本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，更具體地，涉及了一種重組人纖連蛋白凍干海綿及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、纖連蛋白(fibronectin，fn)是一種細(xì)胞外基質(zhì)中的高分子量糖蛋白，主要以三種形式存在，即由肝細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞生成的血漿纖連蛋白，由成纖維細(xì)胞、早期間充質(zhì)細(xì)胞分泌合成的細(xì)胞纖連蛋白，以及胎盤、羊膜組織中的胎兒纖連蛋白。纖連蛋白與相應(yīng)的整合素之間的相互作用，是細(xì)胞黏附與遷移調(diào)節(jié)的中心環(huán)節(jié)，fn可以將細(xì)胞連接到細(xì)胞外基質(zhì)上。為了便于纖連蛋白的運(yùn)輸與儲(chǔ)存，目前纖連蛋白的凍干產(chǎn)品多為凍干粉制劑。

2、殼聚糖（chitosan）是甲殼素n-脫乙?；漠a(chǎn)物，甲殼素和殼聚糖具有生物降解性、細(xì)胞親和性和生物效應(yīng)等許多獨(dú)特的性質(zhì)，尤其是含有游離氨基的殼聚糖，是天然多糖中唯一的堿性多糖。因此，殼聚糖常被用于水凝膠與凍干海綿的制備，然而，由于殼聚糖酸性環(huán)境下呈溶液而加堿后形成不可溶凝膠的性質(zhì)，限制了殼聚糖在酸性敏感蛋白如纖連蛋白等凍干或者水凝膠制備中的應(yīng)用。羧甲基殼聚糖是一種重要的水溶性殼聚糖衍生物，有許多醫(yī)學(xué)功效，如促進(jìn)創(chuàng)面愈合、止血、抑制瘢痕、鎮(zhèn)痛和抑菌作用，另外在化工、環(huán)保、保健品方面也有廣泛的應(yīng)用。羧甲基殼聚糖改善了殼聚糖的水溶性，但是羧甲基殼聚糖水凝膠的制備通常是通過(guò)物化理交聯(lián)（劉群峰等，聚乙烯吡咯烷酮－羧甲基殼聚糖原位水凝膠的研究[j].材料研究與應(yīng)用.2016,10(3):209-212.）或光交聯(lián)（候冰娜等，光交聯(lián)羧甲基殼聚糖水凝膠的制備及藥物緩釋性能研究[j].材料工程,2020,48(11):76-84.）等方式實(shí)現(xiàn)的。然而，羧甲基殼聚糖鮮少用于蛋白凍干過(guò)程。

3、凍干海綿雖然為蛋白運(yùn)輸和保持提供了便利，但是在應(yīng)用上復(fù)水后均溶解為液體狀態(tài)，要作為傷口敷料需要增加固體介質(zhì)載體。而作為傷口輔料的水凝膠其制備方法與過(guò)程對(duì)于蛋白穩(wěn)定性存在一定傷害，尤其是像纖連蛋白這種大分子蛋白，在紫外或者顯著ph改變過(guò)程中可能會(huì)發(fā)生斷裂或降解的情況，而且在保存與運(yùn)輸中的便利性不如凍干海綿。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種重組人纖連蛋白凍干海綿及其制備方法和應(yīng)用。

2、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用了如下所述的技術(shù)方案：

3、第一方面，一種重組人纖連蛋白凍干海綿，其是由含濃度為0.1-6mg/ml的重組人纖連蛋白、質(zhì)量濃度為1-5%的羧甲基殼聚糖和摩爾濃度為0.05-0.4mm的金屬離子的混合液凍干形成。

4、進(jìn)一步的，所述重組人纖連蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

5、進(jìn)一步的，所述金屬離子為ca2+、fe3+和mn2+的任一種。

6、第二方面，一種重組人纖連蛋白凍干海綿的制備方法，包括如下步驟：將重組人纖連蛋白、羧甲基殼聚糖溶液以及含金屬離子溶液混合得混合液，冷凍干燥得到重組人纖連蛋白凍干海綿；所述混合液中，重組人纖連蛋白濃度為0.1-6mg/ml，羧甲基殼聚糖濃度為1-5%（w/v），金屬離子濃度為0.05-0.4mm。

7、進(jìn)一步的，所述重組人纖連蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

8、進(jìn)一步的，所述金屬離子為ca2+、fe3+和mn2+的任一種。更進(jìn)一步的，所述金屬離子優(yōu)選ca2+。

9、進(jìn)一步的，重組人纖連蛋白的制備步驟如下：將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的重組人纖連蛋白序列基因克隆于載體，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌表達(dá)菌株；通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)所述重組人纖連蛋白，裂解大腸桿菌并純化及洗濾濃縮，收獲重組人纖連蛋白。其中，純化具體為聚丙烯酸酯微球?yàn)榛|(zhì)材料的ni-nta填料單次親和層析或二次陰離子交換層析，所用填料為：deae?sepharose?ff、q?sepharose?ff、capto?q或capto?q?impres。洗濾濃縮是指利用超濾膜包進(jìn)行溶液置換與濃縮，超濾置換前進(jìn)行預(yù)濃縮，置換溶液體積為蛋白溶液體積的5-10倍。

10、進(jìn)一步的，所述冷凍干燥包含前箱預(yù)凍、一次干燥、解析干燥和降壓步驟，其中前箱預(yù)凍：設(shè)定溫度4.0℃，設(shè)定時(shí)間1min，保持時(shí)間60min；-20.0℃設(shè)定時(shí)間1min，保持10min；-45.0℃設(shè)定時(shí)間1min，保持180min；預(yù)抽真空0.100mbar；一次干燥：-45.0℃，設(shè)定時(shí)間1min，保持時(shí)間30min，控制壓力0.1mbar；-22.0℃，設(shè)定時(shí)間60min，保持時(shí)間1200min，控制壓力0.100mbar；壓力升設(shè)定值0.030mbar，設(shè)定時(shí)間1min，設(shè)定次數(shù)2，間隔時(shí)間30；解析干燥設(shè)定：0.0℃，設(shè)定時(shí)間30min，保持時(shí)間60min，控制壓力0.100mbar；30.0℃，設(shè)定時(shí)間60min，保持時(shí)間180min，控制壓力0.100mbar；30.0℃，設(shè)定時(shí)間1min，保持時(shí)間60min，控制壓力0.010mbar。

11、進(jìn)一步的，所述羧甲基殼聚糖溶液中的緩沖液為磷酸鹽緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液。

12、進(jìn)一步的，所述羧甲基殼聚糖溶液中羧甲基殼聚糖的取代度≥90%。

13、第三方面，上述重組人纖連蛋白凍干海綿在促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合修復(fù)敷料中的應(yīng)用。

14、進(jìn)一步的，應(yīng)用步驟包括：將所述重組人纖連蛋白凍干海綿置于潔凈容器，并通過(guò)酒精復(fù)濕，得到濕潤(rùn)敷料，具有一定的延展性；或者通過(guò)加入適量純化水復(fù)溶及無(wú)菌過(guò)濾，得到所需濃度的重組人纖連蛋白溶液；或者，應(yīng)用步驟包括：將所述重組人纖連蛋白凍干海綿置于潔凈容器，并通過(guò)酒精潤(rùn)濕，得到濕潤(rùn)敷料；酒精揮發(fā)后再?gòu)?fù)水，如滴加或噴淋適量水，可得到進(jìn)一步膨脹但不溶解的緩釋敷料，具有適當(dāng)延展性與粘性，且可長(zhǎng)時(shí)間逐步緩釋溶解長(zhǎng)達(dá)1天以上。而當(dāng)采用其他水溶性殼聚糖如殼聚糖鹽酸鹽雖可用于凍干，但復(fù)水后得到的是不具有延展性的敷料。

15、進(jìn)一步的，所述酒精為醫(yī)用酒精，濃度值為20%-75%。

16、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

17、本發(fā)明制備的重組人纖連蛋白凍干海綿是一種能夠保護(hù)傷口避免感染，并促進(jìn)傷口愈合的敷料。本發(fā)明制備方法對(duì)于重組人纖連蛋白功能活性無(wú)影響，并能夠使蛋白可以常溫保存，不再局限于低溫，作為敷料使用時(shí)重組人纖連蛋白仍然具有促進(jìn)細(xì)胞粘附以及增殖等功能。使用時(shí)，經(jīng)酒精和水順序處理后，可獲得具有一定延展性、粘性的重組人纖連蛋白敷料，且蛋白活性與凍干前無(wú)差異，酒精處理或不處理也對(duì)蛋白活性無(wú)顯著影響。

18、所制備的凍干海綿在適當(dāng)濃度的酒精溶液噴淋或浸潤(rùn)下，相較于直接用無(wú)菌水進(jìn)行復(fù)水，可以形成具有一定張力和延展性的敷料，而且酒精揮發(fā)后再?gòu)?fù)水后還可以進(jìn)一步延展并具備一定粘性但不溶解成液態(tài)，作為敷料使用，覆蓋于如傷口，可以緩慢溶解保護(hù)傷口，是一種便于使用的可緩慢溶解的緩釋敷料，可長(zhǎng)時(shí)間逐步緩釋溶解長(zhǎng)達(dá)1天以上。在創(chuàng)傷外科、皮膚外科等領(lǐng)域涉及的皮膚損傷愈合和皮膚原位再生修復(fù)以及體外皮膚組織工程構(gòu)建都具有優(yōu)良的應(yīng)用價(jià)值。

19、酒精還可以對(duì)于海綿起到一定的消毒作用，并且由于殼聚糖的保護(hù)和酒精處理時(shí)間較短，重組人纖連蛋白的活性并不受到影響。另外，添加cacl2對(duì)于復(fù)水后的緩釋敷料延展性有較明顯的提升。