本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種6-芐氨基嘌呤的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

當組織器官血液供應(yīng)不足時，常導(dǎo)致細胞機能障礙甚至發(fā)生壞死，然而血流的迅速恢復(fù)會進一步加重器官的損傷程度。腸是機體內(nèi)細菌和內(nèi)毒素的最大儲存庫，當局部缺血再灌注損傷引發(fā)腸屏障功能破壞后會引起一系列疾病的發(fā)生，如膿毒癥、全身炎癥反應(yīng)綜合癥、大量器官機能障礙(肝、肺、腎等)，因此腸被認為是引發(fā)機體器官系統(tǒng)異常的“馬達”。

小腸細胞極易受到局部缺血的影響，再灌注后會進一步導(dǎo)致黏膜受損。在急性腸系膜缺血，出血性、外傷性、感染性休克或者嚴重燒傷以及一些手術(shù)操作如小腸移植術(shù)、腹主動脈術(shù)等過程中常伴有局部缺血再灌注損傷發(fā)生。

目前，市場上有許多抗小腸損傷的物質(zhì)，但是大多數(shù)都有不易提取獲得、純度不高、有效成分不明確等缺點，給實際應(yīng)用帶來了很大的麻煩。因此，開發(fā)一種來源廣，純度高，成分明確，效果好，安全無毒無害的抗小腸損傷的物質(zhì)將是非常迫切且具有重要意義的任務(wù)。

6-芐氨基嘌呤(6-ba)成分明確，在酸堿中穩(wěn)定，來源廣、成分明確、純度高，可以作為植物生長調(diào)節(jié)劑使用，對動物體肝臟和腦組織也具有抗損傷效果，但是對小腸損傷的保護作用還未見報道，開發(fā)其在制備抗小腸組織損傷制品中的新應(yīng)用具有重要的經(jīng)濟價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種6-芐氨基嘌呤的應(yīng)用，6-芐氨基嘌呤(6-ba)成分明確，在酸堿中穩(wěn)定，來源廣、成分明確、純度高，在制備抗小腸缺血再灌注損傷制品中的新應(yīng)用具有重要的經(jīng)濟價值。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種6-芐氨基嘌呤在制備抗小腸組織損傷藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種6-芐氨基嘌呤在制備抗小腸局部缺血再灌注引起的小腸細胞氧化損傷藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種6-芐氨基嘌呤在制備抗小腸局部缺血再灌注引起的小腸細胞凋亡藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種6-芐氨基嘌呤在制備抗小腸組織損傷食品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第五個目的是提供一種6-芐氨基嘌呤在制備抗小腸局部缺血再灌注引起的小腸細胞氧化損傷食品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第六個目的是提供一種6-芐氨基嘌呤在制備抗小腸局部缺血再灌注引起的小腸細胞凋亡食品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第七個目的是提供一種6-芐氨基嘌呤在制備抗小腸組織損傷保健品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第八個目的是提供一種6-芐氨基嘌呤在制備抗小腸局部缺血再灌注引起的小腸細胞氧化損傷保健品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第九個目的是提供一種6-芐氨基嘌呤在制備抗小腸局部缺血再灌注引起的小腸細胞凋亡保健品中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的一種6-芐氨基嘌呤的應(yīng)用，具有以下有益效果：

本發(fā)明證實了6-芐氨基嘌呤可以作為抗小腸局部缺血再灌注損傷的活性物質(zhì)，并且6-芐氨基嘌呤能有效防護小腸缺血再灌注引起的氧化損傷和小腸細胞凋亡，將其添加到藥物、食品或保健品當中，抑制小腸組織損傷，延緩衰老抗疲勞，增強小腸組織抗缺血再灌注損傷的能力，具有重要的經(jīng)濟應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1是不同組大鼠小腸細胞dna凝膠電泳結(jié)果(×200)；

其中，圖1a為對照組，圖1b為i/r損傷模型組，圖1c為低劑量6-ba保護組，圖1d為高劑量6-ba保護組；

圖2是不同組大鼠小腸細胞caspase-3表達情況(×400)；

其中，圖2a為對照組，圖2b為i/r損傷模型組，圖2c為低劑量6-ba保護組，圖2d為高劑量6-ba保護組。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明的限制。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例

1.藥品與試劑

6-芐氨基嘌呤(6-ba)，購于廈門星隆達化學(xué)試劑有限公司，由美國sanland公司生產(chǎn)，用0.06mol/l的鹽酸配制成1000mg/l、2000mg/l的儲備液；丙二醛(mda)檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(gsh-px)檢測試劑盒、總超氧化物歧化酶(t-sod)檢測試劑盒和考馬斯亮蘭試劑盒，均為南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。低熔點瓊脂糖，sigma；兔抗大鼠caspase-3單克隆抗體，abcam；免疫組化試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。

2.動物分組

雄性sd大鼠80只，購自鄭州大學(xué)實驗動物中心。適應(yīng)環(huán)境7d后，隨機分為4組，每組20只。依次為對照組、i/r損傷模型組(按照常規(guī)方法獲得i/r損傷模型組，此處不再詳述)、低劑量6-ba保護組和高劑量6-ba保護組。低劑量6-ba保護組于術(shù)前3周連續(xù)灌胃6-ba，每天一次按照10mg/kg大鼠的量灌胃一次；高劑量6-ba保護組于術(shù)前3周連續(xù)灌胃6-ba，每天一次按照20mg/kg大鼠的量灌胃一次；對照組和i/r損傷模型組給予同體積的生理鹽水灌胃。

動物術(shù)前12h禁食，不禁水，以3％戊巴比妥鈉(1ml/kg)腹腔注射麻醉。固定后取腹正中切口，對照組在開腹顯露腸系膜上動脈后不作阻斷；i/r損傷模型組、低劑量6-ba保護組和高劑量6-ba保護組則均用無創(chuàng)動脈夾阻斷其系膜血管30min后再灌注60min。實驗結(jié)束后，立即剪取空腸標本待用。

3.6-ba對大鼠小腸i/r損傷后t-sod、gsh-px活性和mda含量的影響

3.1t-sod活力、gsh-px活力和mda含量測定方法

制作10g/100ml小腸組織勻漿，用生理鹽水稀釋成1g/100ml小腸組織勻漿液后參照總超氧化物歧化酶(t-sod)檢測試劑盒說明操作，最后用紫外可見分光光度計在550nm處比色，測定吸光度，計算t-sod活力。

取10g/100ml小腸組織勻漿用生理鹽水稀釋成0.8g/100ml的小腸組織勻漿液后，參照谷胱甘肽過氧化物酶(gsh-px)檢測試劑盒說明操作，最后用紫外可見分光光度計在412nm處比色，測定吸光度，計算gsh-px活力。

取10g/100ml小腸組織勻漿用生理鹽水稀釋成5g/100ml勻漿液后通過tba法參照丙二醛(mda)檢測試劑盒說明操作，最后用紫外可見分光光度計在532nm處比色，測定吸光度，計算mda含量。

3.26-ba對大鼠小腸i/r損傷后t-sod活力、gsh-px活力和mda含量的影響

各組t-sod、gsh-px活力和mda含量的測定結(jié)果見表1。與對照組相比，i/r損傷模型組大鼠t-sod、gsh-px的活力顯著降低(p<0.05)，mda含量顯著升高(p<0.05)，證實i/r損傷模型復(fù)制成功。低劑量6-ba保護組和高劑量6-ba保護組大鼠小腸組織t-sod活力和gsh-px活力顯著高于i/r損傷模型組(p<0.05)，mda含量顯著低于i/r損傷模型組(p<0.05)。高劑量6-ba組的mda含量與對照組間無顯著差異。

表1結(jié)果顯示，6-ba可以顯著修復(fù)小腸組織損傷造成的t-sod活力、gsh-px活力下降問題，可以修復(fù)小腸組織損傷造成的mda含量升高的問題，且高劑量的6-ba修復(fù)效果高于低劑量的6-ba。

表16-ba對大鼠小腸i/r損傷后t-sod、gsh-px活性和mda含量的影響(mean±sd，n＝7)

注：同列數(shù)據(jù)間標有不同字母表示差異顯著(p<0.05)

4.6-ba對大鼠小腸i/r損傷后dna損傷的影響

4.1單細胞凝膠電泳法檢測大鼠小腸dna損傷

分別取對照組、i/r損傷模型組、低劑量6-ba保護組和高劑量6-ba保護組的空腸，制作小腸單細胞懸液，保存?zhèn)溆谩?0℃、0.75％的正常熔點的瓊脂糖100μl鋪于全磨砂載玻片上，放入37℃烘箱過夜烘干后作為底層膠；再取上述50℃、0.75％瓊脂糖110μl加在底膠上，水平放于4℃冰箱中保存20min至凝固，作為第二層膠；吸取70μl制備好的小腸單細胞懸液和140μl在37℃水浴中保溫的0.65％的低熔點瓊脂糖混勻，吸取混勻液110μl滴加在第二層膠上，水平放于4℃冰箱中保存20min至凝固，作為第三層膠。將制備好的膠板浸入細胞裂解液，4℃裂解1h，然后置于電泳槽中加入電泳緩沖液，4℃解旋25min，電泳20min，電泳條件為20v，200ma。電泳結(jié)束后加入中和液中和15min，然后滴加10mg/l的eb水溶液40μl，染色10min。在暗室中用熒光顯微鏡觀察并拍照。每組隨機選取3張膠片，每張顯微鏡下隨機選取8個視野，將彗星尾長>35μm視為拖尾，采用casp軟件測量各組細胞彗星尾部dna含量、彗星尾長并統(tǒng)計拖尾率。

其中，每升細胞裂解液的配方是：2.5mol/lnacl、100nmol/lna2edta、10nmol/ltris，10g/l肌氨酸鈉，臨用前加體積分數(shù)為1％的tritonx-100，10％dmso，溶劑為超純水，ph＝10。每升電泳緩沖液的配方是：lmmol/lna2edta，300mmol/lnaoh，ph＝13，溶劑為超純水，4℃預(yù)冷備用。每升中和液的配方是：0.4mol/l的tris-hcl，溶劑為超純水，ph＝7.5。

各組大鼠小腸細胞dna損傷程度見圖1，其中圖1a為對照組，圖1b為i/r損傷模型組，圖1c為低劑量6-ba保護組，圖1d為高劑量6-ba保護組，由圖1可知，對照組細胞核大小比較均一，為圓形熒光團，熒光強度均勻，邊緣光滑，未出現(xiàn)明顯彗星狀拖尾；i/r損傷模型組小腸dna損傷嚴重、彗星頭部較其它組變小，出現(xiàn)明顯彗星狀尾巴；低劑量6-ba保護組和高劑量6-ba保護組小腸細胞dna拖尾減輕，尾長減小，且高劑量6-ba保護組的小腸細胞dna拖尾減輕幅度更大，尾長明顯減小。

各組細胞尾部dna含量和拖尾率見表2。由表2可知，與對照組相比，i/r損傷模型組細胞尾部dna含量和拖尾率顯著升高(p<0.05)。與模型組相比，低劑量6-ba保護組和高劑量6-ba保護組顯著降低尾部dna含量和拖尾率(p<0.05)，且高劑量6-ba保護組降低幅度更大。上述結(jié)果表明，6-ba可以顯著修復(fù)大鼠小腸i/r引發(fā)的dna損傷，較少小腸細胞凋亡。

表26-ba對大鼠小腸i/r損傷后dna損傷的影響(mean±sd，n＝5)

注：同列數(shù)據(jù)間標有不同字母表示差異顯著(p<0.05)

5.6-ba對大鼠小腸i/r損傷后caspase-3表達的影響

5.1免疫組化法檢測大鼠小腸凋亡相關(guān)蛋白caspase-3的表達水平

采用免疫組化法檢測大鼠小腸組織切片中caspase-3(1:200)蛋白表達。參照免疫組化試劑盒，嚴格按照步驟進行。一抗4℃過夜，以pbs做陰性對照。dab染色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、干燥。光學(xué)顯微鏡下觀察到組織細胞中出現(xiàn)黃色顆粒為陽性。

各組大鼠小腸i/r損傷后caspase-3表達情況見圖2，其中，圖2a為對照組，圖2b為i/r損傷模型組，圖2c為低劑量6-ba保護組，圖2d為高劑量6-ba保護組。與對照組相比，i/r損傷模型組大鼠小腸i/r損傷后caspase-3免疫反應(yīng)陽性細胞數(shù)量顯著增多；而低劑量6-ba保護組和高劑量6-ba保護組caspase-3陽性率明顯弱于i/r損傷模型組，證實6-ba明顯改善了小腸缺血再灌注誘發(fā)的小腸組織損傷。

i/r損傷是由缺血組織或者器官在恢復(fù)血流灌注后，產(chǎn)生的組織或器官損傷加重的現(xiàn)象，i/r損傷主要是由于再灌注期間，自由基的大量生成、炎癥反應(yīng)、凋亡等引起的。上述實驗證明大量實驗證實了6-芐氨基嘌呤可以作為抗小腸局部缺血再灌注損傷的活性物質(zhì)，并且6-芐氨基嘌呤能有效防護小腸缺血再灌注引起的氧化損傷和小腸細胞凋亡，將其添加到藥物、食品或保健品當中，抑制小腸組織損傷，延緩衰老抗疲勞，增強小腸組織抗缺血再灌注損傷的能力，具有重要的經(jīng)濟應(yīng)用價值。

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明進行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。