交叉引用本申請要求于2011年4月21日提交的美國臨時專利申請No.61/477,958，所述申請通過引用整體并入本文。
背景技術：
：納米顆粒是直徑尺寸范圍通常為小至一納米到大至幾百納米的非常小的顆粒。納米顆粒的小尺寸允許其被開發(fā)以用來生產各種產品諸如染料和顏料；美化或功能涂層；用于生物探索、醫(yī)療成像和治療學的工具；磁性記錄媒介；量子點；以及甚至均勻且納米尺寸的半導體。淀粉樣沉積物和神經原纖維纏結(NFT，也稱為成對螺旋絲，PHF)是包括阿爾茨海默氏病(AD)的各種疾病的標志。在本領域中需要對患有或疑似患有AD的活個體腦中的淀粉樣沉積物和NFT成像的方法。文獻美國專利No.6,548,264和6,767,635；Berry和Curtis(2003)J.Phys.D：AppliedPhysics36：R198-R206；Pankhurst等(2003)J.Phys.D：AppliedPhysics36：R167-R181；Dousset等(1999)Am.J.Neuroradiol.20：223-227；Dunning等(2004)J.Neurosci.24：9799-9810；Dousset等(1999)MagneticResonanceinMedicine41：329-333；Moghimi等(2001)Pharmacol.Rev.53：283-318；Puchtler等(1962)J.Histochem.Cytochem.10：35；Klunk等(2004)AnnalsNeurol.55：306；美國專利No.7,270,800；美國專利No.6,274,119；Agdeppa等(2003)Neurosci.117：723；美國專利No.5,411,730；美國專利No.6,534,039；美國專利公布No.2008/0206146；WO2006/102377；Lee等(2003)J.Neuroimaging13：199。發(fā)明概述本公開提供包含結合β-淀粉樣沉積物和/或NFT(PHF)的官能團的官能化磁性納米顆粒(MNP)。本公開提供包含官能化MNP的組合物和使用官能化MNP對β-淀粉樣沉積物和/或NFT(PHF)成像的方法。附圖簡要說明圖1A和1B示出未治療大鼠腦的磁共振(MR)圖像。圖2A和2B示出阿爾茨海默氏病的大鼠模型的腦MR圖像。圖3A和3B示出為阿爾茨海默氏病的大鼠模型的第二只大鼠的腦MR圖像。圖4A-C示出AD大鼠模型的腦的代表性MR圖像。圖5A-D使用MRI示出大鼠AD模型的腦中的擴散斑塊的存在。對大鼠AD模型施用DNP-MNP。圖6A和6B示出AD的轉基因大鼠模型的DAB增強的Perl染色。圖7示出綴合2-(1-{6-[(2-羥乙基)(甲基)氨基]-2-萘基}亞乙基)丙二腈(HODDNP)至磁性納米顆粒的方法。圖8示出綴合(4’-氨基苯基)-6-羥基苯并噻唑(PIB-2)至磁性納米顆粒的方法。定義如本文所使用，術語“納米顆?！笔侵钢睆皆诩s1至1000nm之間的顆粒。類似地，術語“納米顆粒群(nanoparticles)”是指平均直徑為約1至1000nm之間的多個顆粒。提及的納米顆粒的“尺寸”是指納米顆粒的最大直的尺寸的長度。例如，完全球狀納米顆粒的尺寸是它的直徑。如本文所使用，與“官能片段”和“官能配基”可互換使用的術語“官能團”是指賦予具有化學基團的制品(如納米顆粒)特定功能的化學基團。例如，官能團可包括己知結合特定分子的物質諸如抗體、低聚核苷酸、生物素，或鏈酶親和素；或諸如胺、羧酸酯等的小分子基團。如本文所使用，“受試者”或“個體”或“患者”指需要診斷、預后或治療的任何受試者，并通常指根據所發(fā)明來實踐的診斷方法、預后方法或治療方法的接受者。受試者可以是任何哺乳動物，如人、非人靈長類動物、家養(yǎng)牲畜、實驗室受試者(如與β-淀粉樣沉積物和/或NFT相關的疾病的非人動物模型；如嚙齒類諸如大鼠)或寵物。如本文所使用，術語“治療(treatment)、”“治療(treating)”等指獲得期望的藥理和/或生理效應。在完全或部分防止疾病或其癥狀方面，所述效應可以是預防性的，和/或在部分或完全治愈疾病和/或由該疾病引起的不利影響方面，所述效應可以是治療性的。如本文所使用，“治療”包括在哺乳動物特別在人中的疾病的任何治療，并包括：(a)防止疾病或疾病的癥狀在可對疾病易感但還未被診斷為患有該疾病(如包括可與原發(fā)性疾病相關或由原發(fā)性疾病引起的疾病)的受試者中發(fā)生；(b)抑制疾病，即阻止其發(fā)展；和(c)減輕疾病，即引起疾病的消退。在進一步描述本發(fā)明前，應理解此發(fā)明不限于描述的特定實施方案，因此當然可以發(fā)生變化。還應當理解，本文所用的術語只是為了描述特定實施方案，并非旨在進行限制，因為本發(fā)明的范圍將僅由所附權利要求書來限定。如果提供了值的范圍，則應當理解，介于該范圍上限與下限之間的每個居間值(直至下限單位的十分之一，除非上下文另有明確指出)且該所述范圍內的任何其他所述值或居間值均涵蓋在所發(fā)明內。這些較小范圍的上限和下限可獨立地被包括在所述較小范圍內且也涵蓋在所發(fā)明中，受所述范圍內任何具體排除的限值的約束。如果所述范圍包括限值的一個或兩個，則排除這些所包括的限值一者或兩者的范圍也包括在所發(fā)明內。除非另有定義，否則本文所用的所有技術和科學術語具有與此發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常所理解相同的含義。盡管在實踐或測試本發(fā)明中也可使用與本文描述的那些方法和材料相似或相等的任何方法和材料，但是現在描述優(yōu)選的方法和材料。本文提及的所有公布以引用方式并入以公開和描述與引用的公布相關的方法和/或材料。必須注意除非上下文另外清楚地指明，否則如本文和在所附權利要求中使用的，單數形式“一個、”“一種、”和“該”包括復數的指示物。因此，例如，提及的“官能化磁性納米顆?！卑ǘ鄠€此類官能化磁性納米顆粒而提及的“HODDNP部分”包括提及的本領域技術人員已知的一種或多種HODDNP部分及其等同物等。進一步指出，撰寫權利要求可排除任何可選元素。因此，該陳述意圖用作與權利要求要素的描述聯合使用此類排他性術語“單獨地、”“僅僅”等或使用“否定”限制的在先基礎。應了解為清楚起見，在單獨實施方案的上下文中描述的所發(fā)明的某些特征也可在單個實施方案中組合提供。相反地，還可分開地或以任何適合的子組合(sub-combination)的方式提供所發(fā)明的各種特征，為簡便起見所述特征被描述于單個實施方案的上下文中。關于所發(fā)明的實施方案的所有組合被明確地包括在本發(fā)明中并公開于本文中，就如同每個和每一個組合被個別地且明確地公開。此外，各種實施方案的所有子組合及其元素也被明確地包括在本發(fā)明中并在本文公開，就如同每個和每一個此類子組合中個別地和清楚地在本文公開。本文所論述的公布僅針對它們在本申請?zhí)峤蝗罩暗墓_內容而提供。不得將本文任何條款視為允許本發(fā)明未經授權依靠現有發(fā)明先于此公開內容。進一步地，所提供的公布日可不同于實際的公開日(所述日期可能需要獨立地進行確認)。發(fā)明詳述本公開提供適合用于對患有或疑似患有β-淀粉樣沉積物和/或NFT的活個體的腦組織成像的官能化磁性納米顆粒(MNP)。主題官能化MNP區(qū)分具有淀粉樣沉積物和/或神經原纖維纏結(NFT，已知為成對螺旋絲PHF)的神經組織與正常神經組織。主題官能化MNP可用于在疾病例如唐氏綜合征或阿爾茨海默病(AD)中檢測和定量淀粉樣沉積物和/或NFT。主題官能化MNP可用于檢測和定量患有與β-淀粉樣沉積物和/或NFT存在有關或者由其引起的疾病的活的哺乳動物如人、非人動物或非人動物模型的腦中的淀粉樣沉積物和/或NFT。向活的哺乳動物施用包含主題MNP官能化的藥物組合物。存在于腦中的任何β-淀粉樣沉積物(如聚集的β-淀粉樣諸如可與神經原纖維纏結相關)可使用磁共振成像(MRI)或任何其他適當的成像方法來可視化。官能部分可連接至磁性納米顆粒的官能團(部分)包括提供用于結合至β-淀粉樣肽的聚集體和/或NFT的官能團。提供用于結合至β-淀粉樣肽的聚集體和/或NFT且可被連接至磁性納米顆粒的適合的官能團包括2-(1-{6-[(2-羥乙基)(甲基)氨基]-2-萘基}亞乙基)丙二腈(HODDNP)及其類似物和衍生物。提供用于結合至β-淀粉樣肽的聚集體且連接至磁性納米顆粒的適合的官能團包括(4’-氨基苯基)-6-羥基苯并噻唑(PIB-2)及其類似物和衍生物?？蓪ODDNP通過HODDNP分子中的許多連接位點的任何一個綴合至MNP。HODDNP具有下式：例如，經由HODDNP的羥基部分可將HODDNP綴合至MNP。作為一個非限制性實例，HODDNP-綴合的MNP可通過適當的連接子經由HODDNP的羥基部分通過共價連接HODDNP至環(huán)氧-MNP來制備?？蓪ODDNP直接地或通過適當的連接子通過分子或其修飾物、前體、衍生物或變體的任何氮或碳的部分共價或非共價地鍵合至MNP。通過在PIB-2分子中許多連接位點的任何一個，可將PIB-2綴合至MNP。PIB-2具有下式：例如，可經由PIB-2的氨基氮將PIB-2綴合至MNP。作為一個非限制性實例，PIB-2-綴合的MNP可通過適當的連接子經由PIB-2的氨基氮通過共價連接PIB-2至環(huán)氧-MNP來制備。同樣，經由PIB-2的酚氧，可將PIB-2綴合至MNP。作為一個非限制性實例，PIB-2-綴合的MNP可通過適當的連接子經由PIB-2的酚氧通過共價連接PIB-2至環(huán)氧-MNP來制備?？蓪IB-2直接地或通過適當的連接子通過分子的或其修飾物、衍生物或變體的任何氫、氧、硫或碳部分共價或非共價地鍵合至MNP。可被偶聯至MNP的其它適合的官能部分包括但不限于，1)W-372(7-甲氧基-2(6-氟吡啶-3-基)咪唑并[2,1-b]-8-吡啶并噻唑)2)Bay-94-9172(ZK6013443；{4-[2-(4-{2-2[2-(2-氟-乙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-苯基)-乙烯基]-苯基}-甲基-胺))3)BF-227(2-(2-[2-二甲基氨基噻唑-5-基]乙烯基)-6-(2-[氟]乙氧基)苯并噁唑)4)SB-13(4-N-甲基氨基-4'-羥基芪)5)AV-45((E)-4-(2-(6-(2-(2-(2-(氟乙氧基)乙氧基)乙氧基)吡啶-3-基)乙烯基)-N-甲基苯胺)6)AZD-2184(2-[6-(甲基氨基)吡啶-3-基]-1,3-苯并噻唑-6-醇)7)PK11195(1-(2-氯苯基)-N-甲基-N-(1-甲基丙基)-3-異喹啉-甲酰胺)8)DAA1106(N-(2-苯氧基-5-氟苯基)-N-(2,5-二甲氧基芐基)乙酰胺)和9)DED(N,N-二乙基二乙烯基三胺)或其衍生物或類似物。在任何上述的官能部分中，氟基團可被氧替代。例如，可將適合的官能部分經由官能部分的羥基部分綴合至MNP。作為一個非限制性實例，官能部分-綴合的MNP可通過適當的連接子經由官能部分的羧基部分直接或通過共價連接官能部分至環(huán)氧-MNP來制備。例如，可被偶聯至MNP的其它適合的官能部分包括但不限于，1)W-372-22)Bay-94-9172-23)BF-227-24)AV-45-25)PK11195-2和6)DAA1106-2或其衍生物或類似物。在任何上述任何官能部分，氟基團可被氨基團替代。例如，可將包含氨基團的官能部分經由官能部分的氨基團直接或經由連接子綴合至MNP。作為一個非限制性實例，官能部分-綴合的MNP可通過適當的連接子經由官能部分的氨基團通過共價連接官能部分至環(huán)氧-MNP來制備。例如，可被偶聯至MNP的其它適合的官能部分包括但不限于，1)W-372-32)Bay-94-9172-33)BF-227-34)AV-45-35)PK11195-3和6)DAA1106-3或其衍生物或類似物。在任何上述任何官能部分，氟基團可被硫醇基團替代。例如，可將包括硫醇基團的官能部分經由官能部分的硫醇基團直接或經由連接子綴合至MNP。作為一個非限制性實例，官能部分-綴合的MNP可經由官能部分的硫醇基團通過適當的連接子經由官能部分的共價連接至環(huán)氧-MNP來制備。例如，可被偶聯至MNP的其它適合的官能部分包括但不限于，1)W-372-42)Bay-94-9172-43)BF-227-44)AV-45-45)PK11195-4和6)DAA1106-4或其衍生物或類似物。在上述任何官能基團中，烷基基團可被羥基烷基替代。例如，可將適合的官能部分直接或通過連接子經由適合的官能部分的羥基部分綴合至MNP。作為一個非限制性實例，官能部分-綴合的MNP可經由官能部分的羧基部分通過適當的連接子通過共價連接官能部分至環(huán)氧-MNP來制備。例如，可被偶聯至MNP的其它適合的官能部分包括但不限于，1)SB-13-52)AZD-2184-5和3)DED-5或其衍生物或類似物。在上述任何官能基團，烷基基團可被硫烷基替代。例如，可將適合的官能部分經由適合的官能部分的硫醇部分綴合至MNP。作為一個非限制性實例，官能部分-綴合的MNP可通過適當的連接子經由官能部分的硫醇部分通過共價連接官能部分至環(huán)氧-MNP來制備。例如，可被偶聯至MNP的其它適合的官能部分包括但不限于，1)SB-13-62)AZD-2184-6和3)DED-6或其衍生物或類似物。主題官能化MNP的官能部分可具有對β-淀粉樣肽(如聚集的β-淀粉樣肽)和/或NFT的親和力。例如，該官能部分可具有對β-淀粉樣肽(如聚集的β-淀粉樣肽)和/或NFT約10-6M、10-7M、10-8M或大于10-8M的親和力。主題官能化MNP可包括放射性標記，如官能部分可包括放射性標記?？蛇x地，主題官能化MNP不包括放射性標記，如官能部分不包括放射性標記，并且官能化MNP的其他組分不包括放射性標記。主題官能化MNP可穿過血腦屏障。主題官能化MNP提供在受影響的組織(如具有β-淀粉樣沉積物和/或NFT的腦組織)T2、T2*、和T1時間的對比以使得組織對MRI可見。主題官能化MNP具有相對長的半衰期(如t1/2為約2小時至約14天；如約2小時至約4小時、約4小時至約8小時、約8小時至約16小時、約16小時至約24小時、約24小時至約2天、約2天至約4天、約4天天至約7天或約7天至約2周)。磁性納米顆粒主題納米顆粒的平均尺寸范圍通常為1nm至約1000nm，如約1nm至約10nm、約10nm至約50nm、約50nm至約100nm、約100nm至約250nm、約250nm至約500nm、約500nm至約750nm或約750nm至約1000nm。在一些實施方案中平均直徑范圍是約10nm至約1000nm，如約10nm至約20nm、約20nm至約40nm、約40nm至約60nm、約60nm至約80nm、約80nm至約100nm、從約100nm至約200nm、約200nm至約400nm、約400nm至約600nm、約600nm至約800nm或約800nm至約1000nm。納米顆?？梢允欠肿拥暮唵尉奂w或它們可被構造成兩層或多層不同的物質。例如，由磁鐵礦或磁赤鐵礦組成的簡單的納米顆粒適合使用。參見，例如ScientificandClinicalApplicationsofMagneticMicrospheres,U.Hafeli,W.Schutt,J.Teller和M.Zborowski(編輯)PlenumPress,NewYork,1997；和Tiefenauer等人,BioconjugateChem.4：347,1993.更復雜的納米顆?？捎蓮囊环N物質制備的核心和從另一種物質制備的一種或多種殼組成。術語“磁性納米顆?！卑槾判约{米顆粒、逆磁性納米顆粒和鐵磁性納米顆粒。根據所發(fā)明，納米顆粒的示例性核心材料是通常組合物MeOxFe2O3鐵氧體，其中Me是二價金屬諸如Co、Mn或Fe。其他適合的材料是γ-Fe2O3、純金屬Co、Fe、Ni和金屬化合物諸如碳化物和氮化物。核心材料通常是MRI可見的試劑。核心材料通常被涂覆。適合的涂層包括但不限于葡聚糖、白蛋白、淀粉、硅等。許多不同類型的小顆粒(納米顆?；蛭⒚壮叽珙w粒)可商購自如下幾個不同制造商，所述制造商包括：BangsLaboratories(Fishers，Ind.)；Promega(Madison,Wis.)；DynalInc.(LakeSuccess,N.Y.)；AdvancedMagneticsInc.(Surrey,U.K.)；CPGInc.(LincolnPark,N.J.)；CortexBiochem(SanLeandro,Calif.)；EuropeanInstituteofScience(Lund,Sweden)；FerrofluidicsCorp.(Nashua,N.H.)；FeRxInc.；(SanDiego,Calif.)；ImmuniconCorp.；(HuntingdonValley,Pa.)；MagneticallyDeliveredTherapeuticsInc.(SanDiego,Calif.)；MiltenyiBiotecGmbH(USA)；MicrocapsGmbH(Rostock,Germany)；PolyMicrospheresInc.(Indianapolis,Ind.)；ScigenLtd.(Kent,U.K.)；SeradynInc.；(Indianapolis,Ind.)；和SpherotechInc.(Libertyville,Ill.)。這些顆粒的大部分是使用諸如研磨和碾碎、乳化聚合、嵌段共聚和微乳化的常規(guī)技術制備的。二氧化硅納米顆粒的制備方法也已有報道。所述方法包括微晶核聚集(Philipse等，Langmuir，10：92,1994)；用插入的二氧化硅增強的超順磁性聚合物納米顆粒(Gruttner，C和JTeller，JournalofMagnetismandMagneticMaterials194：8,1999)；和微波介導的自組裝(Correa-Duarte等，Langmuir，14：6430,1998)。主題納米顆粒核心是磁性的且可包括選自由磁鐵礦、磁赤鐵礦和硫復鐵礦組成的組的金屬。磁性納米顆?？墒褂米鳛楹诵牡囊徊糠值拇判圆牧?諸如磁鐵礦、磁赤鐵礦和硫復鐵礦)來制備。通過改變此類磁性核心的總尺寸和形狀，它們可被制備為超順磁性的或為穩(wěn)定的單域(從磁場中取出后仍保持穩(wěn)定的磁矩的顆粒)。核心尺寸涉及磁性納米粒子是否為超順磁性的或單磁區(qū)的。因此，相對等量綱的超順磁性核心顆粒通常具有尺寸小于50-80nm的核心。當顆粒尺寸超過此上限時，顆粒的磁化強度被分成具有不同磁化矢量的不同區(qū)域以最小化內部磁能。在一些實施方案中，核心包括可以是無機鹽諸如高錳酸鉀、重鉻酸鉀、硫酸鎳、氯化鈷、三氯化鐵(III)或硝酸銅的顏料。類似地，核心可包括染料諸如Ru/Bpy、Eu/Bpy等；或金屬諸如Ag和Cd。在一些實施方案中，主題修飾的納米顆粒包含核心和包裹所述核心的二氧化硅殼例如，如美國專利No.6,548,264所描述，將官能團綴合至二氧化硅殼。用于將官能團連接至二氧化硅的許多已知方法可適用于本發(fā)明。參見，如RalphK.Iler,TheChemistryofSilica：Solubility,Polymerization,ColloidandSurfaceProperties,andBiochemistry,Wiley-Interscience,NY,1979；VanDerVoort,P.和Vansant,E.F.,JournalofLiquidChromatographyandRelatedTechnologies,19：2723-2752,1996；以及ImmobilizedEnzymes.Antigens,Antibodies,andPeptides：PreparationandCharacterization,HowardH.Weetall(編輯),M.Dekker,NY,1975。用于將官能團加至涂覆有二氧化硅的納米顆粒的典型方法包括用與納米顆粒的二氧化硅表面反應并將化學基團偶聯至所述二氧化硅表面上的硅烷化劑來處理納米顆粒。該化學基團本身可以是官能團，或者它可以用作可將所述官能團偶聯其上的底物。例如，在示例性方法中，如上所述制備涂覆有二氧化硅的納米顆粒并使用三甲基甲硅烷基丙基-二亞乙基三胺(DETA)(其為將伯胺基團連接至二氧化硅表面的硅烷化劑)對顆粒的表面進行硅烷化。然后使用溴化氰(CNBR)法，可將官能團共價偶聯至硅烷化的表面。作為一個實例，CNBR介導的偶聯可通過將預先用DETA硅烷化的涂覆有二氧化硅的納米顆粒懸浮在2M碳酸鈉緩沖液中并進行超聲處理混合物以產生顆粒懸浮液來獲得。然后將CNBR的溶液(如2gCNBR/1ml乙腈)加入到顆粒懸浮液中以活化納米微粒。用中性緩沖液(如PBS，pH8)洗滌納米顆粒后，加入抗體溶液至活化的納米顆粒懸液中，導致抗體能夠鍵合至納米微粒上。也可加入甘氨酸溶液至涂覆有抗體的納米顆粒以封閉任何殘留的未反應位點。在一些實施例中，磁性納米顆粒被葡聚糖涂覆。使用任何已知方法制備磁性納米顆粒。例如，磁性鐵-葡聚糖顆粒是通過將等體積的含有1.51gFeCl3-6H2O和0.64gFeCl2-4H2O的水溶液與10ml50％(w/w)水性葡聚糖T-40(Pharmacia)混合來制備的。在攪拌的同時，通過逐滴加入被加熱(在水浴中15分鐘)至60-65℃的7.5％(v/v)NH4OH，將混合物滴定至pH10-11。然后通過低速臨床離心機在3個循環(huán)的離心(600xg5分鐘)來除去聚集體。通過SephacrylS-300上的凝膠過濾層析從未鍵合的葡聚糖中分離出鐵磁性的鐵-葡聚糖顆粒。然后將5ml反應混合物施加至2.5×33cm的柱并在pH6.5下用0.1M乙酸鈉和0.15MNaCl洗脫。在空隙體積中收集的純化的鐵磁性的鐵-葡聚糖顆粒將具有7-10mg/ml的濃度，如干重分析所測定。Molday和Mackenzie(1982)JournalofImmunologicalMethods52：353-367.也參見(Xianqiao(2003)ChinaParticuology第1卷，第2期,76-79)。所得的磁性納米顆?？苫诔叽绾突蛲ㄟ^具有適當的磁場強度的高梯度磁場分離時的磁性特征而被分離。在一些實施方案中，涂覆的納米顆?？砂h(huán)氧基團。圖8和9闡述了包含環(huán)氧基團的涂覆的納米顆粒的實例。對于涂覆有二氧化硅的納米顆粒，二氧化硅涂層可包含環(huán)氧基團。例如，可使用環(huán)氧硅烷。對于涂覆有葡聚糖的納米顆粒，葡聚糖涂層可包含環(huán)氧基團。例如，環(huán)氧修飾的葡聚糖可通過葡聚糖與具有環(huán)氧基團的試劑反應來制備。例如，葡聚糖的羥基基團可反應以形成包含環(huán)氧基團的甲硅烷基化的葡聚糖。涂層可具有以下厚度(如從核心磁性顆粒的外表面到涂層的內表面的平均距離)：約1nm至約500nm，如約1nm至約5nm、約5nm至約10nm、約10nm至約15nm、約15nm至約20nm、約20nm至約25nm、約25nm至約30nm、約30nm至約40nm、約40nm至約50nm、約50nm至約60nm、約60nm至約70nm、約70nm至約80nm、約80nm至約90nm、約90nm至約100nm、約100nm至約125nm、約125nm至約150nm、約150nm至約175nm、約175nm至約200nm、約200nm至約225nm、約225nm至約250nm、約250nm至約275nm、約275nm至約300nm。涂層的厚度與磁性核心顆粒的直徑的比率為約1：1至約1：1000，如約1：1至約1：1.5、約1：1.5至約1：2、約1：2至約1：2.5、約1：2.5至約1：5、約1：5至約1：10、約1：10至約1：25、約1：25至約1：50、約1：50至約1：100、約1：100至約1：250、約1：250至約1：500、約1：500至約1：750或約1：750至約1：1000。在一些實施方案中，主題官能化磁性納米顆粒具有式：M-(L)-Z，L和Z之間的連接位點具有共價鍵合的官能團，其中M代表磁性核心顆粒，L代表任選的連接基團，且Z代表官能團。在其他的實施方案中，主題官能化磁性納米顆粒具有下式：M-S-(L)-Z，S和L以及L和Z之間的連接位點具有共價鍵合的官能團，其中M代表磁性核心顆粒，其中S代表固定到M的生物相容性基物，其中M代表磁性核心顆粒，L代表任選的連接基團，且Z代表官能團。官能團包括提供用于結合β-淀粉樣肽(如聚集的β-淀粉樣肽)和/或NFT的部分；提供穿過BBB的部分；治療劑；等。在一些實施方案中，主題官能化磁性納米顆粒包含連接至相同核心顆粒的兩個或多個不同的官能團。例如，在一些實施方案中，主題官能化磁性納米顆粒具有式M-(L)-Z1Z2或M-S-(L)-Z1Z2，其中Z1和Z2是不同的官能團。例如，在一些實施方案中，Z1是結合部分β-淀粉樣肽(如聚集的β-淀粉樣肽)和/或NFT；且Z2是治療劑。例如，在其他實施方案中，Z1是提供穿過BBB的部分；且Z2是提供用于結合至β-淀粉樣肽(如聚集的β-淀粉樣肽)和/或NFT的結合部分。Z1和Z2部分直接地或經由連接子獨立地連接至核心顆?；蚓酆衔?。在一些實施方案中，主題官能化磁性納米顆粒包含至少一個第三官能部分Z3。磁性核心顆粒由通式MeOxFe2O3的磁鐵礦、磁赤鐵礦、鐵氧體組成，其中Me是二價金屬，諸如鈷、錳、鐵、或鈷、鐵、鎳、碳化鐵或氮化鐵，如上所述。如果存在，底物S由諸如以下的化合物形成：多糖或寡糖或其衍生物，諸如葡聚糖、羧甲基葡聚糖、淀粉、二醛淀粉、甲殼質、藻酸鹽、纖維素、羧甲基纖維素；蛋白質或其衍生物，諸如白蛋白、肽；合成聚合物，諸如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯亞胺、聚甲基丙烯酸酯；雙官能羧酸及其衍生物，諸如巰基丁二酸或羥基羧酸。連接子基團L是由諸如以下的化合物的反應形成：聚二羧酸和二羧酸(poly-anddicarboxylicacid)、多羥基羧酸、二胺、氨基酸、肽、蛋白質、脂質、脂蛋白、糖蛋白、凝集素、寡糖、多糖、寡核苷酸及其烷基化衍生物，以及以單鏈或雙鏈形式存在的核酸(DNA、RNA、PNA)及其烷基化衍生物，所述化合物包括至少兩個相同或不同的官能團。主題官能化磁性納米顆粒能夠通過血-腦屏障。例如，主題官能化磁性納米顆粒可包含連接至納米顆粒上的或在具有或涂覆納米顆粒的制劑中的一種或多種聚合物。促進穿過血腦屏障的適合的聚合物包括但不限于表面活性劑諸如聚山梨醇酯(如20、40、60和80)；泊洛沙姆諸如F68；等。在一些實施方案中，主題官能化磁性納米顆粒涂覆有聚山梨糖醇酯諸如80(其為聚氧乙烯-80-脫水山梨糖醇單油酸酯)、40(其是聚氧乙烯脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯)；60(其為聚氧乙烯脫水山梨糖醇單硬脂酸酯)，20(其為聚氧乙烯-20-脫水山梨糖醇單月桂酸酯)；聚氧乙烯20脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯；聚氧乙烯20脫水山梨糖醇單硬脂酸酯；聚氧乙烯20脫水山梨糖醇單油酸酯等。同樣適用的是水溶性聚合物，包括如聚醚，例如聚亞烷基氧化物(polyalkyleneoxides)，諸如聚乙二醇(“PEG”)、聚環(huán)氧乙烷(“PEO”)、聚環(huán)氧乙烷共(-co-)聚環(huán)氧丙烷(“PPO”)、共-聚環(huán)氧乙烷的嵌段或無規(guī)共聚物和聚乙烯醇(“PVA”)；聚(乙烯基吡咯烷酮)(“PVP”)；聚(氨基酸)；葡聚糖和蛋白質(諸如白蛋白)。嵌段共聚物是適用的，如聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷(PEO-PPO-PEO)三嵌段共聚物(如F68)；等；參見如美國專利No.6,923,986。在包括如Chen等(2004)Curr.DrugDelivery1：361-376的各種出版物中討論了穿過血腦屏障的其它方法。在一些實施方案中，主題官能化MNP包含一種或多種提供逃避網狀內皮系統(RES)的試劑。提供用于逃避RES的試劑包括但不限于嵌段共聚物非離子表面活性劑，諸如泊洛沙姆(諸如泊洛沙姆508、泊洛沙姆908、泊洛沙姆1508)等。在一些實施方案中，主題官能化MNP包含約1％的泊洛沙姆。也可將納米顆粒通過利用存在于BBB中的特定的遞送通道轉移穿過血腦屏障(BBB)。作為一個非限制性實例，將2-脫氧葡萄糖連接至納米顆粒使得葡萄糖通道易接收這些顆粒并有助于遞送穿過BBB。在有或沒有存在于血腦屏障中的通道的調節(jié)下，其它機制是轉胞吞作用(transcytosis)和血細胞滲出。使用神經外科技術，可將主題官能化磁性納米顆粒遞送至中樞神經系統(CNS)。在病情嚴重的患者諸如事故受害者或那些患有各種形式癡呆的患者的情況下，批準進行外科手術干預，盡管其伴有風險。例如，可通過直接物理引入至CNS(諸如心室內或鞘內注射)來遞送主題官能化磁性納米顆粒。心室內注射可以借助例如連接到一個儲器(如Ommaya儲器)的心室內導管。引入的方法也可由可再充電或生物可降解裝置提供。另一個途徑是通過增加血-腦屏障的滲透性的物質破壞血腦屏障。實例包括動脈內輸注擴散能力較差的試劑(諸如甘露醇)、增加腦血管滲透性的藥物(諸如依托泊苷)或血管活性劑(諸如白三烯)。Neuwelt和Rappoport(1984)Fed.Proc.43：214-219；Baba等(1991)J.Cereb.BloodFlowMetab.11：638-643；和Gennuso等(1993)CancerInvest.11：638-643。進一步地，需要局部施用主題官能化磁性納米顆粒至需要診斷或治療的區(qū)域；這可通過例如在外科手術期間局部輸注獲得、通過借助于導管或借助于植入物的注射獲得，所述植入物是多孔、非多孔或凝膠狀材料，包括膜(諸如硅橡膠膜)或纖維。主題官能化磁性納米顆粒也可以通過使用包括化學修飾的藥理學技術來遞送使得主題官能化磁性納米顆粒將穿過血腦屏障。主題官能化磁性納米顆粒可被修飾以增加納米顆粒的疏水性，降低納米顆粒的凈電荷或分子量，或修飾納米顆粒，使得它將類似一個正常運輸的穿過血腦屏障的顆粒。Levin(1980)J.Med.Chem.23：682-684；Pardridge(1991)見：PeptideDrugDeliverytotheBrain；和Kostis等(1994)J.Clin.Pharmacol.34：989-996。封裝主題官能化磁性納米顆粒于諸如脂質體的疏水環(huán)境中也有效地將藥物遞送至CNS。例如WO91/04014描述一種脂質體遞送系統，其中藥物被封裝在已添加正常運輸穿過血腦屏障的分子的脂質體內。配制穿過血-腦屏障的主題官能化磁性納米顆粒的另一種方法是封裝主題官能化磁性納米顆粒于環(huán)糊精中。可以采用任何穿過血-腦屏障的適合的環(huán)糊精，包括但不限于α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精及其衍生物。一般參見美國專利No.5,017,566、5,002,935和4,983,586。此類組合物也可以包括如美國專利No.5,153,179所討論的甘油衍生物。在一些實施方案中，主題官能化磁性納米顆粒能夠進入腦中的細胞，如穿過細胞膜并進入細胞的細胞質。用于進入腦中的細胞的機制包括如在有或沒有適當的膜通道調節(jié)時的轉胞吞作用和血細胞滲出。治療劑除結合β-淀粉樣沉積物和或NFT的官能團外，主題官能化MNP可包括治療劑如適用于治療AD的治療劑。適合的治療劑包括用于治療AD的試劑，其中此類試劑包括但不限于乙酰膽堿酯酶抑制劑，包括但不僅限于安理申(Aricept)(多奈哌齊(donepezil))、艾斯能(Exelon)(卡巴拉汀(rivastigmine))、美曲膦酯(metrifonate)、拉扎啶(Razadyne)(加蘭他敏(galantamine))和他克林(tacrine)(考克尼克斯(Cognex))；非類固醇類的抗炎劑包括但不僅限于布洛芬和吲哚美辛；環(huán)氧化酶-2(Cox2)抑制劑諸如塞來昔布(Celebrex)；單胺氧化酶抑制劑諸如司來吉蘭(Selegilene)(咪多吡(Eldepryl)或地普雷尼爾(Deprenyl))；和N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)拮抗劑諸如鈉門達(Namenda)(美金剛(memantine))。用于治療AD的另一種適合的另一種治療劑是減少apoE4結構域相互作用的apoE4“結構校正劑”。減少apoE4結構域相互作用的試劑包括如在美國專利公布No.2006/0073104；和Ye等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA102：18700中所描述的試劑。用于治療AD的另一種適合的另外的治療劑是抑制tau聚集的試劑，如在美國專利No.7,605,179所描述的抑制tau聚集的萘醌衍生物。另一種適合的另外的治療劑是抑制tau磷酸化的試劑，如在美國專利No.7,572,793描述的抑制tau蛋白激酶1的3-取代-4-嘧啶酮衍生物。組合物本公開進一步提供組合物，包括包含主題官能化MNP的藥物組合物。包含主題官能化磁性納米顆粒的組合物包括以下的一種或多種：鹽、緩沖劑、pH調節(jié)劑、非離子型洗滌劑、蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑等。包含主題官能化MNP的藥物組合物將包含一種或多種藥學上可接受的載體。如本文所使用，“藥學上可接受載體”包括任何材料，當與組合物的活性成分組合時，所述材料允許成分保持生物活性且不會引起與受試者免疫系統或其它生理功能的破壞性反應。實例包括但不限于任何標準藥物載體諸如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、水、乳劑諸如油/水乳劑和各種類型的潤濕劑。用于氣霧劑或腸胃外給藥的示例性稀釋劑是磷酸鹽緩沖鹽水或生理(0.9％)鹽水通過熟知的常規(guī)方法(參見例如Remington’sPharmaceuticalSciences，Chapter43,第十四版,MackPublishingCol,EastonPA18042,USA)配制包含此類載體的組合物。藥學上可接受的賦形劑已經在各種公布中充分描述，包括例如A.Gennaro(2000)“Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy,”第20版，Lippincott,Williams,&Wilkins；Remington’sPharmaceuticalSciences,第14版或最新版，MackPublishingCol,EastonPA18042,USA；PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems(1999)H.C.Ansel等，編輯，第7版,Lippincott,Williams,&Wilkins；和HandbookofPharmaceuticalExcipients(2000)A.H.Kibbe等，編輯，第三版Amer.PharmaceuticalAssoc。通過在水性或非水溶劑諸如植物油或其它類似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高級脂族酸或丙二醇的酯中且如果需要與常規(guī)添加劑諸如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑和防腐劑一起溶解、懸浮或乳化，可將主題官能化磁性納米顆粒配制成注射用制劑。成像方法主題官能化MNP可用于檢測和定量與β-淀粉樣沉積物和/或NFT有關的或者由其引起的疾病的活的哺乳動物如人、非人動物或非人動物模型的腦中的淀粉樣沉積物和/或NFT。向活的哺乳動物施用包含主題MNP官能化的藥物組合物。存在于腦中的任何β-淀粉樣沉積物(如聚集的β-淀粉樣諸如可與神經原纖維纏結相關)可使用磁共振成像(MRI)或任何其他適當的成像方法來可視化。因此，本公開提供檢測和定量活哺乳動物腦中的淀粉樣沉積物和/或NFT的方法。所述方法通常包括對哺乳動物施用診斷有效量的包含主題官能化MNP的藥物組合物；和b)經由MRI對腦組織成像。施用的官能化MNP被允許分布至腦組織中且可使用MRI對任何鍵合至聚集的β-淀粉樣肽和/或NFT的官能化MNP成像。與結合的正常對照水平相比，官能化MNP與腦組織結合的增強表明哺乳動物患有阿爾茨海默氏病或者有形成阿爾茨海默氏病的風險。主題官能化MNP提供受影響的組織(如具有β-淀粉樣沉積物的腦組織)T2、T2*、和T1時間的對比以使得組織對MRI可見。即將進行成像的感興趣區(qū)包括如海馬、皮層和中腦。主題官能化MNP可被用于對如用于研究目的阿爾茨海默氏病(AD)的非人動物模型的腦中的β-淀粉樣沉積物(如聚集的β-淀粉樣蛋白)和/或NFT成像。AD的適合的非人動物模型包括包含人淀粉樣前體蛋白(hAPP)突變體轉基因的轉基因小鼠；包含早老素1或早老素2轉基因的轉基因小鼠等。參見如等(2004)Mol.Psychiatry9：664；和Ittner(2008)NatureReviews9：532。例如可將用于治療AD的實驗藥物施用于AD非人動物模型；且主題官能化MNP可用于測定實驗藥物對非人動物模型的腦中β-淀粉樣沉積物和/或NFT的量的影響。當實施主題成像方法時，可通過各種施用途徑的任何一種施用主題官能化MNP于個體，包括腸胃外和腸道途徑。適合的施用途徑包括如靜脈內、口服、直腸、陰道、鼻、眼、鞘內、顱內、肌內等治療方法如上所述，在一些實施方案中，主題官能化MNP可包括除結合β-淀粉樣沉積物和/或NFT的官能部分(基團)外的治療劑。此類官能化MNP可用于對AD成像和/或AD的治療中。適合的治療劑包括用于治療AD的試劑，其中此類試劑包括但不限于乙酰膽堿酯酶抑制劑，包括不但限于安理申(多奈哌齊)、艾斯能(卡巴拉汀)、美曲膦酯和他克林(考克尼克斯)；非類固醇類的抗炎劑包括不但限于布洛芬和吲哚美辛；環(huán)氧化酶-2(Cox2)抑制劑諸如塞來昔布；和單胺氧化酶抑制劑諸如司來吉蘭(咪多吡或地普雷尼爾)。用于治療AD的另一種適合的另外的治療劑是減少apoE4結構域相互作用的“結構校正”的apoE4。減少apoE4結構域相互作用的試劑包括如在美國專利公布No.2006/0073104；和Ye等(2005)Proc.Natl.Acad.Sci.USA102：18700中所描述的試劑。用于治療AD的另一種適合的另外的治療劑是抑制tau聚集的試劑，如在美國專利No.7,605,179所描述的抑制tau聚集的萘醌衍生物。另一種適合的另外的治療劑是抑制tau磷酸化的試劑，如在美國專利No.7,572,793描述的抑制tau蛋白激酶1的3-取代-4-嘧啶酮衍生物。當實施主題治療方法時，可通過各種施用途徑的任何一種施用主題官能化MNP，包括腸胃外和腸道途徑。適合的施用途徑包括如靜脈內、口服、直腸、陰道、鼻、眼、鞘內、顱內、肌內等。實施例提出以下實施例以便向本領域的普通技術人員提供如何制備和使用本發(fā)明的完整公開和描述，而非意圖限制本發(fā)明人視為其發(fā)明的范圍，也非意圖表示以下實驗是進行的全部或僅有的實驗。已努力確保關于所用數字(如量、溫度等)的準確性，但是應考慮一些實驗誤差和偏差。除非另外指明，份數為重量份，分子量為重均分子量，溫度單位為攝氏度且壓力為大氣壓或接近大氣壓?？墒褂脴藴实目s寫，如bp，堿基對；kb，千堿基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分鐘；h或hr，小時，aa，氨基酸；kb，千堿基；bp，堿基對；nt，核苷酸；i.m.，肌肉內注射；i.p.，腹膜內；s.c.，皮下等。實施例1：制備官能化MNPHODDNP-綴合的MNP(“DNP-MNP”)對未治療(無AD)大鼠和AD模型大鼠施用HODDNP-綴合的MNP。數據顯示于圖1-6中。圖1A和1B。顯示未治療(非-AD)大鼠的MR(磁共振)圖像(T2，TR6000毫秒(ms)、TE10-120ms，12次回波)。圖1A顯示代表性切片的基線(對比前)MR圖像。圖1b顯示相同切片的對比后的MR圖像。在此首次用于實驗隨后用DNP-MNP(也被稱為“HODDNP-MNP”)注射的動物中，基線(圖1A)和對比后(圖1B)掃描的測定體積的感興趣區(qū)(ROI)(其中ROI包括海馬、皮層、中腦)的定量T2值的比較未示出顯著(p>0.05)的對比增強。表1顯示基線掃描中感興趣區(qū)(ROI)(其中ROI包括海馬、皮層、中腦)的定量的T2值(“基礎T2(ms)”)。表1顯示在靜脈內(i.v.；尾靜脈)注射HODDNP-MNP1.5小時后相同大鼠的相同感興趣區(qū)的定量T2值(“T2后”)。表1ROI基礎T2(ms)T2后海馬55.0±0.251.3±0.3皮層53.0±0.348.6±0.2中腦50.7±0.446.5±0.4圖2A和2B顯示為AD基因模型(淀粉樣-β(Aβ)斑塊的三基因模型)的1歲大鼠的MR圖像(T2、TR6000ms、TE10-120ms，12次回波)。圖2A顯示此大鼠中的代表性切片的基線(對比前)MR圖像。圖2B顯示用增強注射后的2.5小時時的相同切片的對比后的MR圖像?；€中(圖2A)和對比后(圖2B)掃描的測定體積的ROI(海馬、皮層和中腦)的定量T2值的比較在隨后用DNP-MNP注射的所有ROI中顯示出顯著的(P<0.05)對比增強。最顯著的對比增強是海馬，其次是皮層。表2顯示基線掃描中的ROI(海馬、皮層和中腦)的定量T2值(“基礎T2(ms)”)。表2顯示了靜脈注射(尾靜脈)HODDNP-MNP2.5小時后相同大鼠中相同ROI的定量T2值(“T2后”)。表2ROI基礎T2(ms)T2后海馬56.2±0.348.5±0.3皮層52.4±0.345.3±0.3中腦49.4±0.444.1±0.5圖3A和圖3B顯示為AD基因模型((Aβ)斑塊的三基因模型)的第二1歲大鼠的MR圖像(T2、TR6000ms、TE10-120ms，12次回波)。圖3A顯示此大鼠中的代表性切片的基線(對比前)MR圖像。圖3B顯示用對照注射后的2.5小時時的相同切片的對比后的MR圖像?；€中(圖3A)中和對照后(圖3B)掃描的測定體積的ROI(海馬、皮層和中腦)T2值的比較在隨后用DNP-MNP注射的所有ROI中顯示出顯著的(P<0.05)對比增強。最顯著的對比增強是海馬，其次是皮層。表3顯示基線掃描中的ROI(海馬、皮層和中腦)的定量T2值(“基礎T2(ms)”)。表3顯示了靜脈注射(尾靜脈)HODDNP-MNP2.5小時后相同大鼠中相同ROI的定量T2值(“T2后”)。表3ROI基礎T2(ms)T2后海馬65.8±0.451.8±0.4皮層61.0±0.448.8±0.3中腦61.0±0.546.5±0.5圖4A-C。AD的轉基因大鼠模型的代表性MRI切片在圖4A中顯示。相應的加框區(qū)域(海馬)顯示于圖4B的染色的組織切片中。插圖顯示在海馬中明顯的斑塊的存在。觀察到在所有的腦區(qū)域中更多的擴散斑塊(圖4C)的存在。這些結果確認在與AD有關的β-淀粉樣斑塊存在下，具有HODDNP-MNP的對比增強發(fā)生。圖5A-D。擴散斑塊的存在顯示于(圖5A)海馬中。在相鄰切片中Perl鐵染色顯示含有斑塊(圖5B-D)的區(qū)域中DNP-MNP的存在。圖6A和6B。轉基因大鼠腦切片的DAB-增強的Perl染色(經由尾靜脈的靜脈注射DNP-MNP后)顯示于圖6A中。DNP-MNP穿過BBB且存在于細胞內(箭頭)以及細胞外的腦組織中。未治療對照動物(無對照注射)的DAB增強的Perl染色(圖6B)顯示無鐵染色存在于圖6A顯示的相同的腦區(qū)域(內嗅皮質)中。經由HODDNP的羥基基團，可將HODDNP共價綴合至環(huán)氧-MNP。綴合方法的一個實施例示出于圖7。PIB-2-綴合的MNP經由PIB-2的氨基氮，可將PIB-2綴合至環(huán)氧-MNP。此類方法的實施例示出于圖8中。雖然已參照其特定的實施方案描述了本發(fā)明，但是本領域技術人員應當理解在不背離所發(fā)明的精神和范圍的情況下可以進行各種變化和等效物替代。此外可以進行許多修改以使得特定的情況、材料、材料的組合物、方法、方法步驟或步驟適應本發(fā)明的目的、精神和范圍。所有此類修改意圖在所附權利要求的范圍內。當前第1頁1 2 3