的聚氧丙烯和聚氧乙烯的嵌段物。該嵌段物具有下述結(jié)構(gòu)
聚氧丙烯(POP) 聚氧丙烯(POE)該嵌段聚合物是在高溫，高壓和堿性催化劑存在的條件下，將環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷縮合到一個四功能乙二胺起始物上而形成的。對形成每種共聚物中聚合物的單體數(shù)值，在統(tǒng)計學(xué)上是有著一些變化的。制備這些嵌段共聚物的描述可見于美國專利第2674619號和2979528號[還可參見“A Review of Block Polymer surfactants”，Schmolk，I.R.，J Am.Oil Chemists′Soc.，54∶110-116(1977)and Block and Graft Copolymerization，Volumn 2，edited by R.J.Ceresa，John Wiley & Sons，New York，(1976)]。
在本發(fā)明生物學(xué)活性共聚物的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，該嵌段共聚物包括建造在乙二胺起始物上的疏水性聚氧丙烯聚合物。然后將親水性聚氧乙烯聚合物建造在疏水性聚氧丙烯嵌段上。這就得到如下通式所示的八嵌段共聚物
親水物｜-疏水物-｜親水物
其中由聚氧丙烯組成的八嵌段共聚物的疏水部分的平均集合分子量約為5000至7000道爾頓;
a是這樣的數(shù)值，即由聚氧乙烯所代表的親水性部分占化合物總分子量的約10%至40%;
b是這樣的數(shù)值，即聚氧丙烯部分占八嵌段共聚化合物總分子量的約60%至90%。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，嵌段共聚物包括建造在乙二胺起始物上的親水性聚氧乙烯聚合物。然后，疏水性聚氧丙烯聚合物再建造在親水性聚氧乙烯段上。得到具有如下通式的八嵌段共聚物親水物｜-疏水物-｜親水物
其中由聚氧丙烯所組成的八嵌段共聚物的疏水部分的分子量約為5000至7000道爾頓;
a是這樣的數(shù)值，即由聚氧乙烯所代表的親水部分占化合物總分子量的約10%至40%;
b是這樣的數(shù)值，即八嵌段共聚物的聚氧丙烯部分占化合物總分子量的約60%至90%。
這種典型的聚合物稱作反式聚合物，因?yàn)樗慕Y(jié)構(gòu)與具有聚氧丙烯中心并例展有聚物氧乙烯的八嵌段共聚物相反。
由八嵌段共聚物組成的本發(fā)明生物活性共聚物包括(但不僅限于)由BASF公司制造的商標(biāo)為Tetronic和反式Tetronic的嵌段共聚物(BASF Corporation，Parsippang，NJ)。
優(yōu)選的生物學(xué)活性共聚物是八嵌段共聚物T130 R2(BASF Corporation，Parsippany，NJ)，它具有下述結(jié)構(gòu)親水物｜-疏水物-｜親水物
其中由聚氧丙烯所代表的八嵌段共聚物的疏水部分的平均分子量大約為5750道爾頓;
a是這樣的數(shù)值，即由聚氧乙烯所代表的親水部分占該化合物重量的約20%;
b是這樣的數(shù)值，即八嵌段共聚物的聚氧丙烯部分占化合物重量的約80%。
本發(fā)明生物學(xué)活性共聚物的另一優(yōu)選實(shí)施例是稱作T1501(BASF Corporation，Parsippany，NJ)的化合物，它具有如下的結(jié)構(gòu)親水物｜-疏水物-｜親水物
其中由聚氧丙烯所組成的八嵌段共聚物疏水部分的平均分子量大約為6750道爾頓;
a是這樣的數(shù)值，即由聚氧乙烯所代表的親水部分占化合物重量的大約10%;
b是這樣的數(shù)值，即八嵌段共聚物的聚氧丙烯部分占化合物重量的約90%。
本發(fā)明生物活性共聚物的最佳實(shí)例是八嵌段共聚物T150 R1(BASF Corporation，Parsippany，NJ)，它具有如下所示的結(jié)構(gòu)親水物｜-疏水物-｜親水物
其中由聚氧丙烯所組成的八嵌段共聚物疏水部分的平均分子量約為6750道爾頓;
a是這樣的數(shù)值，即由聚氧乙烯所代表的親水部分占化合物重量的大約10%;
b是這樣的數(shù)值，即八嵌段共聚物的聚氧丙烯部分占化合物重量的約90%。
生物學(xué)活性盡管不想被下述理論約束，但是，本發(fā)明生物學(xué)活性聚合物被認(rèn)為是行使下述機(jī)制。
研究人員們已經(jīng)證實(shí)了胸腺和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間由激素介導(dǎo)的相互作用。本發(fā)明的生物學(xué)活性共聚物是能夠影響這種關(guān)系的。據(jù)信本發(fā)明是模仿了天然激素和神經(jīng)肽類的理化性質(zhì)和構(gòu)象而起作用。由本發(fā)明生物學(xué)活性共聚物所誘導(dǎo)的生物學(xué)反應(yīng)包括1.對動物生長率和生長期的刺激;
2.子宮和腎上腺總體形態(tài)的變化;
3.提高運(yùn)動活性，包括過度gromming4.多尿5.由溫度，鈣，能量決定的機(jī)制造成的非溶胞性肥大細(xì)胞釋放組胺，這一點(diǎn)同生長激素抑制素和促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)相似。
據(jù)信，該生物學(xué)活性共聚物同激素，例如生長激素抑制素，促腎上腺皮質(zhì)激素和β-內(nèi)啡肽之間有著結(jié)構(gòu)上的類似。這些肽類都具有共同的堿性氨基酸序列，與側(cè)面的疏水氨基酸相鄰。這些特征被認(rèn)對功能是必要的。寡胺基與細(xì)胞表面陰離子的作用以及相鄰疏水部分的穩(wěn)定作用啟動分子程序，結(jié)果為肽的效應(yīng)器功能。嵌段聚合物具有相同的結(jié)構(gòu)特征中央基礎(chǔ)性乙二胺并側(cè)展有疏水性聚氧丙烯。利用單價胺的抑制，我們得到了中央乙二胺基具有與肽類激素基本部分相同的刺激肥大細(xì)胞釋放組胺這一功能的證據(jù)。
體外的研究提供了本發(fā)明生物活性共聚物以與生長激素釋放素和促腎上腺皮質(zhì)激素相似的方式行使功能的直接證據(jù)。肥大細(xì)胞用作研究受體介導(dǎo)機(jī)制的模型，這些激素正是通過該機(jī)制引發(fā)它們的生物學(xué)受體介導(dǎo)的機(jī)制。少量的聚合物通過溫度決定過程引起肥大細(xì)胞釋放組胺，溫度決定的過程需要能量和鈣，并且能被與生長激素抑制素和ACTH非常相似的方式由特異性抑制劑阻斷。
激素的刺激性和拮抗性效應(yīng)都可由聚合物引起。聚合物的生物學(xué)效應(yīng)根據(jù)其結(jié)構(gòu)的不同而不同。由于這些聚合物具有對某一最優(yōu)特定生物效應(yīng)而修飾其結(jié)構(gòu)的能力，從而提供了在其他系統(tǒng)中所不易達(dá)到的設(shè)計出精確的合成藥物的潛力。
許多螯合劑，例如乙二胺四乙酸(EDTA)，具有側(cè)連結(jié)合氫基團(tuán)的寡胺位點(diǎn)。這種額外的側(cè)連疏水部分產(chǎn)生了能將離子運(yùn)過含脂膜的離子載體。本發(fā)明的化合物具有這種結(jié)構(gòu)，并且能作為離子載體將陽離子運(yùn)過人工膜。因此，本發(fā)明的化合物代表了一類新的化學(xué)性離子載體。有些神經(jīng)肽激素(例如物質(zhì)P)具有離子載體活性。
本發(fā)明的生物學(xué)活性共聚物在引起胸腺皮質(zhì)開始產(chǎn)生新的T細(xì)胞從而給免疫系統(tǒng)補(bǔ)充這種重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞方面也是有效的。該聚合物還引起在淋巴結(jié)和其他外周淋巴組織中大量繁殖胸腺后T細(xì)胞。
本發(fā)明的生物學(xué)活性共聚物還表現(xiàn)出輔藥和發(fā)炎活性，這取決于聚氧乙烯和聚氧丙烯嵌段的排列及長度。反式八嵌段共聚物引起體外鼠肥大細(xì)胞積極的、鈣決定的組胺的釋放，而在活體中組胺釋放的功效與發(fā)炎活性有關(guān)。
將本發(fā)明的生物學(xué)活性共聚物與抗原一道注射給動物或人時，就能有效地、特異性地使動物或人對該抗原產(chǎn)生免疫抑制。為了進(jìn)行定義，將抗原分為兩組，即免疫原和不全抗原。
免疫原是當(dāng)引入哺乳動物體內(nèi)時將產(chǎn)生抗體的那些化合物。免疫原的代表有蛋白質(zhì)，糖蛋白和神經(jīng)蛋白，如肽類和激素，血清蛋白，補(bǔ)體蛋白，凝集因子，以及病毒或細(xì)菌產(chǎn)物。以下是免疫原部分代表的名單。
蛋白質(zhì) 糖蛋白神經(jīng)蛋白 肽類激素血清蛋白 補(bǔ)體蛋白凝集因子 微生物產(chǎn)物病毒產(chǎn)物 細(xì)菌產(chǎn)物真菌產(chǎn)物 特異免疫原舒緩激肽 降鈣素癌胚抗原 ChloriomamtropinChorogonadopln 促皮質(zhì)素促紅細(xì)胞生成素 因子Ⅷ血纖維蛋白原 α-2-H球蛋白促濾胞素 胃泌素胃泌素硫酸鹽 胰高血糖素乙肝表面抗原 免疫球蛋白胰島素 促脂解激素促黑激素 催產(chǎn)素腸促胰酶素 胎盤催乳激素prathryin 血管緊張素原促乳素 生長激素促生長因子 生長激素抑制素thryrotropin 加壓催產(chǎn)素胸腺生成素 后葉加壓素α-1-胎蛋白 α-2-H球蛋白髓磷脂 髓磷脂基本蛋白不全抗原是在與免疫原載體結(jié)合并被引入到脊索動物中后，能產(chǎn)生該不全抗原的特異性抗體的化合物。不全抗原的代表有甾類，如雌激素和可的松，小分子量的肽，其他小分子量的生物學(xué)化合物，藥品如抗生素和化學(xué)治療化合物，工業(yè)污染物，調(diào)味劑，食品添加劑，食品污染和物(或)其代謝物或衍生物。
應(yīng)當(dāng)理解的是，優(yōu)選的生物學(xué)活性化合物可以根據(jù)所需要產(chǎn)生的生物學(xué)活性而在結(jié)構(gòu)上有所不同。
生物學(xué)活性共聚物的施用本發(fā)明生物學(xué)活性共聚物一般是水溶性較差的。雖然該化合物也可在水介質(zhì)中給動物和人注射，但優(yōu)選將其作為水包油或油包水乳液來進(jìn)行注射。乳液的油相可用礦物油或其他的油性物質(zhì)，例如Drakeol 6VR或Drakeol 5(Penreco，Bulter，PA)。水相可以是磷酸鹽緩沖生理鹽水，或其他的生理鹽水。油與水的比例優(yōu)選約80∶20至1∶100。
典型的水包油乳液的制備是將約0.5至50克生物學(xué)活性共聚物與50毫升礦物油在Potter Elvehjim攪勻器中混合而成。然后加入含0.2%聚山梨醇酯(Tween80，Atlas Chemical Industries，Wilmingtom，DE)和50毫克小牛血清(BSA，Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的磷酸鹽緩沖鹽水(0.85M氯化鈉，pH7.3)95.0毫升。將微混合物徹底混勻得到良好的乳液。BSA和Tween80是用來穩(wěn)定乳液的。對制備乳液的方法還應(yīng)理解的是，油和水的份量以及油的種類并不是嚴(yán)格性的。有效的乳液可以用攪拌器，聲處理或其他本專業(yè)普通技術(shù)人員所熟知的方法來制備。還應(yīng)進(jìn)一步理解的是，本專業(yè)普通技術(shù)人員所熟知的載體，乳化劑，水溶液和輔劑均可以同本發(fā)明生物學(xué)活性共聚物一同使用。
油包水乳液按下述制備。將礦物油與約5%至1%的油包水乳化劑混合制成一批油一乳化劑混合物。一般使用94.5%油(Drakeol，Penreco，Butler，PA)，4.5%脫水山梨醇一油酸(Span80，Atlas Chemical Industries，Wilmington，DE)和0.5%聚山梨醇酯(Tween80，Atlas Chemical Industries，Wilmington，DE)的混合物。一種市售混合物，即弗洛因德不完全佐劑(Difco，Detroit，MI或Sigma Chemical，st.Louis，MO)也同樣適用。將大約0.5至5.0克的生物學(xué)活性共聚物加到60毫升油一乳化劑混合物中或加到40毫升與上述水包油乳化液中所用相似的生理鹽水中。將油一乳化劑混合物置于攪混器中。生理鹽水分成三等分加入，并劇烈地攪混以保證制成良好的油包水乳液。同樣，應(yīng)當(dāng)理解的是這種乳液的制備方法并不是嚴(yán)格不變的。對本專業(yè)技術(shù)人員來說，還明顯地有著水一油相組合，使用的比例和乳化方法的許多變形，而且這些變形也可以在實(shí)踐本發(fā)明中與生物學(xué)活性共聚物一同使用。
本發(fā)明的生物學(xué)活性共聚物僅對動物注射一次就是有效的。然而，在某些情況下，為得到對免疫系統(tǒng)的最大刺激或得到其他所需要的效果而需要再行注射。對大型動物需要注射大量的生物學(xué)活性共聚物以達(dá)到最佳效果。對人，牛和豬，所用劑量根據(jù)年令，大小和個體條件而不同，但在大多數(shù)情況下為約5至500毫克。
以下的專門性實(shí)施例將以特別地刺激小鼠和大鼠的免疫系統(tǒng)而說明本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，對本業(yè)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說還明顯地存在著另外的實(shí)施例，而且本發(fā)明并不限于這些說明性實(shí)施例。
圖1表示由暴露于數(shù)種本發(fā)明共聚物的肥大細(xì)胞釋放組胺。
圖2表示流到已暴露于數(shù)種本發(fā)明共聚物的血紅細(xì)胞中的鈉離子流量。
圖3表示爪墊腫脹與鈉流入量和幾種本發(fā)明共聚物之間的關(guān)系。
圖4表示T150 R1對活體小鼠胸腺的效應(yīng)。
圖5表示本發(fā)明的共聚物對大鼠運(yùn)動活性的效應(yīng)。
圖6表示用細(xì)胞存活力測定的T150 R1對K-652和HL-60細(xì)胞的不同殺傷腫瘤的活性。
圖7表示用氚標(biāo)計的胸苷吸收測定的T150 R1對K-652細(xì)胞和HL-60細(xì)胞的不同腫瘤殺傷活性。
圖8表示用乳酸脫氫酶測定的T150 R1和T150 R2對K-652細(xì)胞和HL-60細(xì)胞的不同腫瘤殺傷活性。
圖9表示T150 R1的自動免疫抑制。
圖10表示來自T150 R1處理過的大鼠細(xì)胞的繼承性免疫抑制。
圖11表示用細(xì)胞增長數(shù)測定的T150 R1對Lewis大鼠胸腺細(xì)胞繁殖的刺激。
圖12表示用活體細(xì)胞增長和氚標(biāo)記胸苷聯(lián)合測定的T150 R1對Lewis大鼠胸腺細(xì)胞增殖的刺激。
實(shí)施例Ⅰ-肥大細(xì)胞解體本實(shí)施例中表示了數(shù)種本發(fā)明共聚物的肥大細(xì)胞解體的活性。嵌段共聚物得自BASF Corporation，Parsipanny，NJ，并且在表A中給出。
表A共聚物分子量a平均結(jié)構(gòu)abT130 R1 6800 N-4-26T130 R2 7740 N-10-26T150 R1 8000 N-5-32T150 R4 11810 N-27-32T150 R8 20400 N-92-32a數(shù)據(jù)得自制造者b第一位字母表示胺氮，中間的數(shù)字(下邊有橫線)表示乙氧基單位的平均值，最后的數(shù)字表示每條線性鏈的丙氧基單位平均值。
表A中共聚物的物理形態(tài)范圍是從粘液到薄片狀。液態(tài)共聚物的測定是用陽性移液管在與水相近的密度(范圍1.01～1.03)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的。由于這些材料在水性介質(zhì)中的溶解性隨著溫度的升高而降低，因此所有的稀釋液都放入冷(4℃)的緩沖液中。
小鼠腹腔肥大細(xì)胞是用lavage從雌性C3H鼠(Charles River，Wlimingtom，MA)中獲得。每個實(shí)驗(yàn)中用1只或2只動物，動物用于冰蒸汽殺死，腹腔注射10毫升含10u/ml肝素的冰冷Dulbecco′s磷酸鹽緩沖鹽水(此后稱作PBS)(Gibco，Grand Island，NY)。按摩腹膜30秒，排出液體。細(xì)胞在PBS中洗兩次，并用Alcian蘭計數(shù)。肥大細(xì)胞占總細(xì)胞3～5%，平均值為4-6×106細(xì)胞/動物。細(xì)胞再懸浮于含有1mg/ml牛血清球蛋白(Miles Laboratories，Naperville，IL)的臺羅德氏溶液(參見Pearce，F(xiàn).L.and White，J.R.
Agents Action 14，392)。臺羅德氏溶液的制備使用去離子蒸餾水，以137毫摩爾NaCl，LiCl，或KCl作為主要陽離子，并如所指出的那樣加入1毫摩爾CaCl2。
細(xì)胞預(yù)熱至37℃5分鐘，再以200微升的等分試樣(2-5×103肥大細(xì)胞)加到聚丙烯管中，該管中含有等體積的含或不含共聚物的緩沖液。將細(xì)胞在3%高氯酸中溶胞而得到全部組胺含量。細(xì)胞以37℃溫育30分鐘，然后在4℃以1500×g離心5分鐘。上清液用自動熒光儀(參見Siraganian，R.P.
Anal.Biochem.57383)分析組胺含量。所有實(shí)驗(yàn)都作雙份，結(jié)果以樣品對的形式給出。組胺釋放的凈百分?jǐn)?shù)按下式計算((樣品釋放-自動釋放)×100)/(總組胺量)測試了表A列出的所有共聚物引起非溶胞組胺釋放的能力。五種共聚物以100微克/毫升的濃度與肥大細(xì)胞共同溫育。在與共聚物溫育30分鐘的末尾，測定組胺釋放的凈百分?jǐn)?shù)。結(jié)果總結(jié)于圖1。如圖所示，所獲的這些共聚物的比率揭示出活性譜，即T130 R2共聚物表現(xiàn)出最大的組胺釋放，T150 R8表現(xiàn)出最小的活性。
實(shí)施例Ⅱ-離子載體活性生物學(xué)活性共聚物的離子載體活性是由測定流到人血紅細(xì)胞中的離子流來確定的。
用鋰肝素抗激集的人血在0.9%NaCl中洗三次，室溫下以150×g離心10分鐘，用鹽水稀釋至10%血細(xì)胞比容。為測量Na+流，鹽水含有大約5μCi22Na+/ml(Amersham Corp.，Arlington Heights，IL)。為了測定Ca++流，細(xì)胞用鹽水稀釋，鹽水中含4mMCaCl和濃度為大約10μCi/ml的示蹤物45Ca++(ICN Biomedicals，Inc.，Irvine，CA)。用水浴加熱細(xì)胞至37℃，然后加等體積的含共聚物并被旋流混合和預(yù)熱過的緩沖液。為了測定Na+或Ca++流，在溫育過程中從每種懸浮液中取出50微升雙份等分試樣來測定總活性。在選定的時間點(diǎn)，取出200微升雙份等分試樣，加到含200微升SF1154硅油(General lectric Co.Waterford，NY)的1.5毫升微離心管(American Scientific Products，Mc Gaw Park，IL)中。
為測定Na+和Ca++，將油上邊的上清液抽出，油上邊的管壁部分用仔細(xì)加入并抽出蒸餾水來洗兩次。取出絕大部分油后，細(xì)胞再懸浮于250微升蒸餾水中。將100微升溶胞物與3毫升的Opti-Flour LSCcocktail(United Technologies Packard)混合后，用γ計數(shù)器測定22Na+殘留活性，用β計數(shù)器測定45Ca++余留活力。流出的鉀按上述確定，不同的是細(xì)胞與共聚物在普通鹽水中混合至最終血細(xì)胞比容為10%。離心后，棄去上清液，用IL 443火焰光度(Instrumentation Laboratory，Inc，Lexington，MA)的火焰發(fā)射光譜測定鉀的含量。
使濾餅的殘留計數(shù)或上清液中K+量對濾餅血紅蛋白含量正常化，血紅蛋白含量用Drabkin′s溶液確定。在使用任何所用共聚物或僅用緩沖液溫育的濾餅中，血紅蛋白含量沒有差異，這證實(shí)共聚物是非溶胞性的。所有的實(shí)驗(yàn)至少做了雙份。
對五種共聚物測定了它們30分鐘內(nèi)引起的Na+離子內(nèi)流的能力。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果總結(jié)于圖2。
通過比較這些共聚物的比率揭示了一種活性譜，該活性與它們起動體外的鼠肥大細(xì)胞釋放組胺的能力以及發(fā)炎的能力有關(guān)，發(fā)炎是通過對小鼠近足底的注射后由足墊腫脹值確定的。這些結(jié)果總結(jié)于圖3。
觀察到的鈉離子流越大的共聚物，則該共聚物引起的組胺釋放和炎癥就越強(qiáng)。
實(shí)施例Ⅲ-相對于足墊腫脹的組胺釋放三種八嵌段共聚物和七種反式八嵌段共聚物得自BASF，Parsipanny，NJ。存留的外周白細(xì)胞通過如實(shí)施例7.2中所述的lavage獲得。
發(fā)現(xiàn)七種反式八嵌段共聚物中的六種從鼠外周肥大細(xì)胞中釋放出大量的組胺。結(jié)果見表B。
表B組胺釋放與共聚物引起的足墊腫脹的比較平均分組胺釋放%c足墊腫脹峰值d共聚物子量a鏈結(jié)構(gòu)b10微克/毫升 100微克/毫升 (毫米)T130R2 7，740 N-10-26 58.0±8.6 66.3±6.5 2.92±0.41T130R1 6，800 N-4-26 16.3±4.0 29.0±7.0 1.65±0.3T110R1 5，220 N-3-21 16.7±2.6 15.7±2.6 1.3±0.33T90R1 4，580 N-3-18 15.7±2.6 13.3±2.5 1.18±0.24T150R1 8，000 N-5-32 9.0±0.8 11.7±3.1 1.17±0.08T150R4 11，810 N-27-32 0.3±0.5 16.3±7.9 1.04±0.5T150R8 20，400 N-92-32 0.7±0.5 0.0±0.0 0.79±0.01
a平均分子量(數(shù)據(jù)得自制造者)b反式八嵌段是4鏈結(jié)構(gòu)，圍繞乙二胺核心部分排列。鏈的結(jié)構(gòu)此處表示為，一條鏈的胺氮(N)，后接POE嵌段平均數(shù)(下邊有橫線者)，再接POP嵌段數(shù)。
c以所給出的濃度的共聚物在37℃溫育細(xì)胞30分鐘后上清液中平均組胺含量。三個實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。數(shù)值對自動釋放修正，自動釋放總是低于10%。
d含1.25mg共聚物的水包油乳液50微升近足底注射所產(chǎn)生的橫列足墊腫脹峰值(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)。
各種共聚物的組胺釋放量與注射位置的發(fā)炎水平相關(guān)，也就是在活體中所引起的發(fā)炎越厲害，則體外的組胺釋放就越多。
實(shí)施例Ⅳ-胸腺刺激活性六周齡的雌性ICR遠(yuǎn)交小鼠后足墊注射水包油乳液，該乳液含有1.25毫克T150 R1共聚物，2.5毫克礦物油，25微克牛血清球蛋白存在于0.05毫升0.01摩爾磷酸鹽緩沖鹽水(含0.1%吐溫80)。兩只后足墊注射相同。對照動物注射不含T150 R1的乳液。在第4天，第1，2，3和6周殺死動物。小心地切除下它們的胸腺并使之不帶相連的組織，然后稱重。
顯微檢驗(yàn)揭示出，胸腺的變化幾乎全部限于皮質(zhì)淋巴細(xì)胞。在注射三天后它們的數(shù)目明顯地減少，但在一周后達(dá)到正常。在淋巴細(xì)胞數(shù)量暫時減少之后，實(shí)驗(yàn)動物胸腺的大小比對照動物的明顯增大。髓質(zhì)部分改變很小，但皮質(zhì)部分明顯大于正常。胸腺的皮質(zhì)部分由成熟的和未成熟的淋巴細(xì)胞組成。對照動物胸腺的減小是所預(yù)料到的隨年令增長的正常退化結(jié)果。因此，T150 R1的注射阻止了在研究期間的退化。在以相同條件所作的幾個實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)動物的胸腺都一致地是對照動物的兩倍。有些實(shí)驗(yàn)動物隨后喂養(yǎng)18個月并且生長健康。
表C表示胸腺退化的抑制是長期的。體重，胸腺和脾的重量是18個月后的數(shù)值。
表C對照(n＝3) 在第4周注射(n＝3) 在第6周注射(n＝3)體重 40.7±7g 47.0±4.2g 53.3±1.6g胸腺重 34.7±5.0mg 67.6±18.7mg 66.2±26mg脾重 126.7±47.3mg 180.7±61.0mg 122.7±19mg對胸腺的組織學(xué)檢驗(yàn)表明，對照鼠的胸腺組織很少。被注射鼠的胸腺具有“年青樣的”胸腺組織。
實(shí)施例Ⅴ-胸腺刺激，共聚物于鹽水中以下列制劑小鼠尾靜脈注射1.4℃鹽水，2.2.5mg共聚物T150 R1在4℃鹽水中，2.用T150 R1共聚物包被的1微米顆粒。
每個實(shí)驗(yàn)組有4只鼠。6天后殺死小鼠，小心切除胸腺并稱重。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果總結(jié)于圖4。
本實(shí)驗(yàn)表明，將共聚物溶于冷鹽水中并直接注射到動物血液中，會引起胸腺的重量顯著增加。
實(shí)施例Ⅵ-胸腺刺激，油和水乳液用相關(guān)的共聚物或其他形式的乳液給小鼠足墊注射。共聚物T130 R2和T1501對胸腺大小的增加效果不大。用油包水乳液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表D。
表D油包水乳液，胸腺重量以毫克計共聚物 2周 6周T150 R1 65±7 110±7T150 1 84±15 77±4載體對照 101±18 50±7實(shí)施例Ⅶ-胸腺刺激，普通觀察按實(shí)施例7.6處理小鼠并仔細(xì)觀察幾個月。觀察到以下現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)鼠比對照鼠大。實(shí)驗(yàn)鼠顯示出增強(qiáng)了的運(yùn)動性，包括在籠中的運(yùn)動更多，過度grooming，而且實(shí)驗(yàn)鼠比對照鼠吃得多。
實(shí)驗(yàn)雌鼠的子宮更大些，而且血管增多。實(shí)驗(yàn)動物中派伊爾氏淋巴集結(jié)(消化道所帶的淋巴組織)明顯增多。
實(shí)施例Ⅷ-生長刺激，共聚物的比較將本發(fā)明生物學(xué)活性共聚物施用于小鼠。六周后測定小鼠的生長。
水包油乳液的制備使用1毫克牛血清球蛋白(BSA)，50毫克給定的共聚物(所有的共聚物均是BASF Corporation，Parsipanny，NJ制造的)，以及100微升礦物油(Drakeol 6VR，Penreco Refining Company，Bulter，PA)于2毫升含0.2%吐溫80(Sigma Chemical Co.，st.Louis，MO)的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的液體。該混合物在Potter Elvehjim攪勻器中攪勻。油，共聚物和BSA在加入磷酸鹽緩沖鹽水之前一起攪勻。
用表D中所示的共聚物各自制成乳液，每種共聚物都包括有聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段，它們以前述共聚物T150 R1的形式排列。它們之間只在嵌斷的大小上有區(qū)別。各自具有生理化學(xué)和生物學(xué)特性。
用含50微克BSA，2.5毫克共聚物和5毫克油的0.1毫升水包油乳液分別注射于小鼠的兩條后腿。六周后的重量總結(jié)于表E。
表E共聚物疏水部分子量親水部百分?jǐn)?shù)a平均重量bT90R1 3750 10% 22.7±1.03克T110 R1 4750 10% 22.7±0.76克T130 R1 5750 10% 23.3±1.36克T130 R2 5750 20% 24.7±0.62克T150 R1 6750 10% 26.7±1.75克T150 R4 6750 40% 23.5±1.77克T150 R8 6750 80% 23.0±1.06克a百分?jǐn)?shù)近于10%b每組5只鼠的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差用含有共聚物T150 R1的乳液注射的小鼠比注射其他任何共聚物的小鼠都要大是肉眼可見的。所有的小鼠都是健康的。
表E中所有的共聚物都包括有聚氧丙烯和聚氧乙烯的嵌段，以同樣的反式八嵌段構(gòu)型連接。每種化合物僅在嵌段的大小上有所不同。然而，這些差異給共聚物帶來與其生物學(xué)活性有關(guān)的獨(dú)特的理化性質(zhì)。
實(shí)施例Ⅸ-生長刺激，各種乳液的效果按如上所述，在Evehjim攪勻器中，用1mg牛血清球蛋白(BSA)，50mg T1501或T150 R1共聚物(BASF Corporation，Parsipanny，NJ)和100微升礦物油(Drakeol 6VR，Penreco Bulter，PA)在2.0毫升含0.2%吐溫80的磷酸鹽緩沖鹽水制備水包油乳液。同法制備對照的水包油乳液，只是不用共聚物。
共聚物T1501具有如下的結(jié)構(gòu)親水物-疏水物-親水物
共聚物T150 R1具有如下的結(jié)構(gòu)疏水部-親水部-疏水部
在每種結(jié)構(gòu)中疏水性聚氧丙烯嵌段具有大約為6750的平均分子量。它們各自含有約10%的親水性聚氧乙烯。
用50mg共聚物T1501或T150 R1，1.2ml弗洛因德不完全佐劑(Sigma Chemical Company，st.Louis，MO)，0.8ml Hank′s平衡鹽溶液(Gibco，Grand Island，NY)，含1mg牛血清球蛋白(BSA)制備油包水乳液。同法制備對照乳液，只是不用共聚物。
用含2.5mg共聚物的水包油或油包水乳液給小鼠注射。對照小鼠注射相同劑量的不含共聚物的同種乳液。皮下注射，全部劑量分別注射在兩條后腿。它們在6周后的重量總結(jié)于表F。
表F平均重量a共聚物 水包油乳液 油包水乳液T1501 21.2±1.92克 26.6±1.18克T150 R1 28.1±0.72克 26.5±2.32克對照 22.5±0.96克 23.0±1.41克a每組5只小鼠的平均重量±標(biāo)準(zhǔn)差存在于油包水和水包油乳液中的稱作T150 R1的嵌段共聚物都有很高的生長刺激效應(yīng)。
實(shí)施例Ⅹ-運(yùn)動活性的刺激測定了本發(fā)明生物學(xué)活性共聚物對大鼠運(yùn)動活力的效應(yīng)。本實(shí)施例中使用的是成年雄性Sprague-Dawley大鼠。
大鼠單只放在懸籠中。在開始研究之前，所有的大鼠均在同一房間的飼養(yǎng)三周。在使用共聚物一周前測定水平運(yùn)動的基底值。使用聯(lián)有Vic20微型計算機(jī)的活動箱(Omnitech，Inc.，Columbus，Ohio)測定水平活性?；盍ο渚哂袃膳殴怆姽埽颗?只，位于90°角。當(dāng)?shù)竭_(dá)光電管的光路被阻斷時，電壓就降低并被計機(jī)記錄。對全部9只大鼠測三天來確定活力。
試驗(yàn)溶液和對照液按如下制備用100ml PBS和0.2ml吐溫80混合制成水相，攪拌約5分鐘;200微升油(Drakeol，Penreco，Bulter，PA)中加入100微升T150 R1;這種生物活性共聚物與油的混合物放在Potter-Elvinjim攪勻器中攪勻2分鐘;然后加入含2%吐溫80的PBS1ml，再攪勻2分鐘，最后，再加入含2%吐溫80的PBS1毫升，攪勻2分鐘。按同法制備對照液，只是不加T150 R1共聚物。
所有的大鼠都注射100微升的試驗(yàn)乳液或?qū)φ找?。試?yàn)液總共含有5mg共聚物。所有的均在頸背部皮下注射。化合物對大鼠活性的效應(yīng)見圖5。
如圖5所示，注射了本發(fā)明生物學(xué)活性共聚物的大鼠顯示出明顯高于對照組的活性。
實(shí)施例Ⅺ-殺傷腫瘤活性評價了本發(fā)明生物學(xué)活性共聚物對人類白血病細(xì)胞系的效應(yīng)。試驗(yàn)所用的生物學(xué)活性共聚物(T150 R1)具有如下的結(jié)構(gòu)疏水部-親水部-疏水部
其中由聚氧丙烯(POP)所代表的八嵌段共聚物的平均分子量大約為6750道爾頓;
a是這樣的數(shù)值，即由聚氧乙烯(POE)所代表的親水部分占大約化合物總重的10%;
b是這樣的數(shù)值，即八嵌段共聚物的聚氧丙烯部分占大約化合物總重的90%。
該生物學(xué)活性共聚物稱作T150 R1。
評價了本發(fā)明生物學(xué)活性共聚物T150 R1對惡性人細(xì)胞的效應(yīng)，用不同劑量的共聚物與K562急性成髓性白血病細(xì)胞或HL-60前髓性白血病細(xì)胞共同培養(yǎng)，用錐蟲蘭排斥法確定存活細(xì)胞數(shù)，并在含5%小牛血清的CEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天后將3H-胸苷摻入到DNA中來確定細(xì)胞增殖。結(jié)果見圖6和圖7。
圖6表明本發(fā)明生物學(xué)活性共聚物對HL-60細(xì)胞是強(qiáng)毒性的，但對K-562細(xì)胞的存活力影響很小。用每105個細(xì)胞10微克生物學(xué)活性共聚物的劑量，HL-60細(xì)胞的存活力降低到只用培養(yǎng)基培養(yǎng)的對照細(xì)胞的35%以下。用30微克生物學(xué)活性共聚物/105個細(xì)胞的劑量，90%以上的細(xì)胞死亡。相反，對10微克劑量的生物學(xué)活性共聚物則有大于80% K-562細(xì)胞存活，對30微克的劑量則有大于70%的K-562細(xì)胞存活。
如圖7所示，本發(fā)明生物學(xué)活性共聚物明顯地抑制HL-60和K562的DNA合成。HL-60比K562細(xì)胞系受到的影響大。然而，以30微克劑量有大于70%的K562細(xì)胞存活于培養(yǎng)基中，但是這些細(xì)胞的DNA合成確有大于85%被抑制。
因此，本發(fā)明生物學(xué)活性共聚物顯示了對兩種人白血細(xì)胞系具有細(xì)胞毒性和細(xì)胞抑制效應(yīng)。HL-60比K562更敏感的事實(shí)說明共聚物是對HL-60為選擇性的。
實(shí)施例Ⅻ-共聚物的不同效應(yīng)圖8表示本發(fā)明生物活性共聚物對兩種細(xì)胞系的不同效應(yīng)。除了在實(shí)施例7.11試驗(yàn)的生物學(xué)活性共聚物T150 R1之外，T130 R1由下式代表疏水部-親水部-疏水部
其中由聚氧丙烯所代表的八嵌段共聚物的疏水部的平均分子量大約為5750道爾頓;
a是這樣一個數(shù)值，即由聚氧乙烯所代表的親水部分占化合物重量的大約10%;
b是這樣的數(shù)值，即八嵌段共聚物的聚氧丙烯部分占化合物重量的大約90%。
用不同濃度的兩種共聚物培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)24小時后，測定上清液中乳酸脫氫酶(LDH)的水平，并與未處理細(xì)胞的總LDH相比。LDH釋放到周圍培養(yǎng)基中是測定細(xì)胞死亡的標(biāo)志。如圖8所示，兩種細(xì)胞系對兩種藥物的反應(yīng)極為不同。
因此，本發(fā)明的腫瘤殺傷化合物顯示出對兩種人白血病細(xì)胞系的細(xì)胞毒性效應(yīng)。HL-60細(xì)胞系對T150 R1更敏感，而K562則對T150 R2更為敏感。
實(shí)施例ⅩⅢ-免疫抑制活性在測定T150 R1對抗體生產(chǎn)的效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)中，給每組4只小鼠以抗原，即牛血清球蛋白，抗原是在含有或不含有T150 R1的水包油乳液中。14天后用PBS加佐劑攻擊小鼠，并在第1，2和3周測定對抗原的抗體反應(yīng)。如圖9所示，用T150 R1處理的動物的抗體效價在三個測定點(diǎn)上都低于1000∶1，而在攻擊的三周后，對照小鼠顯示出增加了的效價，即平均效價大于4000∶1。
實(shí)施例ⅩⅣ-免疫抑制的繼承性轉(zhuǎn)移在另一個實(shí)驗(yàn)中，給小鼠施以如上述實(shí)驗(yàn)中所述的含有或不含有T150 R1的水包油并含有BSA的乳液。14天后殺死小鼠。取出胸腺和脾，胸腺或脾的單個細(xì)胞懸浮液靜脈注射給同源的受試小鼠。用同時含有BSA和佐劑的水包油乳液攻擊小鼠。在第1，2和3周測定對BSA的效價。結(jié)果見圖10。
如圖10所示，接受胸腺的小鼠的三次測定值均低于1000∶1。接受脾細(xì)胞的小鼠在第1和第2測定時均低于1000∶1，而在第3次時則低于3500∶1。沒有接受胸腺細(xì)胞和脾細(xì)胞的對照小鼠的效價穩(wěn)定地上升，在第3周時平均大于4000∶1。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)隨胸腺細(xì)胞和脾細(xì)胞的繼承性免疫抑制轉(zhuǎn)移。
實(shí)施例ⅩⅤ-對實(shí)驗(yàn)性變態(tài)腦脊髓炎的抑制研究了T150 R1對實(shí)驗(yàn)性變態(tài)腦脊髓炎(EAE)的進(jìn)展的效應(yīng)，這是一種非常特征性的動物型多發(fā)硬化癥。對這種動物型，將髓磷酯基本蛋白(MBP)，即一種覆蓋某些神經(jīng)的鞘成份與一種強(qiáng)佐劑，即一種完全弗洛因德佐劑(CFA)相結(jié)合注射給一種特別易于患自身免疫疾病的Lewis大鼠，從而誘發(fā)EAE。注射后兩周，大鼠患上行馳緩性麻痹以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特征病灶。在為研究T150 R1而設(shè)計的研究中，將帶有或不帶有T150 R1的MBP-CFA注射給大鼠。接受MBP-CFA的動物出現(xiàn)EAE的典型癥狀。而接受T150 R1的大鼠，則沒有表現(xiàn)出麻痹的證據(jù)。所有的大鼠均在注射后的第13天殺死，取出胸腺，制成單個細(xì)胞懸浮液并計數(shù)細(xì)胞。如圖11所示，用T150 R1處理過的大鼠胸腺含有的細(xì)胞數(shù)比只有MBP-CFA處理的大鼠多40倍。作為另一種對照，評價了將雞卵球蛋白同CFA及T150 R1一起注射后的反應(yīng)。這些動物的胸腺細(xì)胞數(shù)也明顯地大大升高。
用T150 R1處理的大鼠的胸腺細(xì)胞的增殖活性，用氚標(biāo)記胸苷的吸收來測定，也表明比用MBP-CFA處理的動物升高很多。在這個實(shí)驗(yàn)中，用T150 R1-MBP-CFA處理的動物，在24小時的時刻顯示出比用MBP-CFA處理的動物具有更高水平的活性(見圖12)。然而，在第72和第96小時，用T150 R1處理的動物只有可以忽視的胸苷吸收，而用MBP-CFA處理的大鼠則保持有與在24小時差不多的吸收水平。
盡管不想被以下理論所限制，但是，據(jù)信胸腺中細(xì)胞活性的增強(qiáng)是歸因于伴隨對專一性抑制細(xì)胞的刺激的主要反應(yīng)而進(jìn)行的胸腺刺激。誘導(dǎo)專一性抑制細(xì)胞反應(yīng)的能力牽涉到需要有專一性，受狀態(tài)的疾病或條件。
當(dāng)然，應(yīng)該理解的是，以上所述僅與本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案相關(guān)，而且，在不背離附帶的權(quán)利要求
書的精神和范圍的條件下，還有許多的改型和其他選擇。
權(quán)利要求
1.一種生物學(xué)活性共聚物，它包括存在于油性或水性乳液中的有效劑量的八嵌段共聚物，所說的八嵌段共聚物選自具有下式的八嵌段共聚物
以及具有下式的八嵌段共聚物
其中由聚氧丙烯所代表的八嵌段共聚物的部分的平均聚集分子量為大約5000至7000道爾頓，a是這樣的數(shù)值，即由聚氧乙烯所代表的部分占化合物重量的大約10%至40%。b是這樣的數(shù)值，即八嵌段共聚物總分子量的聚氧丙烯部分占化合物重量的大約60%至90%。所說的組合物能夠具有離子載體的活性，刺激免疫系統(tǒng)，使動物或人對抗原獲得免疫抑制，刺激動物的生長，刺激動物或人的運(yùn)動活性。
2.根據(jù)權(quán)項(xiàng)1所述的生物學(xué)活性共聚物，其中所述的八嵌段共聚物包括具有下式的化合物
其中由聚氧丙烯所代表的八嵌段共聚物的平均聚集分子量為大約6750道爾頓，a是這樣的數(shù)值，即由聚氧乙烯所代表的部分占化合物重量的大約10%，b是這樣的數(shù)值，即八嵌段共聚物的聚氧丙烯部分占化合物重量的大約90%。
3.一種刺激動物和人免疫系統(tǒng)的方法，該方法包括給動物或人注射有效劑量的生物學(xué)活性共聚物，所述的生物學(xué)活性共聚物包括選自具有下式的一組八嵌段共聚物
以及具有下式的八嵌段共聚物
其中八嵌段共聚物中由聚氧丙烯代表的那一部分的平均聚集分子量大約為5000至7000道爾頓，a是這樣的數(shù)值，即由聚氧乙烯所代表的那一部分占化合物重量的大約10%至40%，b是這樣的數(shù)值，即八嵌段共聚物總分子量中聚氧丙烯部分占化合物重量的60%至90%，所說的生物學(xué)活性共聚物能夠具有離子載體活性，刺激免疫系統(tǒng)，使動物或人獲得對抗原的免疫抑制，刺激動物生長，刺激動物或人的動物活性。
4.根據(jù)權(quán)項(xiàng)3所述的方法，其中所說的八嵌段共聚物具有如下結(jié)構(gòu)
其中八嵌段共聚物中由聚氧丙烯所代表的那一部分的平均聚集分子量大約為6750道爾頓，a是這樣的數(shù)值，即由聚氧乙烯所代表的那一部分占化合物重量的約10%，b是這樣的數(shù)值，即八嵌段共聚物中聚氧丙烯部分占化合物重量的約90%。
專利摘要
本發(fā)明涉及生物學(xué)活性共聚物及化合物，它們能安全地使動物或人的胸腺增大，從而補(bǔ)償T淋巴細(xì)胞。當(dāng)將它們與抗原一起給動物或人注射后，能引起對抗原的免疫抑制。該共聚物還可用作動物生長促進(jìn)劑。這類化合物是有效的腫瘤殺傷劑。本發(fā)明的生物學(xué)活性共聚物是安全無毒性的劑型，可用有效量施給動物或人。所述共聚物可混于油性或水性乳液，注射給人或動物。
文檔編號A61K31/74GK86104741SQ86104741
公開日1987年5月20日 申請日期1986年7月21日
發(fā)明者羅伯特·L·亨特 申請人:埃默里大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan