本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，特別是基于dna納米技術(shù)的誘導(dǎo)nk細(xì)胞精準(zhǔn)殺傷腫瘤過繼性免疫藥物的一種用于誘導(dǎo)nk細(xì)胞精準(zhǔn)殺傷腫瘤的跨膜dna孔道細(xì)胞靶點標(biāo)簽的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、與以往的標(biāo)準(zhǔn)腫瘤治療相比，癌癥免疫治療顯著改善了患者的生存和生活質(zhì)量，并被確立成為癌癥治療的新支柱。而在用于癌癥免疫治療的各種細(xì)胞來源中，自然殺傷細(xì)胞（nk）表現(xiàn)出獨特的腫瘤免疫監(jiān)測特征，可以通過抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（adcc）作用迅速殺死對致癌表面標(biāo)記物應(yīng)激的腫瘤細(xì)胞。活化的nk細(xì)胞釋放穿孔素和顆粒酶b直接殺死靶細(xì)胞，同時分泌炎性細(xì)胞因子和趨化因子發(fā)揮間接抗腫瘤活性，使其成為腫瘤免疫治療的理想效應(yīng)細(xì)胞。然而，在腫瘤微環(huán)境中普遍存在的nk細(xì)胞的抑制信號和較少的抗原受體，往往導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境（tmes）中免疫細(xì)胞治療藥物的功能惡化和衰竭。

2、研究表明，在實體腫瘤中檢測到的腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated?antigens,taas）很少具有嚴(yán)格的腫瘤特異性。特別是在實體瘤中，由于細(xì)胞間顯著的抗原異質(zhì)性和高頻率的突變率，識別出在多種腫瘤類型中均穩(wěn)定表達(dá)的通用腫瘤抗原變得極具挑戰(zhàn)性。這一現(xiàn)象限制了自然殺傷（nk）細(xì)胞針對特定腫瘤的精準(zhǔn)激活和殺傷能力。因此，為了提高nk細(xì)胞針對實體瘤的特異性靶向能力以及增強實體瘤的免疫原性，進(jìn)而促進(jìn)有效的nk細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)，實現(xiàn)更高效的nk細(xì)胞招募。

3、針對靶向腫瘤抗原的nk細(xì)胞療法中異質(zhì)性實體瘤上的靶點豐度及特異性不足這一障礙，人們做出了許多努力，例如利用基因工程等技術(shù)重編程nk過繼性免疫療法、以及生物材料膜表面工程增強nk細(xì)胞的靶向豐度及精準(zhǔn)度（包括但不限于點擊化學(xué)、代謝標(biāo)記以及脂質(zhì)偶聯(lián)物等工程膜靶向性；dna適配體工程膜表面抗原受體等），這些膜表面工程技術(shù)雖然提高了nk細(xì)胞腫瘤識別、免疫相互作用和nk細(xì)胞浸潤到腫瘤部位的能力，但絕大多數(shù)腫瘤相關(guān)抗原也在正常組織中表達(dá)，且探索新的腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原的已被證明具有較高挑戰(zhàn)性。因此，需要一種可實現(xiàn)高特異性靶向并且安全通用的腫瘤細(xì)胞“抗原”靶點標(biāo)簽藥物，提高實體瘤的“人工抗原活性”以及改善nk細(xì)胞對異質(zhì)性實體瘤的敏感性，但至今未見有公開報道。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種用于誘導(dǎo)nk細(xì)胞精準(zhǔn)殺傷腫瘤的跨膜dna孔道細(xì)胞靶點標(biāo)簽的制備方法及應(yīng)用，可有效制備用于誘導(dǎo)nk細(xì)胞精準(zhǔn)殺傷腫瘤的跨膜dna孔道細(xì)胞靶點標(biāo)簽，實現(xiàn)在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用問題。

2、本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，一種用于誘導(dǎo)nk細(xì)胞精準(zhǔn)殺傷腫瘤的跨膜dna孔道細(xì)胞靶向標(biāo)簽的制備方法，首先構(gòu)建類六棱柱狀的dna孔道腫瘤細(xì)胞標(biāo)簽以及膜表面修飾有類三棱柱狀的dna細(xì)胞標(biāo)簽的nk-92細(xì)胞，再利用膽固醇修飾基本框架鏈進(jìn)行膜表面錨定和仿生孔道構(gòu)建，通過dna銜接域鏈間堿基互補配對，實現(xiàn)nk-92細(xì)胞精準(zhǔn)聚集、激活和殺傷實體腫瘤，制備方法具體步驟如下：

3、（1）六棱柱孔道標(biāo)簽合成：將dna引物鏈-1至dna引物鏈-6溶液均勻混合，在混合前，先將線性dna引物鏈-2和線性dna引物鏈-5分別置于1?×?tee?buffer反應(yīng)緩沖液中溶解；其余5'端修飾有膽固醇的線性dna引物鏈-1、dna引物鏈-3、dna引物鏈-4、dna引物鏈-6分別用ddh2o溶解；

4、所述的dna引物鏈-1、dna引物鏈-2、dna引物鏈-3、dna引物鏈-4、dna引物鏈-5、dna引物鏈-6的初濃度均為20μm，混合均勻后置于pcr儀中進(jìn)行梯度反應(yīng)，其中：95℃?恒溫反應(yīng)5?min，80℃反應(yīng)1?min，然后以每個循環(huán)-1.5℃/1?min，經(jīng)10個循環(huán)梯度降溫至65℃；再以每個循環(huán)-0.6℃/4?min，循環(huán)41次梯度降溫至40℃；以每個循環(huán)-1℃/1.5?min經(jīng)16個循環(huán)梯度降溫至24.4℃；此后以24.4℃恒溫反應(yīng)30?min，最后以4℃恒溫反應(yīng)2?h結(jié)束，得六棱柱孔道結(jié)構(gòu)，加入濃度20μm的dna銜接域鏈-1，合成六棱柱孔道標(biāo)簽；

5、（2）三棱柱標(biāo)簽合成：將dna引物鏈-7、dna引物鏈-8、dna引物鏈-9溶液均勻混合，再置于1?×?tee?buffer反應(yīng)緩沖液中溶解，得到濃度為20μm的線性dna引物鏈溶液；

6、所述的線性dna引物鏈-7、dna引物鏈-8、dna引物鏈-9的濃度均為20μm，混合均勻后置于pcr儀中進(jìn)行梯度反應(yīng)，其中：95℃?恒溫反應(yīng)5?min，80℃反應(yīng)1?min，然后以每個循環(huán)-1.5℃/1?min，經(jīng)10個循環(huán)梯度降溫至65℃；再以每個循環(huán)-0.6℃/4?min，循環(huán)41次梯度降溫至40℃；以每個循環(huán)-1℃/1.5?min經(jīng)16個循環(huán)梯度降溫至24.4℃；此后以24.4℃恒溫反應(yīng)30?min，最后以4℃恒溫反應(yīng)2?h結(jié)束，得三棱柱基本框架結(jié)構(gòu)，加入濃度為20μm的?dna銜接域鏈-2，以及3'端膽固醇修飾的線性dna引物鏈-10作為錨定結(jié)構(gòu)域，合成三棱柱孔道標(biāo)簽；

7、（3）利用原子力顯微鏡（afm）表征產(chǎn)物三棱柱標(biāo)簽以及六棱柱孔道標(biāo)簽的形貌，并使用質(zhì)量濃度8%的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳表征六棱柱孔道結(jié)構(gòu)的成功合成（見圖2）；

8、所述的六棱柱孔道標(biāo)簽，是由四條修飾有膽固醇的dna框架鏈、兩條基本框架連以及dna銜接域鏈-1堿基互補配對結(jié)合而成類六棱柱的dna孔道結(jié)構(gòu)；

9、所述的三棱柱孔道標(biāo)簽，包含三條基本框架dna鏈，兩端分別與修飾有膽固醇的錨點dna鏈和dna銜接域鏈-2通過堿基互補配對形成類三棱柱的dna孔道nk-92細(xì)胞標(biāo)簽；

10、依據(jù)dna互補方式的方向性，實現(xiàn)兩種孔道標(biāo)簽拉鏈?zhǔn)浇Y(jié)合，其中dna六棱柱孔道標(biāo)簽利用膽固醇疏水作用在腫瘤原位形成2?nm的仿生孔道，通過釋放腫瘤內(nèi)容物，實現(xiàn)對nk-92細(xì)胞的招募、聚集并精準(zhǔn)殺傷腫瘤細(xì)胞。

11、本發(fā)明方法制備的用于誘導(dǎo)nk細(xì)胞精準(zhǔn)殺傷腫瘤的跨膜dna孔道細(xì)胞靶點標(biāo)簽在制備體外nk細(xì)胞回輸相關(guān)過繼性免疫療法的藥物中的應(yīng)用。

12、所述的用于誘導(dǎo)nk細(xì)胞精準(zhǔn)殺傷腫瘤的跨膜dna孔道細(xì)胞靶點標(biāo)簽分別呈現(xiàn)類三棱柱以及類六棱柱狀結(jié)構(gòu)，大小可達(dá)納米級別。

13、所述的腫瘤細(xì)胞為黑色素瘤細(xì)胞以及人宮頸癌細(xì)胞和其他病理學(xué)上的實體腫瘤。

14、本發(fā)明原料豐富，制備方法易操作，產(chǎn)品質(zhì)量好，膽固醇修飾的dna棱柱細(xì)胞標(biāo)簽，基于堿基互補配對介導(dǎo)nk細(xì)胞標(biāo)記、追蹤、聚集殺傷腫瘤細(xì)胞；仿生dna孔原位插入腫瘤細(xì)胞，創(chuàng)建人工跨膜通道，實現(xiàn)腫瘤相關(guān)抗原釋放；聚集的nk-92細(xì)胞被原位更加精準(zhǔn)激活并殺傷腫瘤細(xì)胞，改善過繼性免疫，為誘導(dǎo)nk細(xì)胞精準(zhǔn)殺傷腫瘤提供技術(shù)支持，可有效應(yīng)用于制備體外nk細(xì)胞回輸相關(guān)過繼性免疫療法的藥物，適用于廣泛的實體腫瘤治療，經(jīng)濟(jì)和社會效益顯著，是nk過繼性免疫療法治療藥物上的創(chuàng)新。

技術(shù)特征：

1.一種用于誘導(dǎo)nk細(xì)胞精準(zhǔn)殺傷腫瘤的跨膜dna孔道細(xì)胞靶向標(biāo)簽的制備方法，首先構(gòu)建類六棱柱狀的dna孔道腫瘤細(xì)胞標(biāo)簽以及膜表面修飾有類三棱柱狀的dna細(xì)胞標(biāo)簽的nk-92細(xì)胞，再利用膽固醇修飾基本框架鏈進(jìn)行膜表面錨定和仿生孔道構(gòu)建，通過dna銜接域鏈間堿基互補配對，實現(xiàn)nk-92細(xì)胞精準(zhǔn)聚集、激活和殺傷實體腫瘤，具體步驟如下：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于誘導(dǎo)nk細(xì)胞精準(zhǔn)殺傷腫瘤的跨膜dna孔道細(xì)胞靶點標(biāo)簽的制備方法，首先構(gòu)建類六棱柱狀的dna孔道腫瘤細(xì)胞標(biāo)簽以及膜表面修飾有類三棱柱狀的dna細(xì)胞標(biāo)簽的nk-92細(xì)胞，再利用膽固醇修飾基本框架鏈進(jìn)行膜表面錨定和仿生孔道構(gòu)建，通過dna銜接域鏈間堿基互補配對，實現(xiàn)nk-92細(xì)胞精準(zhǔn)聚集、激活和殺傷實體腫瘤，制備方法具體步驟如下：

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述用于誘導(dǎo)nk細(xì)胞精準(zhǔn)殺傷腫瘤的跨膜dna孔道細(xì)胞靶向標(biāo)簽的制備方法，其特征在于，所述的用于誘導(dǎo)nk細(xì)胞精準(zhǔn)殺傷腫瘤的跨膜dna孔道細(xì)胞靶點標(biāo)簽為類三棱柱和類六棱柱狀結(jié)構(gòu)，大小為納米級。

4.權(quán)利要求1或2、3任一項所述的方法制備的用于誘導(dǎo)nk細(xì)胞精準(zhǔn)殺傷腫瘤的跨膜dna孔道細(xì)胞靶點標(biāo)簽在制備誘導(dǎo)nk細(xì)胞精準(zhǔn)殺傷腫瘤的跨膜dna孔道細(xì)胞靶點標(biāo)簽藥物中的應(yīng)用。

5.權(quán)利要求1或2、3任一項所述的方法制備的用于誘導(dǎo)nk細(xì)胞精準(zhǔn)殺傷腫瘤的跨膜dna孔道細(xì)胞靶點標(biāo)簽在制備抗腫瘤細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的在制備抗腫瘤細(xì)胞藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述的腫瘤細(xì)胞為黑色素瘤細(xì)胞以及人宮頸癌細(xì)胞。

7.權(quán)利要求1或2、3任一項所述的方法制備的用于誘導(dǎo)nk細(xì)胞精準(zhǔn)殺傷腫瘤的跨膜dna孔道細(xì)胞靶點標(biāo)簽在制備體外nk細(xì)胞回輸相關(guān)過繼性免疫療法藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
一種用于誘導(dǎo)NK細(xì)胞精準(zhǔn)殺傷腫瘤的跨膜DNA孔道細(xì)胞靶向標(biāo)簽的制備方法，首先構(gòu)建類六棱柱狀的DNA孔道腫瘤細(xì)胞標(biāo)簽以及膜表面修飾有類三棱柱狀的DNA細(xì)胞標(biāo)簽的NK?92細(xì)胞，再利用膽固醇修飾基本框架鏈進(jìn)行膜表面錨定和仿生孔道構(gòu)建，通過DNA銜接域鏈間堿基互補配對，實現(xiàn)NK?92細(xì)胞精準(zhǔn)聚集、激活和殺傷實體腫瘤，本發(fā)明原料豐富，制備方法易操作，產(chǎn)品質(zhì)量好，為誘導(dǎo)NK細(xì)胞精準(zhǔn)殺傷腫瘤提供技術(shù)支持，可有效應(yīng)用于制備體外NK細(xì)胞回輸相關(guān)過繼性免疫療法的藥物，適用于廣泛的實體腫瘤治療，經(jīng)濟(jì)和社會效益顯著，是NK過繼性免疫療法治療藥物上的創(chuàng)新。

技術(shù)研發(fā)人員：郭振振,王丹鈺,易樺,張開翔,高華,張振中
受保護(hù)的技術(shù)使用者：鄭州大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/26