政府利益

本發(fā)明是在由國立衛(wèi)生研究院授予的資助號r01(ca133470)，1p30es013508-02，rc1ai081251和5-p30-ca-016520-34s2的政府支持下進(jìn)行。政府在本發(fā)明中享有一定的權(quán)利。

發(fā)明領(lǐng)域

本文提供了使用斷裂開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其立體異構(gòu)體、其代謝物及其類似物，用于輻射防護(hù)和輻射緩解以及用于化學(xué)預(yù)防，如避免致癌物誘導(dǎo)的肺癌和間皮瘤或避免次氯酸離子的組合物和方法。

發(fā)明背景

電離輻射在生物機(jī)體中產(chǎn)生大范圍的有害影響。人類因為職業(yè)危害暴露于輻射，在診斷和治療放射照相程序期間，當(dāng)使用電子設(shè)備時，來自核事故的背景輻射，在空中和太空旅行期間，以及來自長時間暴露于太陽(例如，日光浴者或戶外工人)。暴露于自然輻射可能以許多形式出現(xiàn)：自然資源如空氣、水和土壤在與自然發(fā)生的輻射放射物質(zhì)(放射性核素)接觸時可能受到污染；氡是一種這樣常見的自然輻射源。當(dāng)前的全球發(fā)展還將恐怖主義定為危險的手段，通過這些手段可能使大量的人暴露于致命量的輻射。因此，鑒別可以在暴露于輻射之前和期間(即，輻射防護(hù)劑)以及作為放射性暴露后的治療(即，輻射緩解劑)給予的試劑是非常重要的。

此外，在美國，肺癌是癌癥死亡率的主要原因。盡管存在新穎的靶向治療劑，改進(jìn)的分期和外科技術(shù)，以及增加針對局部晚期肺癌的伴隨化放療的利用，但是總體死亡率僅有最少降低(坦(tan)和斯皮瓦克(spivack)(2009)肺癌(lungcancer)65:129-137)。癌癥化學(xué)預(yù)防已被定義為使用具有特定天然或合成試劑的飲食和藥理學(xué)干預(yù)，這些天然或合成試劑被設(shè)計來預(yù)防，抑制或逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤發(fā)展之前的致癌作用過程(洪(hong)&斯伯恩(sporn)，(1997)，科學(xué)(science)278:1073-1077)。用于肺癌化學(xué)預(yù)防的一種策略集中于通過解毒ii期酶的上調(diào)來調(diào)節(jié)煙草、環(huán)境和其他致癌物的代謝和分布的試劑的使用。已知許多合成和天然發(fā)生的化合物誘導(dǎo)ii期酶的表達(dá)。已有許多報道支持nrf2/are調(diào)節(jié)的ii期酶誘導(dǎo)是降低對致癌物的易感性的高度有效策略的想法。我們有數(shù)據(jù)表明亞麻籽(fs)及其主要木脂素sdg，二者都來自天然材料的富集和合成衍生，是化學(xué)致癌物誘導(dǎo)的肺癌的小鼠模型中有效的肺癌化學(xué)預(yù)防試劑。

大約85％的肺癌是由吸煙引起的。煙草煙霧中的主要肺致癌物是多環(huán)芳烴，以苯并[a]芘(bap)為代表。在開發(fā)出更好的治療之前，減少死亡的最佳希望是通過篩查、戒煙或化學(xué)預(yù)防進(jìn)行預(yù)防。化學(xué)預(yù)防劑必須在大量暴露但相對健康的受試者中長時間給予。它們必須是安全、無毒、適口，并且理想地，是負(fù)擔(dān)得起的。已經(jīng)在肺癌中研究了許多化學(xué)預(yù)防劑，但沒有一種符合這些標(biāo)準(zhǔn)。最有希望的方法之一是上調(diào)ii期抗氧化劑和解毒酶。不幸的是，迄今為止在患者中測試的ii期酶激活劑，如奧替普拉或萊菔硫烷(sulforophane)，已經(jīng)證明是不可接受的毒性(彭迪亞拉(pendyala)等人，(2001)，癌癥流行病學(xué)、生物標(biāo)志物和預(yù)防(cancerepidemiolbiomarkersprev)10:269-272)。因此，迫切需要安全，無毒的化學(xué)預(yù)防劑，其有效地防止由煙草煙霧中的肺致癌物誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和dna損傷。

另一種眾所周知的環(huán)境致癌物是石棉，其是指商業(yè)上用于絕緣的一組天然發(fā)生的水合纖維狀硅酸鹽纖維?，F(xiàn)在已經(jīng)在兩種動物模型和患者中清楚地建立，石棉纖維吸入可導(dǎo)致腫瘤性疾病，如惡性間皮瘤(mm)和肺癌(卡蓬(carbone)&楊(yang)(2012)，臨床癌癥研究(clincancerres)18:598-604；內(nèi)里(neri)等人(2012)，抗癌研究(anticancerres)32:1005-1013)，以及肺纖維化。mm是由胸膜和腹膜的間皮細(xì)胞產(chǎn)生的高度侵襲性癌癥，中位存活期為約1年(斯特曼(sterman)等人，(2005)，臨床癌癥研究(clincancerres)11,7444-7453；斯特曼等人，(1999)，胸(chest)116,504-520；貝納德(benard)等人，(1999)，核醫(yī)學(xué)雜志(jnuclmed)40,1241-1245)。除了在非常早期的疾病中的手術(shù)，目前的治療不是有療效的(斯特曼&阿爾貝達(dá)(albelda)(2005)，呼吸病學(xué)(respirology)10,266-283)。目前，mm在美國每年導(dǎo)致約3,000例死亡，并且在西歐每年導(dǎo)致額外5,000例死亡。

雖然石棉的使用在許多西方國家受到限制，但在世界許多國家中仍然使用石棉，并且據(jù)估計2008年開采的石棉超過200萬噸(蘇爾維(survey)，b.g.(2010)，世界礦產(chǎn)(worldmineralproduction)2004-08.諾丁漢，英國，英國地質(zhì)調(diào)查所(britishgeologicalsurvey))。因此，第三世界(特別是印度)的mm病例可能會大幅增加，在那里使用石棉的人數(shù)增加了，而且很少采取預(yù)防措施。然而，即使在發(fā)達(dá)世界，重要的風(fēng)險仍然存在。這些包括許多類型的職業(yè)，這些職業(yè)使工人暴露于預(yù)先存在的石棉(即，水管工、管道工、從事絕緣工作的工人，絕緣層去除等)以及超級石棉危險廢物場所。還有環(huán)境和居家暴露。例如，在采礦或石棉工廠關(guān)閉的地區(qū)，mm的風(fēng)險增加。

石棉和癌癥之間的關(guān)系的一個主要問題是吸入的石棉纖維可以在肺中持續(xù)很長時間，導(dǎo)致連續(xù)損傷，即使患者從暴露中移除。由于這種長的潛伏期(通常長達(dá)30-50年)，過去暴露的個體在整個生命中仍然存在增加的mm和其他癌癥的風(fēng)險。

癌癥的化學(xué)預(yù)防目的在于預(yù)防、阻止或逆轉(zhuǎn)致癌作用的起始階段或腫瘤細(xì)胞進(jìn)展為癌癥。雖然這個定義聽起來很簡單，但是很難找到有效的化學(xué)預(yù)防劑。首先，致癌物誘導(dǎo)癌癥的機(jī)制通常涉及多種機(jī)制，使得功效具有挑戰(zhàn)性并且需要具有多種活性的試劑。其次，由于該試劑將用于預(yù)防大量健康的但處于危險的個體中的少量腫瘤，因此其必須是非常無毒，良好耐受且可負(fù)擔(dān)的。

因此，鑒別可以在暴露于致癌物或其他有害化學(xué)試劑(即，化學(xué)預(yù)防劑)(如，化學(xué)戰(zhàn)劑，氯和次氯酸離子和其他有害毒物)之前，期間和之后給予的試劑也是非常重要的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在一方面，本發(fā)明涉及用于在對其有需要的受試者中保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞、或組織免受輻射損傷的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的亞麻籽、其生物活性成分、降解物或其代謝物。向所述受試者給予涵蓋在暴露于損傷性輻射暴露之前，期間和之后的給予。時間之前，期間和之后可以是秒、分鐘、小時、天、周、月或甚至年。生物活性成分涵蓋開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其立體異構(gòu)體或其組合。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防已經(jīng)或?qū)⒁┞队谳椛涞氖茉囌咧械妮椛鋼p傷的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的至少一種生物活性成分，其中所述生物活性成分包括開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其立體異構(gòu)體或其組合。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于在對其有需要的受試者中保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞、或組織免受意外輻射暴露所導(dǎo)致的輻射損傷的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的亞麻籽、其生物活性成分、降解物或其代謝物。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞或組織免受導(dǎo)致衰老的輻射損傷的方法。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞或組織免受由暴露于天然和合成的化學(xué)致癌物質(zhì)和毒物產(chǎn)生的損害的方法。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于在對其有需要的受試者中保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞、或組織免受針對癌癥治療的放射療法所導(dǎo)致的輻射損傷的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的亞麻籽、其生物活性成分、降解物或其代謝物。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于在對其有需要的受試者中保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞、或組織免受輻射損傷的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的至少一種生物活性成分，其中所述生物活性成分包括開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其立體異構(gòu)體或其組合。在一些實施例中，輻射損傷由意外的輻射暴露引起。在一些實施例中，輻射損傷由用于癌癥(例如，肺癌)治療的放射療法引起。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于在對其有需要的受試者中預(yù)防對生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞、或組織的輻射誘導(dǎo)的損傷的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的亞麻籽、其生物活性成分、或其代謝物。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于在對其有需要的受試者中預(yù)防對生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞、或組織的輻射誘導(dǎo)的損傷的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的至少一種生物活性成分，其中所述生物活性成分包括開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其立體異構(gòu)體或其組合。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于在細(xì)胞中保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞、或組織免受輻射損傷的方法，該方法包括：將所述細(xì)胞與有效量的至少一種生物活性成分接觸，其中所述生物活性成分包括開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其立體異構(gòu)體或其組合。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于在對其有需要的受試者中保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞、或組織免受致癌物損傷的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的亞麻籽、其生物活性成分、降解物或其代謝物。向所述受試者給予涵蓋在暴露于天然和合成的化學(xué)致癌物和毒物的損傷性暴露之前，期間和之后的給予。時間之前，期間和之后可以是秒、分鐘、小時、天、周、月或甚至年。生物活性成分涵蓋開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其立體異構(gòu)體或其組合。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于在對其有需要的受試者中保護(hù)生物分子免受由于意外暴露于天然和合成的化學(xué)致癌物和毒物引起的致癌物損傷的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的亞麻籽、其生物活性成分、降解物或其代謝物。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞或組織免受來自天然和合成的導(dǎo)致肺癌或間皮瘤的化學(xué)致癌物和毒物的損害的方法。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞或組織免于致癌物損傷的方法，該方法包括：將所述生物分子、細(xì)胞或組織與有效量的生物活性成分接觸。與所述生物分子、細(xì)胞或組織接觸涵蓋在暴露于天然和合成化學(xué)致癌物和毒物的損傷性暴露之前，期間和之后的接觸。時間之前，期間和之后可以是秒、分鐘、小時、天、周、月或甚至年。生物活性成分涵蓋開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其立體異構(gòu)體或其組合。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于在已經(jīng)或?qū)⒁┞队谝环N或多種致癌物的受試者中治療或預(yù)防致癌物誘導(dǎo)的損傷，惡性轉(zhuǎn)化或癌癥發(fā)展避免致癌物誘導(dǎo)癌癥的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的至少一種生物活性成分，其中所述生物活性成分包括開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其立體異構(gòu)體或其組合。

在另一方面，本發(fā)明涉及保護(hù)暴露于一種或多種致癌物的受試者免受致癌物誘導(dǎo)的癌癥的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的亞麻籽、其生物活性成分或其代謝物。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于在對其有需要的受試者中保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞、或組織免由次氯酸根離子造成的損傷的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的亞麻籽、其生物活性成分、降解物或其代謝物。向所述受試者給予涵蓋在暴露于天然和合成的化學(xué)致癌物和毒物的損傷性暴露之前，期間和之后的給予。時間之前，期間和之后可以是秒、分鐘、小時、天、周、月或甚至年。生物活性成分涵蓋開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其立體異構(gòu)體或其組合。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防已經(jīng)或?qū)⒁┞队诖温人岣x子的受試者中的次氯酸根離子誘導(dǎo)的損傷的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的至少一種生物活性成分，其中所述生物活性成分包括開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其立體異構(gòu)體或其組合。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞或組織免于由次氯酸根離子造成的損傷的方法，該方法包括：將暴露于或?qū)⒈┞队诖温人岣x子的所述生物分子、細(xì)胞或組織與有效量的生物活性成分接觸。與所述生物分子、細(xì)胞或組織接觸涵蓋在暴露于天然和合成化學(xué)致癌物和毒物的損傷性暴露之前，期間和之后的接觸。時間之前，期間和之后可以是秒、分鐘、小時、天、周、月或甚至年。生物活性成分涵蓋開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其立體異構(gòu)體或其組合。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于前述方法之一的組合物。

除非另外定義，在此所使用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域之內(nèi)的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的意思。本發(fā)明的其他特征與優(yōu)點從以下詳細(xì)的說明實例以及圖中將會變得清楚。然而，應(yīng)當(dāng)理解，這種詳細(xì)說明和這些具體實例雖然指示了本發(fā)明的優(yōu)選的實施例，但它們僅僅是通過說明的方式給出的，因為從這種詳細(xì)說明在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的不同變化和修改對于本領(lǐng)域的那些普通技術(shù)人員而言將變得很清楚。還預(yù)期，在適當(dāng)時，本發(fā)明的任何實施例可以與本發(fā)明的一個或多個其他實施例組合，即使在本發(fā)明的不同方面下描述實施例。

附圖簡要說明

圖1：增加劑量的γ輻射對質(zhì)粒(pbr322)dna松弛的影響。超級螺旋(sc)代表緊湊形式。開放螺旋(oc)形式代表質(zhì)粒的松弛形式或損傷形式。(a)-超級螺旋(sc)形式是下突出帶(在3,000bp處)，而開放螺旋(oc)形式是上突出帶。泳道1-1kbdna標(biāo)準(zhǔn)梯，泳道2和3-未處理的質(zhì)粒dna，泳道4和5-暴露于10gy的質(zhì)粒dna，泳道6和7-暴露于25gy的質(zhì)粒dna，泳道8和9-暴露于50gy的質(zhì)粒dna。(b)-sc和oc形式表示為總質(zhì)粒dna的百分比。針對每種條件，所有樣品一式兩份運行。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。p<0.05被認(rèn)為是有意義的。*和**分別顯示與未處理的sc和oc形式相比的顯著差異。

圖2：增加濃度的合成sdg(s,s)、sdg(r,r)和商業(yè)sdg對γ輻射誘導(dǎo)質(zhì)粒(pbr322)dna松弛的影響。將所有樣品暴露于25戈瑞的γ射線劑量。sdg濃度為25、50、100和250μm。在圖(a)、(d)、和(g)中-顯示了在25、50、100和250μmsdg(s,s)、sdg(r,r)和sdg(商業(yè))存在下暴露于25gy后的質(zhì)粒dna的代表性瓊脂糖凝膠掃描。泳道1-1kbdna標(biāo)準(zhǔn)梯，泳道2和3-未處理的質(zhì)粒dna，泳道4和5-25μm，泳道6和7-50μm，泳道8和9-100μm，泳道10和11-250μmsdg。在圖(b)、(e)和(h)中sc和oc形式表示為總質(zhì)粒dna的百分比。針對每種條件，所有樣品一式兩份運行。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。p<0.05被認(rèn)為是有意義的。*和#分別顯示與未處理的sc和oc形式相比的顯著差異。**和##顯示與暴露于25gy不含sdg的樣品相比的顯著差異。在圖(c)、(f)和(i)中，顯示了質(zhì)粒dna松弛的sdg依賴性抑制。從曲線下呈現(xiàn)的二次方程式確定ec50值。

圖3：增加劑量的γ輻射對小牛胸腺dna片段化的影響。暴露于γ輻射的dna產(chǎn)生小分子量的片段，其移動比更高分子量dna更快。確定低分子量dna片段(<6,000bp)的密度，與高分子量dna(>6,000bp)相比，反映了輻射誘導(dǎo)損傷的程度。(a)泳道1-1kbdna標(biāo)準(zhǔn)梯，泳道2和3-未處理的小牛胸腺dna，泳道4和5-暴露于25gy的dna，泳道6和7-暴露于50gy的dna。(b)-高和低分子量dna形式表示為總dna的百分比。針對每種條件，所有樣品一式兩份運行。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。p<0.05被認(rèn)為是有意義的。*分別顯示與未處理形式相比的顯著差異。

圖4：增加濃度的合成sdg(s,s)、sdg(r,r)和商業(yè)sdg對γ輻射誘導(dǎo)的小牛胸腺dna片段化的影響。將所有樣品暴露于50戈瑞的γ射線劑量。sdg濃度為25、50、100和250μm。在圖(a)、(c)、和(e)中顯示了在25、50、100和250μmsdg(s,s)、sdg(r,r)和sdg(商業(yè))存在下暴露于50gy后的小牛胸腺dna的代表性瓊脂糖凝膠掃描。泳道1-1kbdna標(biāo)準(zhǔn)梯，泳道2和3-未處理的dna，泳道4和5-25μm，泳道6和7-50μm，泳道8和9-100μm，泳道10和11-250μmsdg。在圖(b)、(d)和(f)中高和低分子量dna形式表示為總dna的百分比。針對每種條件，所有樣品一式兩份運行。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。p<0.05被認(rèn)為是有意義的。*顯示與未處理的dna相比的顯著差異。#顯示與暴露于50gy不含sdg的樣品相比的顯著差異。

圖5：非常低濃度的合成sdg(s,s)，sdg(r,r)和商業(yè)sdg對γ輻射誘導(dǎo)的小牛胸腺dna片段化的影響。將所有樣品暴露于50gy的γ輻射劑量。sdg濃度為0.5、1.0、5.0和10μm。在圖(a)、(c)、和(e)中顯示了在0.5、1.0、5.0和10μmsdg(s,s)、sdg(r,r)和sdg(商業(yè))存在下暴露于50gy后的小牛胸腺dna的代表性瓊脂糖凝膠掃描。泳道1-1kbdna標(biāo)準(zhǔn)梯，泳道2和3-未處理的dna，泳道4和5-0.5μm，泳道6和7-1.0μm，泳道8和9-5.0μm，泳道10和11-10μmsdg。在圖(b)、(d)和(f)中高和低分子量dna形式表示為總dna的百分比。針對每種條件，所有樣品一式兩份運行。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。p<0.05被認(rèn)為是有意義的。*顯示與未處理的dna相比的顯著差異。#顯示與暴露于50gy不含sdg的樣品相比的顯著差異。

圖6：sdg、seco、ed和el對γ輻射誘導(dǎo)的小牛胸腺dna片段化的影響。將所有樣品暴露于50gy的γ輻射劑量。以10μm濃度使用sdg、seco、ed和el。(a)顯示在10μmsdg、seco、ed和el存在下暴露于50gy后的小牛胸腺dna的代表性瓊脂糖凝膠掃描。泳道1-1kbdna標(biāo)準(zhǔn)梯，泳道2和3-未處理的dna，泳道4、5和6-ir50gy，泳道7和8-sdg，泳道9和10-seco，泳道11和12-ed，泳道13和14-el。(b)高和低分子量dna形式表示為總dna的百分比。針對每種條件，所有樣品一式兩份運行。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。p<0.05被認(rèn)為是有意義的。*顯示與未處理的dna相比的顯著差異。#顯示與暴露于單獨的50gy的樣品相比的顯著差異。

圖7：sdg治療對小鼠原代肺細(xì)胞的輻射劑量應(yīng)答的影響。(a)上皮細(xì)胞；(b)內(nèi)皮細(xì)胞和(c)wt成纖維細(xì)胞。在γ輻射(0、2、4、6、8gy)之前用不同濃度的sdg處理細(xì)胞6小時并孵育。在第12-14天計數(shù)所有可見菌落，并將存活部分針對對照值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem。**p≤0.001*p≤0.01、#p≤0.05用于輻射的細(xì)胞與50μmsdg預(yù)處理的輻射細(xì)胞。

圖8：使用堿性彗星測定評估肺細(xì)胞中輻射誘導(dǎo)的dna單鏈斷裂(ssb)。(a)2-gyγ輻射的原代肺細(xì)胞(上皮，內(nèi)皮和wt成纖維細(xì)胞)中dna損傷的動力學(xué)評估；對每次處理計數(shù)至少100-150個細(xì)胞。通過計算每個細(xì)胞的“尾力矩”(尾部dna量乘以尾部長度的乘積)來評估dna損傷。*p≤0.001針對非輻射的對照物與其相應(yīng)的被輻射細(xì)胞；(b)sdg(50μm)處理(輻射前0、2、4、6小時)對輻射的原代肺細(xì)胞的影響。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem。*p≤0.001、#p≤0.01用于輻射的細(xì)胞與sdg預(yù)處理的輻射細(xì)胞。

插入物：原代肺上皮細(xì)胞的代表性熒光顯微照片。將細(xì)胞用sdg(50μm)預(yù)處理并暴露于g-輻射(2gy)，包埋在瓊脂糖中，裂解，并且進(jìn)行電泳(0.66v/cm，25min)，用sybr綠進(jìn)行染色并在熒光顯微鏡下進(jìn)行可視化并且此后檢查彗尾形成。(a)對照細(xì)胞，(b)sdg(50μm)，(c)暴露30分鐘后的ir(2gy)，(d)用sdg(50μm，6h)預(yù)處理并且輻射的細(xì)胞。

圖9：熒光評估γ-h2ax病灶在輻射的鼠原代肺細(xì)胞(即，上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和wt成纖維細(xì)胞)中的誘導(dǎo)。將細(xì)胞用sdg(50μm)處理6小時，并進(jìn)行γ-輻射(2gy)。以所需的時間間隔，將細(xì)胞在4％多聚甲醛中固定，洗滌，用γ-h2ax抗體探測，并使用dapi對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。對每個視野計數(shù)總細(xì)胞(藍(lán)色)γ-h2ax陽性細(xì)胞(綠色)，并計算γ-h2ax陽性細(xì)胞的百分比。對每次處理計數(shù)至少500個細(xì)胞，并進(jìn)行兩次實驗。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem。*p≤0.05，**p≤0.005針對輻射的細(xì)胞與sdg預(yù)處理的輻射細(xì)胞。

圖10：小鼠肺肺上皮細(xì)胞中γ-h2ax病灶(綠色)的免疫熒光可視化的代表性組。將細(xì)胞用sdg預(yù)處理6h，進(jìn)行γ-輻射(2gy)并再孵育30min。將細(xì)胞在4％多聚甲醛中固定，并用γ-h2ax抗體探測。用dapi(藍(lán)色)對dna進(jìn)行復(fù)染色。使用熒光顯微鏡獲取圖像。

圖11：在被輻射的鼠原代肺細(xì)胞中γ-h2ax病灶的誘導(dǎo)的流式細(xì)胞術(shù)(facs)確認(rèn)。將原發(fā)性肺細(xì)胞(即，上皮細(xì)胞(a)，內(nèi)皮細(xì)胞(b)和wt成纖維細(xì)胞(c))用sdg(50μm)處理6h并且進(jìn)行γ輻射(2gy)。以所需的時間間隔，處理細(xì)胞用于facs分析。使用summit軟件定量數(shù)據(jù)并表示為平均值±sem。*p≤0.05，**p≤0.01針對輻射的細(xì)胞與sdg預(yù)處理的輻射細(xì)胞。

圖12：原發(fā)性肺細(xì)胞中輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡死亡的評估。sdg(50mm)預(yù)處理(6h)對輻射的原發(fā)性肺細(xì)胞(即，上皮細(xì)胞(a)，內(nèi)皮細(xì)胞(b)和wt成纖維細(xì)胞(c))的影響的定量評估。將細(xì)胞固定，用dapi染色，并在熒光顯微鏡下觀察用于形態(tài)學(xué)分析。對于每次處理，從5個不同的視野計數(shù)至少500個細(xì)胞，并計算凋亡細(xì)胞的百分比。進(jìn)行兩次實驗。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem。*p≤0.05，**p≤0.005針對輻射的細(xì)胞與sdg預(yù)處理的輻射細(xì)胞。

圖13：評估sdg治療對肺上皮細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑的影響。在2gy暴露之前，用sdg(50μm)處理鼠原代肺細(xì)胞(上皮細(xì)胞)6小時。在輻射后6、24和48小時收獲細(xì)胞。以期望的時間間隔從上皮細(xì)胞分離總rna，并通過針對bax和bcl-2基因表達(dá)(a和b)的定量實時rt-pcr分析進(jìn)行評估。一式三份進(jìn)行分析，并將基因表達(dá)歸一化為18s核糖體rna。通過蛋白質(zhì)印跡分析評估bax和bcl-2蛋白水平；代表性圖像(c)和密度測定法分析，其中歸一化為β-肌動蛋白。(d和e)。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem。*p≤0.05，**p≤0.01針對與sdg處理的細(xì)胞或sdg+ir處理的細(xì)胞相比的ir暴露的細(xì)胞。

圖14：sdg對放射誘導(dǎo)的活性半胱氨酸蛋白酶-3和切割的parp水平的增加的作用。在2gy暴露之前，用sdg(50μm)處理鼠原代肺細(xì)胞(上皮細(xì)胞)6小時。在輻射后6、24和48小時收獲細(xì)胞。通過蛋白質(zhì)印跡分析評估切割的半胱氨酸蛋白酶-3和切割的parp蛋白水平。(a)代表圖像和(b和c)密度測定法分析，其中歸一化為β-肌動蛋白。一式兩份進(jìn)行分析，并且數(shù)據(jù)表示為平均值±sem。*p≤0.05，**p≤0.01針對與sdg處理的細(xì)胞相比的ir暴露的細(xì)胞。

圖15：sdg清除次氯酸離子。圖15a顯示apf和hpf熒光的clo^-依賴性增加。圖15b顯示了由sdg清除clo^-。圖15c顯示了合成的sdg非對映異構(gòu)體sdg(s,s)和sdg(r,r)的清除效果。所有樣品重復(fù)運行。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。p<0.05被認(rèn)為是有意義的。*顯示與未處理的對照相比的顯著差異。

圖16：sdg清除γ-輻射誘導(dǎo)的次氯酸鹽的生成。圖16a和b顯示γ-輻射誘導(dǎo)apf和hpf熒光的增加。圖16c和d顯示了在具有apf或hpf的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中增加劑量的輻射下sdg對次氯酸鹽的產(chǎn)生的影響(參見圖15圖注)。圖16e、f和g顯示γ-輻射誘導(dǎo)的?；撬岬穆然?。圖16e顯示了?；撬岬拇温人猁}依賴性氯化。圖16f顯示?；撬崧劝纷鳛樗袑嶒灄l件的吸光度。圖16g顯示了在如圖16f中所示的各種條件下的次氯酸鹽濃度。對于圖16a-e，所有樣品都重復(fù)運行，而對于圖16f和g，所有樣品一式四份運行。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。p<0.05被認(rèn)為是有意義的。*顯示與未處理的對照相比的顯著差異。

圖17：次氯酸鹽誘導(dǎo)的小牛胸腺dna損傷。圖17a和c顯示了暴露于hocl后小牛胸腺dna的代表性瓊脂糖凝膠掃描。圖17b和d顯示高和低分子量dna片段為總dna的百分比。圖17e和f顯示了sdg對質(zhì)粒dna的次氯酸鹽誘導(dǎo)的損傷的影響。圖17e顯示了暴露于hocl后質(zhì)粒dna的代表性瓊脂糖凝膠。圖17f顯示sc和oc形式為總質(zhì)粒dna的百分比。針對圖17a，泳道1-1kbdna標(biāo)準(zhǔn)梯，泳道2和3-未處理的dna，泳道4和5-0.1mm，泳道6和7-0.2mm，泳道8和9-0.4mm，泳道10和11-0.5mm以及泳道12和13-0.6mmclo-。針對圖17c，泳道1-1kbdna標(biāo)準(zhǔn)梯，泳道2和3-未處理的dna，泳道4和0.5mmhocl，泳道6和7-0.5mmhocl+sdg(com)1μm，泳道8和9-0.5mmhocl+sdg(s,s)1μm，泳道10-11-0.5mmhocl+sdg(r,r)1μm，泳道12-13-0.5mmhocl+槲皮素1μm，以及泳道14和15-0.5mmhocl+水飛薊賓1μm。對于圖17e，泳道1-1kbdna標(biāo)準(zhǔn)梯，泳道2和3-未處理的質(zhì)粒dna，泳道4和4.5mmhocl，泳道6和7-4.5mmhocl+sdg25μm。針對每種條件，所有樣品一式兩份運行。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。p<0.05被認(rèn)為是有意義的。*和#顯示與未處理的dna相比的顯著差異。

圖18：sdg(前處理和后處理)對2-氨基嘌呤(2-ap)的次氯酸鹽誘導(dǎo)的修飾的影響。圖18a顯示所有條件的代表性光譜。圖18b顯示在如圖18a中所示的不同條件下在374nm下的熒光。圖18c顯示了sdg的保護(hù)％。針對每種條件，所有樣品一式兩份運行。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。p<0.05被認(rèn)為是有意義的。*和#分別顯示與未處理的2-ap對照和處理的相比的顯著差異。

圖19：sdg防止2-氨基嘌呤(2-ap)的γ-輻射誘導(dǎo)的修飾。圖19a顯示所有條件的代表性光譜。圖19b顯示在374nm下的熒光。針對每種條件，所有樣品一式兩份運行。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。p<0.05被認(rèn)為是有意義的。*和#分別顯示與未處理的2-ap對照和處理的相比的顯著差異。

圖20：sdg作用在dna保護(hù)免于核堿基氯化中建議機(jī)制。

圖21：通過亞麻籽及其木脂素的化學(xué)預(yù)防機(jī)制。sdg通過抑制多步致癌作用過程減輕了由煙草和其他環(huán)境致癌物造成的肺部腫瘤發(fā)生。我們提供證據(jù)表明,在兩個動物模型中，木脂素sdg具有通過調(diào)節(jié)nrf2調(diào)節(jié)的階段ii解毒通路和可能其他機(jī)制的化學(xué)預(yù)防活性。我們進(jìn)一步提供數(shù)據(jù)支持sdg的保護(hù)作用由直接ros清除和/或間接抗氧化/抗炎性能以及降低致癌物毒性和dna損傷來介導(dǎo)。

圖22：sdg減少由苯并-α-芘在細(xì)胞中誘導(dǎo)的氧化性dna損傷。將sdg(10μm)添加至暴露于25μm煙草和環(huán)境致癌物苯并-α-芘(bap)的人上皮細(xì)胞(a549)中，并使用質(zhì)譜法檢測對dna的氧化損傷，如8-氧代-7,8-二氫鳥嘌呤(8-氧代-dguo)的存在指示的。sdg在致癌物暴露后3和6小時減少dna損傷。

圖23：在細(xì)胞中ros誘導(dǎo)的致癌物苯并-α-芘。鼠上皮細(xì)胞暴露于bap誘導(dǎo)破壞性活性氧簇(ros)，如通過氧化還原敏感性熒光染料檢測的。早在暴露于致癌物后2小時，熒光強度的強烈增加表明細(xì)胞中ros的產(chǎn)生。

圖24：sdg防止ros產(chǎn)生免受致癌物暴露。將小鼠上皮細(xì)胞暴露于10或20μmbap和增加濃度的sdg(0、0.1、0.5、1、5μmsdg)，并在2小時后檢測ros(如圖23中適當(dāng)確定的)。sdg清除有害ros至可忽略的水平。

圖25：sdg防止暴露于bap的人上皮細(xì)胞中的基因毒性應(yīng)激。將細(xì)胞暴露于強致癌物如bap，誘導(dǎo)基因毒性應(yīng)激，如通過增加的p53蛋白水平所指示的。這通過在5、10、25和50μm濃度下sdg的存在而減輕劑量依賴性。

圖26：sdg防止暴露于bap的人上皮細(xì)胞中的氧化性dna損傷。將細(xì)胞暴露于強致癌物如bap，誘導(dǎo)氧化性dna損傷，如通過增加的γ-h2ax(雙鏈dna斷裂的標(biāo)志物)的水平所指示的。這通過在5、10、25、50和100μm濃度下的存在而減輕劑量依賴性。

圖27：sdg防止暴露于bap的人上皮細(xì)胞中的dna加合物形成。將細(xì)胞暴露于強致癌物，如bap，誘導(dǎo)dna加合物的形成。dna加合物是與致癌物共價連接的dna片段，并與惡性腫瘤的發(fā)展直接相關(guān)。dna加合物水平通過單獨或組合給予sdg或其代謝物ed和el的存在而降低。

圖28：化學(xué)致癌物誘導(dǎo)的肺腫瘤的小鼠模型。給小鼠(a/j菌株)以1mg/kg劑量經(jīng)腹膜內(nèi)注射4次煙草和環(huán)境致癌物bap(每周一次)。小鼠在暴露時用亞麻籽或木脂素飲食開始。在暴露后在不同時間評估小鼠，以確定腫瘤負(fù)荷，小鼠重量和總體健康狀況。

圖29：亞麻籽降低小鼠中的腫瘤負(fù)荷：暴露于致癌物的鼠肺的總病理學(xué)狀況。bap暴露和飲食亞麻籽給予后若干個月，鼠肺的代表性臨床圖像。

圖30：亞麻籽降低小鼠中的腫瘤負(fù)荷：暴露于致癌物的鼠肺的組織病理學(xué)狀況。bap暴露和飲食亞麻籽給予后若干個月，鼠肺的代表性h&e應(yīng)變肺切片。來自喂食對照飲食(上圖)或亞麻籽(下圖)的小鼠的箭頭指示的結(jié)節(jié)在亞麻籽喂養(yǎng)的小鼠中顯示更小。每個小圖代表不同的動物。

圖31：亞麻籽降低小鼠中的腫瘤負(fù)荷：腫瘤負(fù)荷的定量評估。使用針對整體腫瘤面積(a)和結(jié)節(jié)大小(b)的圖像分析軟件進(jìn)行形態(tài)學(xué)評估組織學(xué)鼠肺切片。在喂養(yǎng)亞麻籽飲食的小鼠中，腫瘤占據(jù)的肺面積顯著減少(p<0.03)。類似地，存在更小腫瘤結(jié)節(jié)尺寸的趨勢。

圖32：亞麻籽降低小鼠中的腫瘤負(fù)荷：腫瘤負(fù)荷的定量評估。使用針對每個肺的腫瘤結(jié)節(jié)的總數(shù)(a)和侵入肺的腫瘤％(b)的圖像分析軟件進(jìn)行形態(tài)學(xué)評估組織學(xué)鼠肺切片。每個肺存在更少的腫瘤結(jié)節(jié)的趨勢(a)并且在亞麻籽補充劑下更少的腫瘤侵入的趨勢(b)

圖33：亞麻籽補充劑防止防止來自由bap誘導(dǎo)的肺癌的耗散效應(yīng)。在bap暴露后縱向測量動物重量200天。飼喂亞麻籽飲食的小鼠暴露于bap下，顯示比當(dāng)對照飲食時暴露于bap的小鼠顯示更高的重量。

圖34：實例5的實驗方案。

圖35：在每天攝取亞麻籽(fs)和亞麻籽木質(zhì)素組分(flc)補充劑的飲食后4天，在血液中可檢測到哺乳動物木脂素代謝物。具體地，可以使用液相色譜，串聯(lián)質(zhì)譜(lc/ms/ms)檢測腸二醇(ed)和腸內(nèi)酯(el)。飲食被設(shè)計為遞送可比較的木脂素水平，反映在2種飲食中可檢測的木脂素代謝物水平。

圖36：在石棉暴露之前給予的亞麻籽(fs)和亞麻籽木質(zhì)素組分(flc)，由經(jīng)腹膜內(nèi)青石棉石棉注射誘導(dǎo)的鈍性腹部炎癥，如通過巨噬細(xì)胞(mf)、嗜中性粒細(xì)胞(pmn)和淋巴細(xì)胞(ly)的數(shù)量所證實的。具體來說，fs和flc顯著減少腹部中的巨噬細(xì)胞流入。*p<0.05

圖37：小鼠在fs和flc飲食上開始并在24小時后暴露于石棉。根據(jù)圖34中的實驗方案，暴露后3天，使用elisa確定血漿(b，d)和腹部(a，c)中的細(xì)胞因子水平(tnfα和il-1β)。這兩種飲食表明防止腹部中的促炎細(xì)胞因子的分泌和由石棉暴露誘導(dǎo)的全身循環(huán)的趨勢。

圖38：在飲食(a)的情況下，炎性細(xì)胞也趨于更低，同時由400和800mg青石棉石棉誘導(dǎo)的tnfα(b)和il-1β(c)細(xì)胞因子水平由石棉暴露后1天飲食中添加的flc顯著鈍化(*p<0.05)。*p表示與暴露于石棉的對照飲食相比的顯著性。

圖39：在小鼠中口服灌胃可變sdg濃聚物后sdg和代謝物的血漿濃度。

圖40：在小鼠中口服灌胃可變劑量的sdg后肺中的抗氧化劑酶基因表達(dá)水平。

圖41：在小鼠口服灌胃100mg/kgsdg后，血漿(a)和肺組織(b)中sdg水平的動力學(xué)，和aoe基因表達(dá)的相應(yīng)水平的(c)。

圖42a-b：實例7的實驗方案。

圖43：實例7的臨床研究設(shè)計。

圖44：蛋白質(zhì)印跡顯示，喂食10％fs增加小鼠鼻上皮中的ho-1和nqo-1。

圖45：40gfs飲食后人頰上皮細(xì)胞中ho-1基因表達(dá)的動力學(xué)。(*p<0.05，從0天)。

圖46：在一個fs的患者中尿液isop水平的動力學(xué)。

圖47：fs的正常和肺移植患者中尿8-氧代-dguo水平的動力學(xué)。

圖48：假設(shè)sdg或亞麻籽飲食減少石棉誘導(dǎo)的ros/炎癥。

圖49：細(xì)胞的石棉暴露以檢測炎性細(xì)胞因子分泌和亞硝化/氧化應(yīng)激的實驗計劃(示意圖)：

圖50：sdg在體外通過人類間皮細(xì)胞鈍化石棉誘導(dǎo)的ros分泌。

圖51：培養(yǎng)物raw巨噬細(xì)胞中石棉誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激(ros釋放)的評估：石棉誘導(dǎo)的ros在石棉暴露后不久產(chǎn)生，并且在觀察期間持續(xù)。

圖52：在暴露于石棉后幾小時向巨噬細(xì)胞給予sdg降低氧化應(yīng)激。

圖53：在暴露于石棉后幾小時向巨噬細(xì)胞給予sdg降低亞硝化應(yīng)激。

圖54：在暴露于石棉后幾小時向巨噬細(xì)胞給予sdg減少炎癥細(xì)胞因子分泌(il-1β)。

圖55：在暴露于石棉后幾小時向巨噬細(xì)胞給予sdg減少炎癥細(xì)胞因子分泌(tnf-α)。

圖56：使用兩種小鼠模型在石棉誘導(dǎo)的間皮瘤中測試sdg：使用在石棉暴露后遺傳傾向形成間皮瘤的小鼠的至少2個模型，我們將：評估亞麻籽和sdg對小鼠中單劑量石棉的急性效應(yīng)；測試亞麻籽和sdg是否抑制腫瘤在加速，石棉誘導(dǎo)mm的遺傳模型中的發(fā)展。

圖57：向暴露于石棉的mextag小鼠給予富含sdg(35％sdg)的flc飲食減少炎癥。

圖58：nf2小鼠的石棉暴露實驗計劃和亞麻籽/sdg木脂素配制品評估：

圖59：在石棉暴露后nf2小鼠中腹部炎癥的動力學(xué)：炎癥細(xì)胞流入3天達(dá)到峰值并在石棉暴露后9天逐漸減少。因此，選擇3天作為在所有后續(xù)實驗中評估炎癥的時間點。

圖60：亞麻籽及其富含sdg的木脂素組分鈍化的石棉誘導(dǎo)的炎癥(年輕小鼠)：在飲食中添加fs或flc時，總白細(xì)胞(a)減少，雖然不顯著。然而，當(dāng)觀察細(xì)胞差異，并且特別是巨噬細(xì)胞水平時，水平顯著通過亞麻籽和sdg-木脂素飲食(b)減弱。

圖61：亞麻籽及其富含sdg的木脂素組分鈍化的石棉誘導(dǎo)的炎癥(老齡小鼠)：與僅300,000細(xì)胞/ml(高出10倍)相比，通過呈現(xiàn)約3,000,000wbc/ml的腹部灌洗液，暴露于腹部石棉的老齡小鼠(a)對石棉更敏感。結(jié)果表明，炎癥細(xì)胞嗜中性粒細(xì)胞(b)和巨噬細(xì)胞(c)在老齡小鼠中二者都顯著高于年輕小鼠。

圖62：富含sdg(在飲食配制品中給出)的亞麻籽木脂素提取物使老年小鼠中的石棉炎癥鈍化：在第0天向雄性nf2(129sv)(+/-)小鼠注射(腹膜內(nèi))400μg石棉。小鼠在石棉暴露前一周(第-7天)在測試飲食(0％fs或10％flc)上開始，并在石棉暴露后第3天處死。用5ml1×pbs進(jìn)行腹部灌洗(al)(將1ml腹部灌洗液離心，并且冷凍上清液)。在-80°下冷凍收集血漿。在灌洗液中評估細(xì)胞，并且顯示通過富含sdg的飲食，總wbc和嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞都顯著減少。

圖63：富含sdg(在飲食配制品中給出)的亞麻籽木脂素提取物使老年小鼠中的石棉炎性細(xì)胞因子分泌和亞硝化應(yīng)激鈍化：在第0天向雄性nf2(129sv)(+/-)小鼠注射(腹膜內(nèi))400μg石棉。小鼠在石棉暴露前一周(第7天)在測試飲食(0％fs或10％flc)上開始，并在石棉暴露后第3天處死。用5ml1×pbs進(jìn)行腹部灌洗(al)(將1ml腹部灌洗液離心，并且冷凍上清液)。在-80°下冷凍收集血漿。細(xì)胞因子il1β和tnfα以及亞硝酸鹽的水平被富含sdg的飲食顯著鈍化。

發(fā)明詳細(xì)說明

在以下詳細(xì)說明中，陳述了眾多具體細(xì)節(jié)，以便提供對本發(fā)明的徹底理解。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解的是，可以在沒有這些具體細(xì)節(jié)的情況下實施本發(fā)明。在其他情況下，沒有詳細(xì)說明的熟知方法、程序和組分，以便不使本發(fā)明難于理解。

本文提供了使用亞麻籽、其生物活性成分或其代謝物用于輻射防護(hù)和化學(xué)預(yù)防的治療和預(yù)防方法。在示例性實施例中，生物活性成分包括開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其異構(gòu)體(包括立體異構(gòu)體)或其組合。

本申請的發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)亞麻籽、其生物活性成分和/或其降解物或代謝物有效地保護(hù)生物分子、細(xì)胞和組織免受輻射損傷、次氯酸離子誘導(dǎo)的損傷、致癌物誘導(dǎo)的損傷和惡性腫瘤。因此，諸位本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)亞麻籽、其生物活性成分、或其代謝物可用于保護(hù)生物分子、細(xì)胞和組織免受輻射損傷，次氯酸離子誘導(dǎo)的損傷、致癌物損傷和癌癥發(fā)展。

根據(jù)本文提供的方法需要輻射防護(hù)或放射減輕的受試者是將要或已經(jīng)暴露于潛在有害量的輻射的受試者。應(yīng)當(dāng)理解，這種暴露可以是單次暴露、周期性暴露、零星暴露或持續(xù)暴露于輻射。還應(yīng)當(dāng)理解，這種輻射暴露包括意外暴露、偶然或有意暴露。

根據(jù)本發(fā)明的方法可能需要輻射防護(hù)或放射減輕的受試者的實例包括但不限于：暴露于作為治療方案的一部分的輻射的患者(例如，需要放射療法的癌癥患者)，暴露于輻射以診斷疾病或病癥的受試者(例如，接受牙齒的或骨的x射線的受試者，接受pet掃描、ct掃描等的患者)。根據(jù)本發(fā)明的方法可能需要輻射防護(hù)或輻射減輕的受試者的實例還包括：那些由于其職業(yè)或生活方式選擇暴露于輻射的那些(例如，飛機(jī)機(jī)組或其他頻繁的航空旅行者，以及甚至空間旅行者，他們暴露于高于平均輻射水平；實驗室技術(shù)人員和其他工人；或通過使用電子設(shè)備所暴露的那些)或者暴露于氡的累積(例如，在住處或礦場中的累積)的那些或暴露于來自太陽的自然輻射的戶外工人或日光浴者。根據(jù)本發(fā)明的方法可能需要的輻射防護(hù)的其他受試者包括意外暴露于輻射的那些受試者，如泄漏或溢出(例如，核反應(yīng)堆泄漏或事故或?qū)嶒炇乙绯?。還考慮到由于戰(zhàn)爭或恐怖主義導(dǎo)致核彈頭爆炸而暴露于輻射的那些。涵蓋的其他受試者是暴露于分散放射性物質(zhì)的常規(guī)爆炸物的恐怖分子的爆炸的那些。

根據(jù)本文提供的方法需要化學(xué)預(yù)防的受試者是將會，或已經(jīng)暴露于潛在有害量的致癌物或其他毒物的受試者。應(yīng)當(dāng)理解，這種暴露可以是單次暴露、周期性暴露，零星暴露或持續(xù)暴露于若干種合成或天然發(fā)生的致癌物或其他毒物(如，化學(xué)戰(zhàn)劑)中的一種或組合。還應(yīng)當(dāng)理解，這種暴露包括意外暴露、偶然或有意暴露。還應(yīng)當(dāng)理解，這種暴露可以是直接暴露或間接暴露。例如，間接暴露于次氯酸離子可以是直接暴露于電離輻射的結(jié)果。

根據(jù)本發(fā)明的方法可能需要化學(xué)預(yù)防的受試者的實例包括但不限于：由于其職業(yè)或生活方式選擇而可能暴露于致癌物或其他毒物的那些(例如，石油工業(yè)的工人；暴露于機(jī)動車廢氣顆粒的收費站值班人員；實驗室技術(shù)人員和其他工人)。根據(jù)本發(fā)明的方法可能需要化學(xué)預(yù)防的其他受試者包括意外暴露于致癌物的那些，如飲用水或空氣中的致癌物(石棉，多環(huán)芳烴)的泄漏或溢出。還預(yù)期由于習(xí)慣(吸煙者)而暴露于致癌物的那些。涵蓋的其他受試者是暴露于恐怖分子的分散致癌物和其他癌癥促進(jìn)材料(如化學(xué)戰(zhàn)劑)行為的那些。

在一方面，本發(fā)明涉及用于在對其有需要的受試者中保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞、或組織免受輻射損傷的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的亞麻籽、其生物活性成分、降解物或其代謝物。向所述受試者給予涵蓋在暴露于損傷性輻射暴露之前，期間和之后的給予。時間之前，期間和之后可以是秒、分鐘、小時、天、周、月或甚至年。生物活性成分涵蓋開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其立體異構(gòu)體或其組合。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防已經(jīng)或?qū)⒁┞队谳椛涞氖茉囌咧械妮椛鋼p傷的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的至少一種生物活性成分，其中所述生物活性成分包括開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其立體異構(gòu)體或其組合。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于在對其有需要的受試者中保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞、或組織免受意外輻射暴露所導(dǎo)致的輻射損傷的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的亞麻籽、其生物活性成分、降解物或其代謝物。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞或組織免受導(dǎo)致衰老的輻射損傷的方法。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞或組織免受由暴露于天然和合成的化學(xué)致癌物質(zhì)和毒物(包括化學(xué)戰(zhàn)劑)產(chǎn)生的損害的方法。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于在對其有需要的受試者中保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞、或組織免受針對癌癥治療的放射療法所導(dǎo)致的輻射損傷的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的亞麻籽、其生物活性成分、降解物或其代謝物。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于在對其有需要的受試者中保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞、或組織免受輻射損傷的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的至少一種生物活性成分，其中所述生物活性成分包括開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其立體異構(gòu)體或其組合。在一些實施例中，輻射損傷由意外的輻射暴露引起。在一些實施例中，輻射損傷由用于癌癥(例如，肺癌)治療的放射療法引起。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于在對其有需要的受試者中預(yù)防對生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞、或組織的輻射誘導(dǎo)的損傷的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的亞麻籽、其生物活性成分、或其代謝物。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于在對其有需要的受試者中預(yù)防對生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞、或組織的輻射誘導(dǎo)的損傷的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的至少一種生物活性成分，其中所述生物活性成分包括開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其立體異構(gòu)體或其組合。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于在細(xì)胞中保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞、或組織免受輻射損傷的方法，該方法包括：將所述細(xì)胞與有效量的至少一種生物活性成分接觸，其中所述生物活性成分包括開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其立體異構(gòu)體或其組合。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于在對其有需要的受試者中保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞、或組織免受致癌物損傷的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的亞麻籽、其生物活性成分、降解物或其代謝物。向所述受試者給予涵蓋在暴露于天然和合成的化學(xué)致癌物和毒物的損傷性暴露之前，期間和之后的給予。時間之前，期間和之后可以是秒、分鐘、小時、天、周、月或甚至年。生物活性成分涵蓋開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其立體異構(gòu)體或其組合。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于在對其有需要的受試者中保護(hù)生物分子免受由于意外暴露于天然和合成的化學(xué)致癌物和毒物引起的致癌物損傷的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的亞麻籽、其生物活性成分、降解物或其代謝物。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞或組織免受來自天然和合成的導(dǎo)致肺癌或間皮瘤的化學(xué)致癌物和毒物的損害的方法。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞或組織免于致癌物損傷的方法，該方法包括：將所述生物分子、細(xì)胞或組織與有效量的生物活性成分接觸。與所述生物分子、細(xì)胞或組織接觸涵蓋在暴露于天然和合成化學(xué)致癌物和毒物的損傷性暴露之前，期間和之后的接觸。時間之前，期間和之后可以是秒、分鐘、小時、天、周、月或甚至年。生物活性成分涵蓋開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其立體異構(gòu)體或其組合。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于在已經(jīng)或?qū)⒁┞队谝环N或多種致癌物的受試者中治療或預(yù)防致癌物誘導(dǎo)的損傷，惡性轉(zhuǎn)化或癌癥發(fā)展避免致癌物誘導(dǎo)癌癥的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的至少一種生物活性成分，其中所述生物活性成分包括開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其立體異構(gòu)體或其組合。

在另一方面，本發(fā)明涉及保護(hù)暴露于一種或多種致癌物的受試者免受致癌物誘導(dǎo)的癌癥的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的亞麻籽、其生物活性成分或其代謝物。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于在對其有需要的受試者中保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞、或組織免由次氯酸根離子造成的損傷的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的亞麻籽、其生物活性成分、降解物或其代謝物。向所述受試者給予涵蓋在暴露于天然和合成的化學(xué)致癌物和毒物的損傷性暴露之前，期間和之后的給予。時間之前，期間和之后可以是秒、分鐘、小時、天、周、月或甚至年。生物活性成分涵蓋開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其立體異構(gòu)體或其組合。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防已經(jīng)或?qū)⒁┞队诖温人岣x子的受試者中的次氯酸根離子誘導(dǎo)的損傷的方法，該方法包括：向所述受試者給予有效量的至少一種生物活性成分，其中所述生物活性成分包括開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其立體異構(gòu)體或其組合。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于保護(hù)生物分子(如，遺傳物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)或脂質(zhì))、細(xì)胞或組織免于由次氯酸根離子造成的損傷的方法，該方法包括：將暴露于或?qū)⒈┞队诖温人岣x子的所述生物分子、細(xì)胞或組織與有效量的生物活性成分接觸。與所述生物分子、細(xì)胞或組織接觸涵蓋在暴露于天然和合成化學(xué)致癌物和毒物的損傷性暴露之前，期間和之后的接觸。時間之前，期間和之后可以是秒、分鐘、小時、天、周、月或甚至年。生物活性成分涵蓋開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、腸內(nèi)酯(el)、其類似物、其立體異構(gòu)體或其組合。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于前述方法之一的組合物。

亞麻籽、其生物活性成分及其代謝物是本領(lǐng)域已知的，并描述于美國專利公開號2010/0239696；2011/0300247；和2014/0308379；和在國際專利公開號wo2014/200964中，其各自通過引用以其整體并入本文。

在亞麻籽中發(fā)現(xiàn)的主要木脂素是2,3-雙(3-甲氧基-4-羥基芐基)丁烷-1,4-二醇(開環(huán)異落葉松脂素或seco)，其作為共軛物開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)以其天然狀態(tài)存儲在植物中。sdg在人腸中代謝為腸二醇(ed)和腸內(nèi)酯(el)。腸醇和腸內(nèi)酯的合成類似物是已知的(參見，例如，埃克隆(eklund)等人，有機(jī)通訊(org.lett.)，2003,5:491)。

“降解物”是分子(如，sdg)分解成更小分子的產(chǎn)物。

“代謝物”是通過代謝或通過代謝過程產(chǎn)生的物質(zhì)。例如，sdg的代謝物是el或ed。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，代謝物可以是天然代謝物的化學(xué)合成的等價物。

“類似物”是其結(jié)構(gòu)與另一種化合物的結(jié)構(gòu)相關(guān)的化合物。類似物可以是合成類似物。

“成分”或“組分”是混合物或化合物中的元素或組分。

“產(chǎn)物”是由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)。

“提取物”是包含材料(例如，來自亞麻籽)的活性成分或濃縮精華的制品。

“藥物組合物”是指有效量的活性成分，例如，(s,s)-sdg(r,r)-sdg、內(nèi)消旋-sdg、sdg、seco、el、ed及其類似物，與可接受的載體或稀釋劑一起。“治療有效量”是指對給定條件和給予方案提供治療效果的量。

本文所述的組合物可以包括“治療有效量”?！爸委熡行Я俊笔侵冈诒匦璧膭┝亢蜁r間段內(nèi)有效達(dá)到所希望治療結(jié)果的量。治療有效量可以根據(jù)因素(如個體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和重量)以及組合物在個體中引起所希望應(yīng)答的能力等因素而變化。治療有效量也是治療有益效果超過分子的毒性或有害作用的量。

如在此所用，短語“藥學(xué)上可接受”是指在合理醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)適用于與人類和動物的組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏應(yīng)答或其他問題或并發(fā)癥，與合理益處/風(fēng)險比相稱的那些化合物、材料、組合物、載體和/或劑型。

“藥學(xué)上可接受的賦形劑”意指在制備藥物組合物中有用的一種賦形劑，該組合物通常是安全、無毒的并且不是生物學(xué)上或其他方面不希望的，并且包括對于獸用連同人類藥用是可接受的一種賦形劑。如本文所用的“藥學(xué)上可接受的賦形劑”包括一種和多于一種這樣的賦形劑。

藥物組合物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適的方法，如口服、經(jīng)腸胃外、經(jīng)粘膜、經(jīng)皮、經(jīng)肌內(nèi)、經(jīng)靜脈內(nèi)、經(jīng)皮內(nèi)、經(jīng)皮下、經(jīng)膜內(nèi)、經(jīng)顱內(nèi)、經(jīng)陰道內(nèi)、經(jīng)腫瘤內(nèi)或經(jīng)頰向受試者給予。也可以通過將活性成分包埋在合適的聚合物中來使用控釋，然后可以將其經(jīng)皮下、經(jīng)腫瘤內(nèi)、經(jīng)頰、作為貼劑在皮膚上、或經(jīng)陰道內(nèi)插入。該包括用活性成分涂覆醫(yī)療裝置。

在一些實施例中，藥物組合物經(jīng)口服給予，并因此配制成適于口服給予的形式，即作為固體或液體配制品。合適的固體口服配制品包括片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、小丸劑等。合適的液體口服配制品包括溶液，懸浮液，分散液，乳液，油等。在一些實施例中，將活性成分配制到膠囊劑中。根據(jù)該實施例，除了活性化合物和惰性載體或稀釋劑外，除了其他賦形劑以及明膠膠囊外，本發(fā)明的組合物包括干燥劑。

在一些實施例中，通過經(jīng)靜脈內(nèi)，經(jīng)動脈內(nèi)或經(jīng)肌內(nèi)注射液體配制品來給予藥物組合物。在一些實施例中，藥物組合物是配制用于口服給予的液體制品。在一些實施例中，藥物組合物是配制用于陰道內(nèi)給予的液體制品。合適的液體配制品包括溶液，懸浮液，分散液，乳液，油等。在一些實施例中，藥物組合物經(jīng)靜脈內(nèi)給予，并因此配制成適于靜脈內(nèi)給予的形式。在另一個實施例中，該藥物組合物經(jīng)動脈內(nèi)給予，并因此被配制為適于動脈內(nèi)給予的形式。在一些實施例中，藥物組合物經(jīng)肌內(nèi)給予并因此配制成適于肌內(nèi)給予的形式。在一些實施例中，藥物組合物經(jīng)頰內(nèi)給予并因此配制成適于經(jīng)頰給予的形式。

在一些實施例中，藥物組合物局部給予于體表，并且因此配制成適合局部給予的形式。合適的局部配制品包括凝膠、軟膏、乳膏、洗劑、滴劑、控釋聚合物等。對于局部給予，制備亞麻籽、其生物活性成分或其代謝物，并將其作為溶液，懸浮液或乳液在具有或不具有藥物載體的生理學(xué)上可接受的稀釋劑中施用。

在一些實施例中，本文提供的藥物組合物是控釋組合物，即亞麻籽、其生物活性成分或其代謝物在給予后一段時間內(nèi)釋放的組合物。控釋或緩釋組合物包括在親脂性儲庫(例如，脂肪酸、蠟、油)中的配制品。在其他實施例中，組合物是立即釋放組合物，即所有亞麻籽、其生物活性成分或其代謝物在給予后立即釋放的組合物。

在一些實施例中，用于本文提供的方法的組合物以治療劑量每天一次進(jìn)行給予。在一些實施例中，組合物每兩天一次，每周兩次，每周一次，或每兩周一次進(jìn)行給予。

用于提取和純化sdg的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并且描述于美國專利5,705,618中，其通過引用并入本文。用于合成sdg、其立體異構(gòu)體和類似物的技術(shù)描述于米什拉(mishra)op等人，生物有機(jī)化學(xué)與醫(yī)藥化學(xué)通訊(bioorganic&medicinalchemistryletters)2013，(19):5325-5328和國際專利公開號wo2014/200964中，其內(nèi)容以其整體通過引用在此結(jié)合。如本領(lǐng)域已知的，用于本文提供的方法中的生物活性組分還可以直接化學(xué)合成為哺乳動物的易于代謝的形式，腸二醇(ed)或腸內(nèi)酯(el)。

(s,s)-sdg(r,r)-sdg、(s,r)-sdg(r,s)-sdg、內(nèi)消旋-sdg、seco、el、ed或其類似物可以0.1ng/kg至500mg/kg的劑量給予。

用(s,s)-sdg(r,r)-sdg、(s,r)-sdg(r,s)-sdg、內(nèi)消旋-sdg、sdg、seco、el、ed或其類似物的治療是單次給予至若干天、若干個月、若干年或無限期。

如本文所用，“治療”可以指治療性治療或防預(yù)性或預(yù)防性措施，其中目的是預(yù)防或減輕本文所述的靶向病理病癥或障礙，或兩者。因此，用于本文提供的方法的組合物可以在暴露于，例如，輻射、致癌物、毒物或次氯酸離子之前給予于受試者。在一些情況下，用于本文提供的方法的組合物可以在暴露后給予給受試者。因此，治療本文所述的病癥可以指預(yù)防，抑制或遏制受試者的病癥。

此外，如本文所使用的，術(shù)語“治療(treat或treatment)”是指治療性治療以及防預(yù)性或預(yù)防性措施，其中目的是預(yù)防或減緩(減輕)與疾病或病癥相關(guān)的不期望的生理變化。有益的或期望的臨床結(jié)果包括但不限于：癥狀的緩解，疾病或病癥的程度的減輕，疾病或病癥的穩(wěn)定(即，疾病或病癥不惡化的情況)，延遲或減緩疾病或病癥的進(jìn)展，疾病或病癥的改善或緩解，以及疾病或病癥的緩解(無論部分或全部)，無論是可檢測的還是不可檢測的?！爸委煛边€可以指相較于未接受治療時的預(yù)期存活期，延長存活期。需要治療的那些包括已經(jīng)暴露于，例如，輻射、致癌物、毒物或次氯酸離子的那些，以及傾向于暴露的那些或預(yù)期暴露的那些。

在一些實施例中，需要治療的受試者和本文所述的方法和組合物可包括但不限于：患有肺部疾病和障礙(如哮喘、癌癥、copd和間皮瘤)的受試者。在一些實施例中，合適的受試者可以包括患有與衰老相關(guān)的疾病和病癥的受試者，如心血管障礙和病癥，皮膚下垂和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)疾病(例如，阿爾茨海默爾癡呆)。在一些實施例中，合適的受試者可以包括皮膚障礙和病癥(例如，牛皮癬)，以及患有化妝品皮膚病癥(例如，皺紋和老年斑)的受試者。在一些實施例中，合適的受試者可以包括患有胃腸道障礙和病癥(如ibd和慢性病)的受試者。在一些實施例中，合適的受試者可以包括患有心血管障礙和病癥的受試者。在一些實施例中，合適的受試者可以包括患有黑色素瘤的受試者。在一些實施例中，合適的受試者可以包括患有眼部疾病(如黃斑變性)的受試者。在一些實施例中，合適的受試者可以包括患有癌癥(如乳腺癌、前列腺癌和子宮癌)的受試者。在一些實施例中，合適的受試者包括患有認(rèn)知缺損和其他認(rèn)知障礙的受試者。

術(shù)語“受試者”包括哺乳動物，例如，人、伴侶動物(例如，狗、貓、鳥等)、農(nóng)場動物(例如，牛、綿羊、豬、馬、家禽等)、以及實驗室動物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠、鳥等)。除了人以外，受試者可以包括狗、貓、豬、牛、綿羊、山羊、馬、水牛、鴕鳥、豚鼠、大鼠、小鼠、鳥類(例如，長尾小鸚鵡)和其他野生，馴養(yǎng)或商業(yè)上有用的動物(例如，雞，鵝，火雞，魚)。術(shù)語“受試者”不排除在所有方面都是正常的個體。術(shù)語“受試者”包括但不限于需要療法或易感于病癥或其后遺癥的人。

術(shù)語“約”或“大約”意指由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定的特定值的可接受誤差范圍內(nèi)，其將部分地取決于如何測量或確定該值，即，測量系統(tǒng)的局限性。

提出以下實例，以便更充分地說明本發(fā)明的優(yōu)選實施例。然而，它們絕不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的廣泛范圍。

實例

實例1

合成的(s,s)和(r,r)-開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)保護(hù)裸質(zhì)粒和基因組dna免受γ輻射損傷

作為原子核蛻變的結(jié)果，產(chǎn)生三種類型的輻射，即具有正電荷的阿爾法(α)，具有負(fù)電荷的貝它(β)和不帶電荷的伽馬(γ)。在γ-輻射的情況下，電磁波具有非常小的波長(<0.005nm)，并且因此具有能夠電離分子和原子的高能量。在生物系統(tǒng)或溶液中，電離輻射通過水輻射分解產(chǎn)生羥基自由基(^.oh)。這些羥基自由基(^.oh)是電離輻射誘導(dǎo)的對細(xì)胞組分(包括脂質(zhì)，蛋白質(zhì)和基因組dna)的損傷的主要來源。由γ輻射產(chǎn)生的羥基自由基(^.oh)在dna中導(dǎo)致單鏈和雙鏈斷裂。(^.oh)自由基通過從脫氧核糖和嘌呤以及嘧啶堿基提取h原子或添加到堿基的雙鍵上來損傷dna。這些反應(yīng)導(dǎo)致dna鏈斷裂。

具有抗氧化和自由基清除性能的化合物可以作為輻射防護(hù)劑并且防止輻射誘導(dǎo)的dna損傷。由于從自然資源分離開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)的復(fù)雜的提取、純化和富集方法，該自然資源與高成本、變異性和難以產(chǎn)生大量sdg來使得臨床前和床前測試可行相關(guān)，因此sdg是化學(xué)合成的。使用天然化合物香草醛和葡萄糖，成功地合成了sdg:sdg(s,s)和sdg(r,r)的兩種對映異構(gòu)體(它們的結(jié)構(gòu)如下所示)(米什拉(mishra)等人，生物有機(jī)化學(xué)與醫(yī)藥化學(xué)通訊(bioorganic&medicinalchemistryletters)2013,(19):5325)。

除了其他以外，在克里斯托費杜-索羅米杜(christofidou-solomidou)等人的許多研究中已經(jīng)顯示sdg是有效的抗氧化劑和有效的自由基清除劑。重要的是，在最近的研究中，合成的sdg對映異構(gòu)體已顯示具有強的抗氧化和自由基清除特性(米什拉等人，生物有機(jī)化學(xué)與醫(yī)藥化學(xué)通訊(bioorganic&medicinalchemistryletters)2013,(19):5325-5328)。在本實例中，當(dāng)合成的sdg對映異構(gòu)體(s,s)-sdg和(r,r)-sdg與商業(yè)sdg相比時，調(diào)研并評估了其輻射防護(hù)性能。使用質(zhì)粒dna松弛測定，通過在將質(zhì)粒暴露于γ-輻射后確定sdg防止超級螺旋至開放螺旋質(zhì)粒dna(pbr322)轉(zhuǎn)化的能力，以及通過在將dna暴露于γ-輻射后評估基因組dna片段化的抑制，來評估三種化合物的輻射防護(hù)特征。sdg由腸道細(xì)菌代謝產(chǎn)生開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)和腸內(nèi)酯(el)。因此，還評估了sdg的這些代謝物對基因組dna的γ-輻射誘導(dǎo)的片段化的影響。

材料和方法

化學(xué)品

質(zhì)粒dna(pbr322)、溴化乙錠、超純10xtae緩沖液和1kbplusdna梯購自英杰公司(invitrogen)(生命技術(shù)公司(lifetechnologies)，卡爾斯拜德，加利福利亞州)。瓊脂糖(超純)和小牛胸腺dna購自西格瑪奧德里奇公司(sigma-aldrich)(圣路易斯，密蘇里州)。開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)(商業(yè))、開環(huán)異落葉松脂素(seco)、腸二醇(ed)、和腸內(nèi)酯(el)購自美國中草藥公司(歐文，加利福尼亞州)。

開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷的合成(sdg)

如米什拉(mishra)等人，生物有機(jī)化學(xué)與醫(yī)藥化學(xué)通訊(bioorganic&medicinalchemistryletters)2013,(19):5325-5328中所述，來合成合成的sdg(r,r)和sdg(s,s)立體異構(gòu)體。

質(zhì)粒dna和小牛胸腺dna暴露于γ-輻射

將具有或不具有不同濃度的sdg(r,r)、sdg(s,s)和sdg(商業(yè))的質(zhì)粒dna(pbr322)或小牛胸腺dna樣品用mark1銫(cs-137)幅射器(jl謝潑德(shepherd)，圣費爾南多，加利福尼亞州)以1.7gy/min的劑量率在磷酸鹽緩沖的生理鹽水(ph7.4)(pbs)中暴露于γ-輻射。

輻射誘導(dǎo)的質(zhì)粒dna松弛的確定

使用質(zhì)粒dna(pbr322)(生命技術(shù)公司，卡爾斯拜德，加利福利亞州)確定測試化合物對輻射誘導(dǎo)的鏈斷裂和超級螺旋(sc)至開放螺旋(oc)轉(zhuǎn)化的影響。將pbs(ph7.4)中的質(zhì)粒dna(500ng)與各種濃度(25-250μm)的sdg(r,r)、sdg(s,s)和sdg(商業(yè))混合，并在pbs中在25gy下進(jìn)行輻射。在輻射暴露后30min，將樣品與負(fù)載染料混合，并在100v下在tae緩沖液(ph，8.3)中進(jìn)行瓊脂糖(1％)凝膠電泳。將凝膠用溴化乙錠(0.5μg/ml)染色40min，洗滌20min，并且然后在uv透射儀(伯樂公司，赫庫斯，加利福尼亞州)上觀察。掃描捕獲的凝膠圖像，并且通過gel-doc圖像分析程序確定開放螺旋(oc)和超級螺旋(sc)質(zhì)粒dna條帶的密度。sc和oc質(zhì)粒dna的密度表示為總密度(oc+sc)的％。

輻射誘導(dǎo)的dna片段化的確定

使用小牛胸腺dna(西格瑪，圣路易斯，密蘇里州)確定測試化合物對dna中輻射誘導(dǎo)的鏈斷裂的影響。將pbs(ph7.4)中的dna(500ng)與各種濃度(25-250μm)的sdg(r,r)、sdg(s,s)和sdg(商業(yè))混合，并在50gy下進(jìn)行輻射持續(xù)30min。在從0.5-10μm范圍內(nèi)的不同濃度下進(jìn)行第二系列實驗。將樣品與負(fù)載染料混合，并在100v下在tae緩沖液(ph，8.3)中進(jìn)行瓊脂糖(1％)凝膠電泳。將凝膠用溴化乙錠(0.5μg/ml)染色40min，洗滌20min，并且然后在uv透射儀(伯樂公司，赫庫斯，加利福尼亞州)上觀察。掃描捕獲的凝膠圖像，并且通過gel-pro圖像分析程序(mediacybernetics，銀泉，馬里蘭州)確定小牛胸腺dna片段的密度。小牛胸腺dna的低分子量(<6,000bp)和高分子量(>6,000bp)片段的密度表達(dá)為總密度的％(低分子量+高分子量)。

數(shù)據(jù)分析

獲得的數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用邦弗朗尼校正用statview程序，使數(shù)據(jù)經(jīng)受單向方差分析(anova)與事后比較。p值≤0.05被認(rèn)為是有意義的。

結(jié)果

使用質(zhì)粒dna(pbr322)確定合成sdg(r,r)、sdg(s,s)和sdg(商業(yè))的輻射防護(hù)潛力。在本研究中使用的輻射防護(hù)測定基于以下原理：暴露于γ-輻射后的質(zhì)粒dna比未暴露的質(zhì)粒dna移動更慢。這僅僅是由于超級螺旋質(zhì)粒dna由于其緊湊的大小而在瓊脂糖凝膠中移動更快的事實。相比之下，質(zhì)粒dna中輻射誘導(dǎo)的缺口解開超級螺旋，導(dǎo)致相對更大尺寸的質(zhì)粒，其以更慢的速率在凝膠中移動。因此，與超級螺旋的質(zhì)粒dna相比，確定開放螺旋的密度反映了輻射誘導(dǎo)的損傷的程度。

輻射導(dǎo)致劑量依賴性sc至ocdna質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

為了選擇引起顯著dna損傷但允許測試輻射減輕劑的治療窗的輻射劑量，將質(zhì)粒dna暴露于10、25和50gy的γ輻射。圖1a中呈現(xiàn)的結(jié)果顯示，存在質(zhì)粒dna的oc形式的輻射劑量依賴性增加以及質(zhì)粒dna的sc形式的輻射劑量依賴性降低。sc和oc的分布(圖1b)顯示sc的％分別在0、10、25和50gy下從68.73％±2.54％降低至50.91％±2.31％、38.37％±3.73％和35.66％±4.24％(p<0.05)。同時，oc的的％分別在0、10、25和50gy下從31.26％±2.50％增加至49.08％±2.31％、61.62％±3.73％和67.33％±4.24％(p<0.05)?；谶@些初始實驗，選擇25gy的輻射劑量(在該輻射劑量下實現(xiàn)相當(dāng)大且清楚可見的損害)用于隨后的實驗以確定不同sdg的輻射防護(hù)特征。

使用質(zhì)粒dna松弛測定的合成sdg的輻射防護(hù)活性

將質(zhì)粒dna暴露于所選劑量的25gyγ輻射(參見圖1)，并測定各種濃度(25-250μm)的每種sdg試劑(合成和商業(yè))對dna損傷的抑制％(sc至oc形成)。

在25、50、100和250μmsdg(s,s)存在下暴露于25gy后的質(zhì)粒dna的代表性凝膠印跡顯示于圖2a中，并且半定量光密度分析示于圖2b中，同時與對照相比的抑制％示于圖2c中。有趣的是，在增加濃度的sdg(s,s)(25、50、100和250μm)存在下，sc形式的比例增加并且oc形式的密度顯著(p<0.05)和劑量依賴性降低。使用％抑制圖(圖2c)，可以確定每種試劑的ec50值(即，在25gy下防止50％質(zhì)粒松弛所需的有效濃度(ec))，其對于sdg(s,s)是141.77μm。該用于防止質(zhì)粒dna松弛的值與清除dpph自由基的ec50值可比較。這些結(jié)果證明了合成的sdg(s,s)對映異構(gòu)體的輻射防護(hù)特征。針對sdg(r,r)對映異構(gòu)體(圖2d-f)和sdg(商業(yè)的)(圖2，g-i)顯示了相似的結(jié)果，ec50分別為127.96μm和98.38μm。用于防止質(zhì)粒dna松弛的這些值與清除dpph自由基的相應(yīng)ec50值可比較。這些結(jié)果證明了合成的和可商購的天然sdg的輻射防護(hù)特征。

輻射導(dǎo)致從高到低分子量片段的劑量依賴性dna片段化

輻射誘導(dǎo)dna片段化的增加，如圖3a中的dna凝膠所示?；诖笮?，小牛胸腺dna片段分為兩組：高分子量(>6,000bp)尺寸和低分子量(<6,000bp)尺寸。高和低分子量片段的分布(圖3b)顯示高分子量dna的％在25和50gy下分別從88.16％±0.50％降至67.82％±7.89％和34.94％±4.45％(p<0.05)。同時，低分子量片段的比例在25和50gy下分別從11.83％±0.50％增加至32.17％±7.89％和65.05％±4.45％(p<0.05)。結(jié)果(圖3b)顯示高分子量dna的顯著降低和低分子量dna片段的顯著增加，表明在50gy下對dna的損傷?；谶@些初始實驗，選擇50gy的輻射劑量(觀察到清楚的可證實的小牛胸腺dna片段化)，用于確定不同sdg的輻射防護(hù)特征的以下實驗。

使用小牛胸腺dna片段化分析的合成sdg的輻射防護(hù)活性

使用如以上所描述的小牛胸腺dna的輻射誘導(dǎo)的片段化確定合成sdg(r,r)、sdg(s,s)和sdg(商業(yè))的輻射防護(hù)潛力。

高sdg濃度(25-250μm)：圖4a顯示在25、50、100和250μmsdg(s,s)存在下暴露于50gy后的小牛胸腺dna的代表性dna凝膠。在增加濃度的sdg(s,s)(25、50、100和250μm)的存在下，在輻射暴露后，高分子量dna形式的比例顯著增加(p<0.05)，而低分子量片段減少。圖4b中呈現(xiàn)了在各種濃度的sdg(s,s)下，高和低分子量大小dna形式的分布。這些結(jié)果表明使用小牛胸腺基因組dna我們的合成sdg(s,s)對映異構(gòu)體的輻射防護(hù)特征。類似地，圖4c-d和4e-f中呈現(xiàn)的結(jié)果分別顯示合成sdg(r,r)和sdg(商業(yè))的輻射防護(hù)性能。這些結(jié)果表明使用小牛胸腺基因組dna的合成sdg(r,r)和(s,s)對映異構(gòu)體的輻射防護(hù)特征。

為了進(jìn)一步確定dna保護(hù)中sdg的下限，進(jìn)行了測試從0.5-10μm范圍的低濃度的所有3種sdg的一系列dna片段化實驗。

低sdg濃度(0.5-10μm)：與其抗氧化劑和自由基清除活性的ec50值相比，在低濃度的sdg(s,s)、sdg(r,r)和sdg(商業(yè))下進(jìn)行的試驗的結(jié)果呈現(xiàn)于圖5中。類似于更高的sdg濃度，在本節(jié)中使用小牛胸腺dna片段化測定法呈現(xiàn)的這些結(jié)果證明，即使在低濃度下，合成的sdg(s,s)和sdg(r,r)對映異構(gòu)體也具有強的輻射防護(hù)特征。

使用小牛胸腺dna片段化測定sdg代謝物的輻射防護(hù)活性

確定sdg代謝物seco、ed和el的輻射防護(hù)潛力，并與如上所述的使用小牛胸腺dna的輻射誘導(dǎo)的片段化的sdg進(jìn)行比較?；谝陨献鳛橹兄涤行┝渴境龅囊郧暗陌l(fā)現(xiàn)，選擇每種測試劑的10μm的濃度。結(jié)果示于圖6中。數(shù)據(jù)證明sdg及其代謝物seco、ed、el在其防輻射性能方面是等效的。

討論

本實例的結(jié)果表明，合成的sdg(s,s)和sdg(r,r)對映異構(gòu)體具有強的輻射防護(hù)性能。使用質(zhì)粒dna(pbr322)測定的這些對映異構(gòu)體的輻射防護(hù)潛力，隨其濃度的增加而增加。這些合成的sdg(s,s)和sdg(r,r)對映異構(gòu)體以濃度依賴性方式防止對質(zhì)粒dna的輻射誘導(dǎo)的損傷。sdg的合成異構(gòu)體的輻射防護(hù)潛力與商業(yè)sdg可比較。合成對映異構(gòu)體sdg(s,s)和sdg(r,r)也防止了小牛胸腺基因組dna的放射誘導(dǎo)的dna片段化。在測試的最低濃度下，sdg(s,s)和sdg(r,r)完全防止輻射誘導(dǎo)的小牛胸腺dna的低分子量片段的產(chǎn)生，證明合成的sdg(s,s)和sdg(r,r)對映異構(gòu)體的輻射防護(hù)特征。使用低濃度的sdg(s,s)、sdg(r,r)和sdg(商業(yè))的結(jié)果表明，與其抗氧化劑和自由基清除活性的ec50值相比，用于保護(hù)小牛胸腺dna免受γ輻射損傷所需的濃度低得多。重要的是，sdg、seco、ed和el的哺乳動物木脂素代謝物顯示出同樣有效的dna保護(hù)性能。

黃酮類具有強烈的抗氧化劑活性；具體地，這樣的多酚具有自由基清除活性，并且已知是比維生素e和c更有效的體外抗氧化劑。還已知具有抗氧化劑性能的飲食和藥用植物預(yù)防與氧化應(yīng)激相關(guān)的許多人類疾病，并且是有用的輻射防護(hù)劑?？寡趸瘎?，包括維生素和礦物質(zhì)，在輻射暴露后多年抑制切爾諾貝利工人中的致染色體畸變因子的水平。我們一直使用胸部輻射損傷的小鼠模型調(diào)研全谷物飲食亞麻籽、富含木脂素多酚的谷物以及富含sdg的亞麻籽木脂素配制品在輻射誘導(dǎo)損傷中的作用。我們已經(jīng)表明，當(dāng)在輻射暴露之前和之后給予時，亞麻籽改善小鼠中輻射誘導(dǎo)的炎癥和氧化應(yīng)激。我們還證明，喂養(yǎng)僅包含亞麻籽的木脂素組分的飲食的輻射小鼠，該飲食富含木脂素雙酚sdg，也顯示出顯著改進(jìn)的血液動力學(xué)測量和存活，同時還改進(jìn)肺部炎癥和氧化組織損傷。這些研究表明亞麻籽通過木脂素sdg的作用針對體內(nèi)放射誘導(dǎo)組織損傷具有保護(hù)性。

活性氧簇(ros)如超氧化物陰離子(o2^-)、羥基自由基(^.oh)、和過氧化氫的產(chǎn)生的增加導(dǎo)致在各種實驗和病理條件下的組織損傷?；钚匝醮赝ㄟ^細(xì)胞膜脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和基因組dna的氧化修飾導(dǎo)致細(xì)胞損傷。許多研究已經(jīng)顯示，提取的、純化的或合成的亞麻籽sdg是體外以及體內(nèi)的有效抗氧化劑。因此，sdg作為抗氧化劑在各種實驗和疾病條件下(包括在經(jīng)歷放射療法的患者中的輻射誘導(dǎo)的組織損傷)具有治療潛力。

多酚通常在植物中作為糖苷存在并具有抗氧化劑性能。黃酮類作為抗氧化劑，干擾在活性氧簇的產(chǎn)生中涉及的酶活性，淬滅自由基，螯合過渡金屬，并使它們在芬頓反應(yīng)中無氧化還原活性。開環(huán)異落葉松脂素(sdg)是亞麻籽中的主要木脂素，并已被證明是一種有效的體外以及體內(nèi)的抗氧化劑。為了探討亞麻籽木脂素開環(huán)異落葉松脂素(sdg)的治療潛力，使用香草醛作為前體分子通過化學(xué)反應(yīng)合成sdg，并通過評估以下各項確定合成sdg(r,r)和sdg(s,s)的抗氧化劑性能：其還原能力，金屬螯合潛力，和對羥基自由基、過氧化自由基和dpph自由基的自由基清除活性。在本實例中，我們通過評估合成的sdg(r,r)、sdg(s,s)對映異構(gòu)體和可商購的sdg(作為對照)用于防止γ-輻射誘導(dǎo)的質(zhì)粒dna(pbr322)和小牛胸腺dna的損傷的潛力，來調(diào)研其輻射防護(hù)特征。通過質(zhì)粒dna的開放螺旋形式的增加和質(zhì)粒dna的超級螺旋形式的減少來評估對質(zhì)粒dna的輻射誘導(dǎo)的損傷。通過確定dna片段化的水平來評估對基因組dna的輻射誘導(dǎo)的損傷。在該實例中，我們已經(jīng)檢查了合成sdg(r,r)、sdg(s,s)和商業(yè)sdg在無細(xì)胞系統(tǒng)中對輻射誘導(dǎo)的dna損傷的功效。

之前已經(jīng)證明了sdg分子的抗氧化劑性能。我們已經(jīng)表明，天然的，可商購的sdg在暴露于輻射的細(xì)胞中具有有效的自由基清除性能。研究了這些合成的sdg(r,r)和sdg(s,s)對映異構(gòu)體的抗氧化劑和自由基清除特征，并且已經(jīng)證明具有強的還原能力，高的金屬離子螯合潛力，和針對羥基自由基、過氧化自由基和dpph自由基的高自由基清除活性。合成sdg(r,r)和sdg(s,s)的這些特征表明這些分子顯示出調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，降低金屬離子濃度和清除氧自由基的很強的潛力。合成的sdg對映異構(gòu)體的這些特征表明其通過作用于和防止自由基反應(yīng)的引發(fā)、蔓延以及終止的所有三個步驟而起作用的能力，表明這些潛在的機(jī)制可能是造成體內(nèi)sdg(s,s)和sdg(r,r)對映異構(gòu)體的輻射防護(hù)特征的原因。

所進(jìn)行的一個觀察是，通過sdg的基因組dna的最大輻射防護(hù)已經(jīng)在約5.0μm濃度下實現(xiàn)，該濃度遠(yuǎn)低于其自由基清除和抗氧化劑作用的ec50值。因此，sdg作為抗氧化劑和自由基清除劑也可以作為dna輻射防護(hù)劑和輻射緩解劑。

總之，在本實例中，證明合成的sdg(s,s)和sdg(r,r)對映異構(gòu)體具有強輻射防護(hù)特征。使用質(zhì)粒dna(pbr322)和小牛胸腺dna確定這些對映異構(gòu)體的輻射防護(hù)潛力。合成的sdg(s,s)和sdg(r,r)對映異構(gòu)體以濃度依賴性方式防止對質(zhì)粒dna的輻射誘導(dǎo)的損傷。合成對映異構(gòu)體sdg(s,s)和sdg(r,r)也防止了小牛胸腺基因組dna的放射誘導(dǎo)的片段化。在5μm的濃度下，sdg(s,s)和sdg(r,r)完全防止輻射誘導(dǎo)的小牛胸腺dna的低分子量片段的產(chǎn)生，證明這些對映異構(gòu)體具有強的輻射防護(hù)特征。

實例2

木質(zhì)素開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)在肺細(xì)胞中的輻射防護(hù)性能

細(xì)胞的輻射損傷由活性氧簇(ros)的產(chǎn)生引發(fā)。ros對細(xì)胞機(jī)制造成的損傷的譜包括脂質(zhì)過氧化，dna-蛋白交聯(lián)，堿基修飾，加合物形成和單鏈和雙鏈斷裂(dnassb和dsb)。這些修飾已經(jīng)涉及輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞死亡。由于細(xì)胞dna損傷是輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中已知的決定因素，因此已經(jīng)做出了顯著的努力來鑒定和開發(fā)可以通過干擾自由基反應(yīng)或通過調(diào)節(jié)輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡來保護(hù)dna免受輻射損傷的試劑。

通過在暴露時系統(tǒng)中抗氧化劑的存在可以實現(xiàn)防止輻射誘導(dǎo)的基因毒性。由于抗氧化劑可以是干擾自由基鏈反應(yīng)的ros清除劑，因此通過補充劑抗氧化劑可以保護(hù)細(xì)胞dna免受輻射誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。已經(jīng)研究了許多合成和天然抗氧化劑化合物的輻射防護(hù)功效。然而，它們中的大多數(shù)在其有效濃度下表現(xiàn)出固有的毒性和副作用，或者具有短的保質(zhì)期和低的生物利用度。因此，尋找有效和無毒的輻射防護(hù)劑已導(dǎo)致對飲食抗氧化劑和營養(yǎng)制品的調(diào)查調(diào)研。

我們評估了飲食亞麻籽(fs)補充劑在氧化性肺損傷(如高氧，酸性吸入損傷和缺血/再灌注損傷)的臨床前鼠模型中的保護(hù)作用。我們確定fs的保護(hù)作用可能部分是由于其增強肺組織中的抗氧化劑酶表達(dá)的能力。重要的是，飲食fs改善了在暴露之前以及暴露后當(dāng)給予時胸部輻射的不利影響。在這些研究中，飲食亞麻籽減少輻射誘導(dǎo)氧化肺組織損傷，減少肺部炎癥和預(yù)防肺纖維化。

早先的報告表明，亞麻籽的多樣化作用可能歸因于其木脂素，其木脂素已被證明具有抗氧化劑，抗炎和抗致癌作用。開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)是突出的fs木脂素(約干重的1％)，這可能有助于fs顆粒的有益的健康影響。sdg在腸中通過腸道細(xì)菌代謝為哺乳動物木脂素，即，腸二醇(ed)和腸內(nèi)酯(el)。顯示出sdg有益于治療許多疾病(如動脈粥樣硬化和糖尿病)的臨床前模型。sdg也被報道在動物模型中發(fā)揮心臟保護(hù)作用。fs木脂素對多種癌癥類型具有保護(hù)作用，如在阿道夫(adolphe)等人在近期關(guān)于sdg的健康影響的綜述(英國營養(yǎng)學(xué)雜志(brjnutr)2010,103:929)中所總結(jié)的，并且報道其減少動物中的黑素瘤轉(zhuǎn)移。

此外，sdg的抗氧化劑和自由基清除性能已有文獻(xiàn)記載，這是至關(guān)重要的，因為化合物的自由基清除能力可直接與其輻射防護(hù)功效相關(guān)。在我們對肺內(nèi)皮細(xì)胞的研究中，當(dāng)細(xì)胞暴露于γ-輻射時，sdg顯示出自由基清除性能，而全部亞麻籽木脂素組分(flc)富含sdg，介導(dǎo)了小鼠中的輻射防護(hù)和輻射緩解。然而，尚未建立sdg的輻射防護(hù)性能的表征。

進(jìn)行這項研究，以確定fs木脂素sdg的輻射防護(hù)能力，并探討負(fù)責(zé)其作用的可能機(jī)制。本研究的第一個目的是評估sdg對原代鼠肺細(xì)胞中，特別是上皮，內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中輻射誘導(dǎo)的克隆性死亡的作用。由于輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞生殖死亡與細(xì)胞dna損傷直接相關(guān)，因此我們通過使用堿性彗星測定(ssb)和γ-h2ax病灶(dsb)的形成評估了sdg是否可以保護(hù)細(xì)胞免受輻射誘導(dǎo)的dna鏈斷裂。此外，我們檢查了sdg預(yù)處理在預(yù)防小鼠原代肺細(xì)胞避免ir誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中的影響。許多研究已經(jīng)證明促細(xì)胞凋亡蛋白bax(bcl-2相關(guān)x蛋白)在ir誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中的作用。我們還分析了sdg對bax及其拮抗劑bcl-2(b細(xì)胞白血病/淋巴瘤2)mrna表達(dá)的直接作用，以確定sdg保護(hù)的機(jī)制是否涉及細(xì)胞凋亡的這些關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑的比例的變化。我們的研究結(jié)果確定木質(zhì)素sdg，fs中的有效的生物活性成分，介導(dǎo)肺細(xì)胞中的放射防護(hù)，從而提供對fs的輻射防護(hù)作用的新穎的見解。

材料和方法

試劑

開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)是可商購的(美國中草藥公司，加利福尼亞州)。彗星測定試劑盒購自trevigen公司(蓋瑟斯堡，馬里蘭州)。p-組蛋白h2ax(兔mab)購自細(xì)胞信號技術(shù)有限公司(cellsignalingtechnology,inc.)(丹弗斯(danvers)，馬薩諸塞州)。磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)，牛血清白蛋白(bsa)，具有l(wèi)-谷氨酰胺、葡萄糖1g/l、不含碳酸氫鈉的杜氏改良培養(yǎng)基(dmem)，hepes緩沖液，胰蛋白酶，牛血清白蛋白(bsa)，乙二胺四乙酸(edta)，4,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)，胎牛血清(fbs)，膠原酶，triton-x100和分散酶購自西格瑪奧德里奇公司，圣路易斯，密蘇里州，美國。

細(xì)胞系

從c57/bl6小鼠分離成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。對于成纖維細(xì)胞分離，收獲小鼠肺，切碎，并用分散酶(2mg/ml)孵育45分鐘。將這些片鋪板，并如前所述培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，并在通道3和10之間使用。如前所述從小鼠肺分離肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pmvec)。簡言之，用膠原酶處理新鮮收獲的小鼠肺，然后通過粘附到用mab包被的磁珠來分離細(xì)胞到血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(pecam)上。上皮細(xì)胞(c10)細(xì)胞最初來源于正常的balb/c小鼠肺外植體，并且是非致瘤性的，接觸抑制的，并且在傳代早期具有肺泡2型細(xì)胞特征。

克隆存活

將指數(shù)生長的細(xì)胞作為單細(xì)胞鋪板并孵育過夜。在輻射(2、4、6和8gy)前6h用各種劑量的木脂素sdg(10-50μm)處理細(xì)胞?；诋?dāng)攝取10％亞麻籽時在血液循環(huán)中達(dá)到的生理水平范圍內(nèi)的動物研究，來選擇木脂素劑量。以1.7gy/min的劑量率用mark1銫(cs-137)輻射器(jl謝潑德，圣費爾南多，加利福尼亞州)輻射細(xì)胞。輻射后10至15天對菌落進(jìn)行染色并計數(shù)，并且計算存活部分。

彗星分析

培養(yǎng)指數(shù)生長的細(xì)胞，并在輻射(2gy)之前以不同的時間間隔用sdg(50μm)進(jìn)行處理。按照制造商的說明書(trevigen公司，蓋瑟斯堡，馬里蘭州)處理細(xì)胞用于彗星測定。簡言之，將細(xì)胞(1x10⁵個細(xì)胞/ml，在pbs中)與(1:10，v/v)混合，并立即移液到cometslide^tm上。然后將細(xì)胞裂解(4℃，30min)并保持在黑暗中以解旋(rt)。在水平電泳單元中在18伏(200安培)下進(jìn)行電泳25分鐘。載玻片用dw洗滌兩次，固定在70％乙醇中并在45℃下干燥。dna通過sybr綠(trevigen公司)進(jìn)行染色。每組至少記錄150個細(xì)胞。使用彗星圖像分析軟件測量細(xì)胞和彗星尾長的視覺分析(彗星實驗iv，perceptive儀器有限公司，黑弗里爾，英國)。使用單色ccdfirewire照相機(jī)在olympusix51熒光顯微鏡上捕獲圖像。

γ-h2ax的免疫染色和流式細(xì)胞術(shù)。

針對γ-h2ax的免疫染色，將細(xì)胞鋪在玻璃蓋玻片(5,000個細(xì)胞/蓋玻片)上，用50μmsdg預(yù)處理(6h)并進(jìn)行輻射(2gy)。以所需的時間間隔，固定細(xì)胞(4％多聚甲醛)，洗滌并用pbst(pbs+包含5％山羊血清，1％bsa的0.1％tritonx-100)進(jìn)行封閉。將細(xì)胞用γ-h2ax第一抗體(1:200)在4℃下孵育過夜，接著用pbst(3x5min)進(jìn)行洗滌并與第二抗體(alexa488，英杰公司，加利福利亞州，美國)在室溫下孵育1hr。用dapi對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，并在熒光顯微鏡下觀察。

針對facs分析，將細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化并用pbs進(jìn)行洗滌。然后將細(xì)胞固定(fix/perm緩沖液，ebioscience公司)45分鐘，并且此后使用滲透清洗緩沖液(biolegend公司，美國)洗滌。將細(xì)胞重懸于與alexa488(1:100v/v，細(xì)胞信號技術(shù)公司(cellsignalingtechnology)，美國)共軛的200μl兔單克隆磷酸-組蛋白γ-h2ax(ser139)抗體中，并在4℃下孵育30min。再次用洗滌緩沖液洗滌細(xì)胞并進(jìn)行分析。使用cyanadp(高級數(shù)字處理)流式細(xì)胞儀(dako公司，丹麥)coulter，富勒頓，加利福尼亞州)測量γ-h2ax，并使用summit軟件(公司，丹麥)定量陽性細(xì)胞。

凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)檢測

凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的縮合，膜起泡，細(xì)胞收縮以及細(xì)胞核dna的分解，首先在大區(qū)段中，并且隨后在核小體片段中，并且最后形成良好封閉的細(xì)胞凋亡小體。從用于微核檢測的載玻片經(jīng)顯微鏡確定經(jīng)歷細(xì)胞凋亡的細(xì)胞的百分比(細(xì)胞遺傳損傷)。對于每個實驗(實驗進(jìn)行兩次)計數(shù)至少500個細(xì)胞，并如下確定凋亡細(xì)胞百分比：

％細(xì)胞死亡＝na/ntx100，

其中na是具有細(xì)胞凋亡體的細(xì)胞的數(shù)量，并且nt是所分析的細(xì)胞的總數(shù)。

通過定量實時pcr(qpcr)的基因表達(dá)分析

使用由應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystems)，生命技術(shù)公司(卡爾斯拜德，加利福利亞州)提供的基于探針的基因表達(dá)測定法進(jìn)行qpcr。為了評估sdg處理對細(xì)胞凋亡基因的mrna表達(dá)的影響，針對bax(mm00432051_m1)和bcl-2(mm00477631_m1)進(jìn)行單個基因表達(dá)測定。

簡言之，將細(xì)胞用sdg(50μm，6hrs)進(jìn)行預(yù)處理并輻射(2gy)。使用rneasyplus迷你試劑盒(凱杰有限公司，巴倫西亞，加利福尼亞州)分離總rna，并使用nanodrop2000(賽默飛世爾科技公司(thermofisherscientific)，沃爾瑟姆，馬薩諸塞州)定量。然后使用由應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，生命技術(shù)公司(卡爾斯拜德，加利福利亞州)提供的高容量rna至cdna試劑盒在熱循環(huán)儀上進(jìn)行rna至cdna的逆轉(zhuǎn)錄。在steponeplus^tm實時pcr系統(tǒng)(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，生命技術(shù)公司，卡爾斯拜德，加利福利亞州)上使用每個反應(yīng)孔25ng的cdna進(jìn)行qpcr。將基因表達(dá)數(shù)據(jù)歸一化為18s核糖體rna，并根據(jù)δδct方法校準(zhǔn)至未處理的對照樣品。

通過蛋白質(zhì)印跡法的細(xì)胞凋亡檢測

通過使用免疫印跡觀察到的bax(細(xì)胞凋亡啟動子)，bcl-2(細(xì)胞凋亡抑制劑)，切割的半胱氨酸蛋白酶-3和切割的聚(腺苷二磷酸-核糖)聚合酶(parp)的水平在小鼠肺上皮細(xì)胞中確定細(xì)胞凋亡。簡言之，在包含蛋白酶抑制劑的pbs中裂解細(xì)胞。然后使用10孔sds12％nupage凝膠(英杰公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞州)進(jìn)行細(xì)胞裂解物的免疫印跡分析。在200v下進(jìn)行電泳1小時。在25伏下轉(zhuǎn)移至polyscreenpv轉(zhuǎn)移膜(珀金埃爾默生命科學(xué)公司(perkinelmerlifesciences)，波士頓，馬薩諸塞州)進(jìn)行1小時。將膜在磷酸鹽緩沖鹽水中的5％脫脂奶粉中封閉過夜。然后棄去脫脂奶粉，并且用第一抗體孵育該膜。使用制造商推薦的稀釋液(細(xì)胞信號傳導(dǎo)技術(shù)公司，丹弗斯，馬薩諸塞州)，使用針對bax和bcl-2的兔抗小鼠單克隆抗體，以及兔抗小鼠切割的半胱氨酸蛋白酶-3(asp175)，單克隆抗體和兔多克隆抗切割的parp(214/215)切割位點特異性抗體，來檢測bax、bcl-2、切割的半胱氨酸蛋白酶-3、和切割的parp的蛋白質(zhì)水平。將膜洗滌5次，并且然后在與辣根過氧化物酶共軛的第二抗體中在室溫下孵育45分鐘。使用westernlightingchemiluminescencereagentplus(珀金埃爾默生命科學(xué)公司，波士頓，馬薩諸塞州)顯影膜，并且通過特異性條帶(bax為20kda，bcl-2為26kda，切割的半胱氨酸蛋白酶-3為17/19kda，并且切割的parp為89kda)的光密度掃描進(jìn)行定量，該特異性條帶使用通過特異性第二抗體(西格瑪，圣路易斯，密蘇里州)檢測的β-肌動蛋白表達(dá)水平調(diào)整負(fù)載。

統(tǒng)計

結(jié)果表示為平均值±sem。使用kaleidagraph軟件(4.0)制備克隆生成測定的存活曲線。使用單向方差分析(anova)確定組間的統(tǒng)計學(xué)差異。當(dāng)發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)顯著差異(p<0.05)時，使用bonferoni/dunn測試(statview4.0)進(jìn)行個體比較。

結(jié)果

sdg治療增加了輻射的原代肺細(xì)胞的集落形成能力

克隆生存測定法已廣泛用于在暴露于環(huán)境和藥物致癌物質(zhì)、電離輻射等之后在細(xì)胞經(jīng)歷任何基因毒性應(yīng)激后確定細(xì)胞生殖死亡。在該實例中，評估了sdg(10-50μm)預(yù)處理對原發(fā)性肺細(xì)胞(上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞)的克隆形成中輻射誘導(dǎo)的減少的影響。結(jié)果顯示，與它們各自的未處理的對照細(xì)胞(100％)相比，單獨的sdg(10-50μm)不引起對所有三種細(xì)胞類型的集落形成能力的任何不利影響(圖1a-1c)。

輻射治療以劑量依賴性方式顯著(p≤0.01)降低了上皮和內(nèi)皮細(xì)胞的集落形成能力。當(dāng)在輻射前用sdg處理細(xì)胞時，在所有處理組中存活的部分顯著增強(圖7a，7b)。在50μmsdg預(yù)處理的輻射組中觀察到對在成纖維細(xì)胞中克隆形成的輻射誘導(dǎo)的損失的最大保護(hù)(圖7c)。因此，我們選擇這種特定濃度的sdg用于我們的進(jìn)一步研究。

sdg防止在所輻射的原發(fā)性肺細(xì)胞中形成dnassb

我們首先進(jìn)行了一項研究，以確定在放射生物相關(guān)劑量2gy后在所有細(xì)胞類型(內(nèi)皮、上皮、成纖維細(xì)胞)中dna損傷的動力學(xué)。如所預(yù)期的，與其相應(yīng)的未經(jīng)輻射的對照細(xì)胞相比，在所有細(xì)胞類型中輻射暴露誘導(dǎo)了顯著的dna損傷，如增加的尾力矩所證明的。dna損傷的程度在輻射后30分鐘最大。dna損傷的程度隨著輻射后長達(dá)60分鐘的時間而降低，并且在輻射后2小時進(jìn)一步急劇下降。因此，我們選擇30分鐘時間間隔進(jìn)行與放射誘導(dǎo)的dna損傷相關(guān)的進(jìn)一步研究(圖8a)。

與其未輻射的對照細(xì)胞相比，輻射暴露(2gy)導(dǎo)致彗星尾長顯著增加。在輻射前以各種時間間隔(0h、2h、4h、6h和24h)處理細(xì)胞。在所有時間間隔用sdg(50μm)預(yù)處理細(xì)胞顯著抑制所有三種類型的肺細(xì)胞中的輻射誘導(dǎo)的彗星尾長。然而，在輻射前6hsdg處理時觀察到在所有細(xì)胞類型中對dna的輻射誘導(dǎo)尾力矩的最大保護(hù)(圖8b)。描述在輻射(在sdg的存在和/或不存在)肺上皮細(xì)胞中彗尾形成的代表性熒光顯微照片已經(jīng)在插入物，圖8b中顯示。

sdg治療廢除了鼠原代肺細(xì)胞中γ-h2ax病灶的形成

為了進(jìn)一步測試我們的假設(shè)，sdg是否可以保護(hù)免受氧化性dna損傷，我們還評估了sdg對誘導(dǎo)γ-h2ax病灶的作用。使用標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡生成的圖像分析(圖9，10)和流式細(xì)胞術(shù)(圖11)方法評估sdg預(yù)處理對氧化性dna損傷的影響，其由輻射后鼠原代肺細(xì)胞中的γ-h2ax形成證實。熒光顯微鏡分析的結(jié)果顯示，輻射(2gy)暴露導(dǎo)致所有三種細(xì)胞類型中γ-h2ax病灶的形成的顯著增加(圖9)。病灶/細(xì)胞數(shù)量基本上增加15分鐘，在輻射后30分鐘達(dá)到峰值(針對上皮、內(nèi)皮和成纖維細(xì)胞的分別為46.7％±0.5、33.6％±3.2和30.0％±1.4的γ-h2ax陽性細(xì)胞)，而數(shù)字在暴露的1小時內(nèi)顯著降低，但仍顯著高于未經(jīng)輻射的對照細(xì)胞。與它們各自的未經(jīng)輻射的對照細(xì)胞(針對所有細(xì)胞類型p<0.005)相比，所有值都顯著更高(圖9)。

sdg預(yù)處理(ir前6小時)顯著降低了γ-h2ax的誘導(dǎo)，因為在經(jīng)輻射的上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中，γ-h2ax陽性細(xì)胞數(shù)量分別降低到22.7％±2.17、21.92％±2.88和22.1％±1.9(針對上皮，p<0.005，并且針對內(nèi)皮和成纖維細(xì)胞，p<0.05)。sdg保護(hù)細(xì)胞免受γ-h2ax病灶形成的能力似乎獨立于細(xì)胞類型，因為sdg的預(yù)處理保護(hù)所有三種類型的肺細(xì)胞免受輻射誘導(dǎo)的dna鏈斷裂。圖10描述了原代肺上皮細(xì)胞中γ-h2ax陽性細(xì)胞的顯微鏡分析的代表性熒光顯微照片。

使用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證實了輻射暴露后sdg對鈍化γ-h2ax陽性細(xì)胞的誘導(dǎo)的保護(hù)作用。如所預(yù)期的，在輻射后觀察到在γ-h2ax陽性細(xì)胞的誘導(dǎo)中的類似模式；然而，在所有細(xì)胞類型中，通過sdg預(yù)處理顯著消除了γ-h2ax陽性細(xì)胞的數(shù)量(圖11)。

sdg治療防止原代肺細(xì)胞免受ir誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡死亡

為了研究sdg在細(xì)胞凋亡方面的細(xì)胞保護(hù)作用，用dapi染色細(xì)胞核用于通過顯微鏡的目測并計數(shù)。顯微鏡分析證實，對照細(xì)胞具有完整的染色質(zhì)(凋亡細(xì)胞約4％-5％)，而輻射暴露顯著(p≤0.05)以時間和劑量依賴性方式增加凋亡細(xì)胞的百分比。在24h時，在上皮和內(nèi)皮細(xì)胞中分別觀察到凋亡細(xì)胞的百分比為13.9％±1.08和15.1％±1.95。sdg預(yù)處理(50μm)明顯(p≤0.05)反映了ir誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞百分比增加(在上皮和內(nèi)皮細(xì)胞中分別為9.9％±1.08和10.71％±1.45凋亡細(xì)胞)，如圖12(a和b)中所示。發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞最敏感，因為輻射暴露導(dǎo)致在24和48hr凋亡細(xì)胞分別顯著提高36.4％和41.8％。重要的是，如上皮和內(nèi)皮細(xì)胞所示，用sdg預(yù)處理也顯著降低了肺成纖維細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡程度(圖12c)。

sdg治療修飾鼠原發(fā)性肺上皮細(xì)胞中細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)子的表達(dá)

為了進(jìn)一步闡明sdg在鈍化dna損傷和細(xì)胞死亡中的輻射防護(hù)作用，我們假設(shè)sdg可以改變促細(xì)胞凋亡和抗細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)子蛋白的比例。因此，我們測試了在輻射存在或不存在下sdg治療肺細(xì)胞是否會改變bax和bcl-2的基因表達(dá)，以及這些變化是否將轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)水平的變化。為此，用sdg(50μm)處理肺上皮、內(nèi)皮和成纖維細(xì)胞，并通過qpcr在ir后6、24和48小時評估酶mrna水平(圖13a和13b)。我們觀察到2gy導(dǎo)致在ir后24和48小時促細(xì)胞凋亡baxmrna水平增加約11倍，其通過sdg預(yù)處理顯著(p<0.05)抑制?？商娲?，抗細(xì)胞凋亡bcl-2mrna水平不由于輻射暴露而改變，然而在ir處理后24和48小時，在sdg預(yù)處理的細(xì)胞中分別增加了6.6和3.5倍。當(dāng)通過蛋白質(zhì)印跡分析bax和bcl-2mrna水平的變化的蛋白質(zhì)驗證時，我們發(fā)現(xiàn)bax和bcl-2蛋白水平的隨后增加趨向于在sdg預(yù)處理的細(xì)胞中降低的水平(圖13c描繪了代表性印跡，并且13d和13e顯示了帶密度定量)。為了進(jìn)一步調(diào)研通過sdg觀察到的輻射防護(hù)背后的潛在機(jī)制，我們評估了sdg在改變細(xì)胞凋亡信號級聯(lián)：執(zhí)行子切割的半胱氨酸蛋白酶-3和切割的parp中涉及的關(guān)鍵蛋白水平中的作用?？偟膩碚f，切割的半胱氨酸蛋白酶-3和切割的parp的水平在經(jīng)輻射的細(xì)胞中在ir后6、24和48小時顯著增加，并且趨向于在sdg預(yù)處理的細(xì)胞中降低的水平(圖14a描述了代表性印跡，并且14b和14c顯示了帶密度定量)。

討論

在這個實例中，我們證明fs木脂素sdg可以保護(hù)鼠原代肺細(xì)胞免受輻射誘導(dǎo)的氧化性dna損傷和細(xì)胞凋亡死亡。我們觀察到sdg預(yù)處理不僅改善ir誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，如通過克隆形成生存測量的，而且還減少了dna鏈斷裂(dsbs和ssbs)的誘導(dǎo)和肺細(xì)胞中的細(xì)胞死亡。重要的是，通過sdg治療還改變了參與細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)。這些研究結(jié)果表明sdg可能作為無毒的輻射防護(hù)劑在輻射情況下和改進(jìn)放射治療的治療指數(shù)中是有用的。

ir誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡是細(xì)胞放射敏感性的經(jīng)典標(biāo)志物，其特征在于克隆形成生存的喪失。類似地，我們還注意到所有三種鼠肺細(xì)胞中的克隆形成的輻射劑量依賴性損失，其通過sdg預(yù)處理顯著減弱(圖7)。細(xì)胞dna是細(xì)胞中ir誘導(dǎo)的損傷的主要靶標(biāo)。在暴露期間產(chǎn)生的ros誘導(dǎo)細(xì)胞dna的改變的陣列，其范圍從突變、堿基損傷、交聯(lián)、ssb和dsb。dna中的損傷不能被代替，并且因此必須修復(fù)，并且如果其保持未修復(fù)，該細(xì)胞可以訴諸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或壞死。因此，靶細(xì)胞dna的保護(hù)賦予針對基因毒性損害的第一道防線。ros產(chǎn)生在暴露的幾秒內(nèi)發(fā)生，并且在輻射后持續(xù)幾分鐘。因此，早期輻射應(yīng)答(如立即dna損傷)在輻射暴露后幾分鐘內(nèi)發(fā)生。類似地，在受輻射細(xì)胞的時間依賴性動力學(xué)研究中，我們還觀察到dna鏈斷裂的程度，如彗星尾長所證明的，在暴露后30分鐘內(nèi)達(dá)到其最大水平，并隨后減少(圖8a)。

彗星測定是用于在細(xì)胞水平下檢測dna損傷/修復(fù)的敏感技術(shù)，并且已廣泛用于研究dna鏈斷裂。多酚通過減少ros介導(dǎo)的氧化性dna損傷具有保護(hù)正常組織或細(xì)胞免受輻射的損傷作用的能力。在本研究中，通過使用標(biāo)準(zhǔn)堿性彗星測定，我們還評估了sdg對ir誘導(dǎo)的ssb在鼠原代肺細(xì)胞中的作用。我們的結(jié)果與其他報告一致，這些其他報告顯示針對其他多酚(如，白楊素和表兒茶酸)免受輻射誘導(dǎo)的dnassb的類似的保護(hù)作用。

盡管ssb容易被細(xì)胞修復(fù)，但是dsb對于細(xì)胞更難以修復(fù)，并且更可能導(dǎo)致誘變，因此dsb主要代表致死性細(xì)胞事件。h2ax分子對于通過輻射引入的每個dna雙鏈斷裂沿著兆堿基長染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域變?yōu)榱姿峄?γ-h2ax)，并且γ-h2ax損失或去磷酸化與dna修復(fù)在時間上相關(guān)。我們在這里報告，在所有三種類型測試的細(xì)胞中，sdg保護(hù)細(xì)胞dna避免紅外誘導(dǎo)dsb。我們的結(jié)果與一些其他研究一致，這些其他研究也表明多酚像白藜蘆醇和綠茶兒茶素保護(hù)細(xì)胞免受ir誘導(dǎo)dna鏈斷裂。然而，在輻射不存在下，sdg在這些細(xì)胞二者之一中都沒有發(fā)揮任何毒性作用。由于氧化性dna損傷被認(rèn)為是許多癌癥的前體，所以通過作為抗氧化劑的sdg的這種損傷的減少可以導(dǎo)致降低的癌癥風(fēng)險。

眾所周知，ir誘導(dǎo)的細(xì)胞和組織中細(xì)胞凋亡部分是由于細(xì)胞中dna損傷的誘導(dǎo)。雖然若干種機(jī)制(o6-甲基鳥嘌呤、堿基n-烷基化、龐大的dna加合物，dna交聯(lián))參與dna損傷依賴性細(xì)胞凋亡，但是dna雙鏈斷裂在誘導(dǎo)凋亡性細(xì)胞死亡中起主要作用。在這項研究中，用sdg預(yù)處理細(xì)胞保護(hù)避免肺細(xì)胞中輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并且抑制彗星尾長和γ-h2ax病灶形成。因此，sdg對輻射誘導(dǎo)的凋亡性細(xì)胞死亡的保護(hù)作用可以歸因于其減少細(xì)胞氧化應(yīng)激的能力、離子穩(wěn)態(tài)恢復(fù)及其防止dna損傷的能力。這些發(fā)現(xiàn)與在我們的缺血再灌注和輻射誘導(dǎo)的組織損傷的鼠研究中的飲食整粒亞麻籽的抗細(xì)胞凋亡性能一致，并且表明sdg作為亞麻籽中可能的生物活性成分，介導(dǎo)組織中的保護(hù)性，抗凋亡作用。

因為ir降低了細(xì)胞環(huán)境中抗氧化劑酶的水平，所以通過抗氧化劑對細(xì)胞的預(yù)處理可能進(jìn)一步干擾ros，并且從而降低ros與生物分子相互作用的風(fēng)險。在前面的實例中，我們早先報道，用包含亞麻籽木脂素復(fù)合物的飲食預(yù)飼喂動物增加小鼠肺中保護(hù)性ii期抗氧化劑酶的水平。這些作用的假設(shè)機(jī)制涉及激活抗氧化劑應(yīng)答元件(are)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)。此外，nrf2還啟動負(fù)責(zé)保護(hù)免受氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的各種抗氧化劑酶的從頭合成。一些其他報告還表明多酚像姜黃素和egcg對氧化應(yīng)激發(fā)揮保護(hù)作用，這與它們誘導(dǎo)ii期抗氧化劑酶的能力有關(guān)。

從結(jié)果顯而易見，sdg減少鼠原代肺細(xì)胞中的細(xì)胞死亡，這是由于其抗氧化劑性能和對dna的保護(hù)作用。我們的發(fā)現(xiàn)證實了許(hseu)等人(食品和化學(xué)毒理學(xué)(foodchemtoxicol)2012,50:1245)的結(jié)果，其報道了鞣花酸，在石榴中發(fā)現(xiàn)的多酚，通過ho-1和nrf-2基因的上調(diào)來保護(hù)人角質(zhì)形成細(xì)胞免受uva誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。我們的研究提供了新穎的證據(jù)，sdg在抗擊ir誘導(dǎo)的氧化損傷和凋亡細(xì)胞死亡的輻射防護(hù)作用可能是通過直接誘導(dǎo)抗氧化劑防御系統(tǒng)。

總之，這些結(jié)果證實亞麻籽中的亞麻籽木脂素sdg具有有效的輻射防護(hù)性能，其可能有助于在動物研究中觀察到全谷物的保護(hù)作用。

實例3

開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)清除次氯酸離子：sdg保護(hù)基因組dna免受輻射的新穎機(jī)制

次氯酸(hocl)，一種有效的氧化劑，是由嗜中性粒細(xì)胞通過活化的髓過氧化物酶產(chǎn)生，該髓過氧化物酶催化生理存在的氯離子和過氧化氫(h2o2)之間的反應(yīng)。活化的嗜中性粒細(xì)胞產(chǎn)生h2o2和超氧化物陰離子o2·^-。在生理ph下，存在hocl和次氯酸根離子(clo^-)的混合物。hocl通過氧化損傷殺死微生物。然而，已知過量的生產(chǎn)會對組織造成損害。次氯酸鹽修飾腺嘌呤核苷酸導(dǎo)致氯胺的形成，這似乎是嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的毒性的主要機(jī)制。

hocl及其共軛堿clo^-已顯示出氧化氨基酸、肽、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，并氯化細(xì)胞dna和rna中的堿基。hocl/clo^-的反應(yīng)導(dǎo)致嘌呤和嘧啶核苷酸在鳥嘌呤和胸腺嘧啶的環(huán)內(nèi)-nh基團(tuán)以及鳥嘌呤、腺嘌呤和胞嘧啶衍生物的環(huán)外nh2基團(tuán)上的修飾，導(dǎo)致氯胺(如(rnhcl)和rr’ncl)的形成。發(fā)現(xiàn)主要修飾的堿基是在skm-1細(xì)胞的dna和rna中的5-氯胞嘧啶、8-氯腺嘌呤和8-氯鳥嘌呤。

眾所周知，γ-輻射能夠電離原子和分子。在生物系統(tǒng)中或在溶液中，電離輻射產(chǎn)生羥基自由基(·oh)，其被認(rèn)為是電離輻射誘導(dǎo)的對細(xì)胞組分(包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和dna)的損傷的來源。然而，這些高度不穩(wěn)定的自由基可被cl^-離子清除，這些cl^-離子以非常高的濃度存在于生理介質(zhì)中。這導(dǎo)致產(chǎn)生含活性氯的中間體，其中相對穩(wěn)定的clo^-是輻射衍生的毒物。在含氯化物的溶液中，clo^-和氧化性質(zhì)的其他活性氯衍生物形成為輻射分解的產(chǎn)物；它們可以有助于抑制有機(jī)體的生理功能。因此，我們建議輻射誘導(dǎo)的dna或蛋白質(zhì)損傷部分地通過輻射生成的clo^-來介導(dǎo)。

化學(xué)合成的sdg的兩種非對映異構(gòu)體最近已被證明在其抗氧化劑，自由基清除和dna保護(hù)性能方面是等效的。本研究使用高度新穎和特異性熒光探針評估在避免生物鹽水溶液中γ-輻射誘導(dǎo)產(chǎn)生的clo^-的dna輻射防護(hù)中的sdg。次氯酸鹽特異性3’-(p-氨基苯基)熒光素(apf)和羥基自由基-敏感的3’-(p-羥苯基)熒光素(hpf)提供用于確定上述活性氧簇(ros)的更大的特異性和再現(xiàn)性。

材料與方法

化學(xué)品

ros指示探針apf和hpf、質(zhì)粒dna(pbr322)和1kb加dna梯來自英杰公司(生命技術(shù)公司，卡爾斯拜德，加利福利亞州)。

確定次氯酸鹽

在次氯酸鹽存在下或在γ-輻射暴露后，在490nm/515nm的激發(fā)/發(fā)射下測量pbs中的ros探針apf和hpf的熒光。數(shù)據(jù)表示為相對熒光單位(rfu)。

通過確定?；撬崧劝乏?輻射誘導(dǎo)產(chǎn)生次氯酸鹽

使用tmb測定法確定?；撬岬穆然?。數(shù)據(jù)表示為?；撬崧劝?吸光度)以及clo^-濃度(μm)。

次氯酸鹽誘導(dǎo)對小牛胸腺和質(zhì)粒dna的損傷

在37℃下，用次氯酸鹽孵育小牛胸腺或質(zhì)粒dna2hr。使dna樣品進(jìn)行瓊脂糖(1％)凝膠電泳并且進(jìn)行分析。

次氯酸鹽誘導(dǎo)的2-氨基嘌呤(2-ap)氯化的確定

將pbs中的2-ap暴露于次氯酸鹽，并且在360-390nm之間記錄熒光光譜，在374nm下具有發(fā)射最大值。計算2-ap的變化％。

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

獲得的數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。使用邦弗朗尼校正用statview程序，使數(shù)據(jù)經(jīng)受單向方差分析(anova)與事后比較。p值≤0.05被認(rèn)為是有意義的。

結(jié)果

在這項研究中，我們調(diào)研sdg清除輻射誘導(dǎo)的clo^-的能力，作為在生理溶液中dna保護(hù)免受輻射暴露的潛在機(jī)制。

sdg清除次氯酸離子

使用次氯酸鈉評估所選擇的熒光探針的特異性。圖15a示出了隨著clo^-濃度(1-4μm)的增加apf熒光強度的線性增加。重要的是，hpf熒光強度僅略有增加，表明apf熒光主要是clo^-依賴性的。選擇clo^-劑量在后續(xù)實驗的該范圍內(nèi)。然后評估sdg(可商購的)通過sdg清除clo^-的能力。事實上，sdg劑量依賴性地降低clo^-(圖15b)。最后，我們評估了合成的sdg非對映異構(gòu)體sdg(s,s)和sdg(r,r)的clo^-清除效應(yīng)。在0.5μm下，sdg(r,r)和sdg(s,s)和sdg(商業(yè))清除clo^-(圖15c)，具有與類似于水飛薊賓(一種已建立的clo^-清除劑)的可比較的效力。

sdg清除γ-輻射誘導(dǎo)的次氯酸鹽

輻射劑量依賴性產(chǎn)生clo^-，如由apf的熒光強度的增加證明的。具體地，50gyγ-輻射誘導(dǎo)的apf和hpf(圖16a)，其通過sdg劑量依賴性地降低(圖16a和b)。apf熒光(1,816.30)的降低的初始斜率比hpf(695.75)高，表明sdg對clo^-的選擇性清除效應(yīng)(插入物，圖16a)。與hpf相比，sdg對apf的影響明顯更顯著(圖16b)。sdg鈍化來自輻射暴露(25和50gy)的clo^-生成，通過增加的apf(圖16c)和hpf(圖16d)熒光(p<0.05)顯示。apf/hpf的比率通過sdg降低，表明clo^-的選擇性清除。

當(dāng)氯化?；撬釙r，次氯酸鹽輻射劑量依賴性增加

為了建立輻射誘導(dǎo)clo^-氯化生物分子中的-nh基團(tuán)，我們評估了放射誘導(dǎo)的?；撬崧然＝Y(jié)果(圖16e)顯示在生理鹽水中，γ-輻射在50、100和200gy下顯著增加了牛磺酸氯胺形成，表明γ-輻射誘導(dǎo)clo^-產(chǎn)生，其依賴于氯化物濃度(圖16f)。結(jié)果提供了強有力的證據(jù)，輻射誘導(dǎo)clo^-在生理溶液中，能夠損害生物分子。

sdg保護(hù)次氯酸鹽誘導(dǎo)對小牛胸腺和質(zhì)粒dna的損傷

我們確定clo^-是否誘導(dǎo)對基因組(圖17a-d)和質(zhì)粒(圖17e-f)dna的損傷。實際上，clo^-誘導(dǎo)劑量依賴性dna片段化(圖17a，b)，同時低分子量片段增加。通過所有sdg鈍化對暴露于0.5mm次氯酸鹽1.0μm的基因組dna的損傷，至與槲皮素，已知的抗氧化劑和水飛薊賓，clo^-清除劑可比較的水平(圖17c，d)。類似地，通過sdg鈍化由clo^-對質(zhì)粒dna的損傷(圖17e，f)。具體來說，與在瓊脂糖凝膠電泳中具有不同遷移模式的、損壞的、開放螺旋的dna相比，我們評估超級螺旋(sc)質(zhì)粒dna的數(shù)量與oc(18.6％±9.4％)相比，以(25μm)存在的sdg減少了clo^-誘導(dǎo)的對質(zhì)粒dna的損傷，并保持大部分(81.3％±9.4％)dna處于超級螺旋形式。

sdg對次氯酸鹽誘導(dǎo)2-ap氯化的保護(hù)作用

為了確定clo^-對dna的損傷是否通過堿基修飾發(fā)生，我們評估了clo^-誘導(dǎo)的2-ap(一種嘌呤的熒光類似物)的氯化作用。以與通過輻射暴露(圖15a，16a，17a)產(chǎn)生的那些濃度的可比較濃度(10μm)給出的次氯酸鹽降低了2-ap熒光，該2-ap熒光通過用sdg預(yù)處理(60秒)來防止(圖18a和b)。最重要的是(圖18b和c)，如果在暴露于clo^-后+15、+30、+60、+120、+180或+300秒處添加，用sdg后處理導(dǎo)致從次氯酸鹽誘導(dǎo)的2-ap修飾顯著恢復(fù)。這些結(jié)果證實sdg對次氯酸鹽誘導(dǎo)的嘌呤堿基修飾的核堿基保護(hù)特征。

sdg對2-ap的γ-輻射誘導(dǎo)的氯化的保護(hù)作用

為了確定輻射是否誘導(dǎo)核堿基氯化，我們使用與上述相同的系統(tǒng)，即2-ap熒光(圖19a)。事實上，暴露于γ-輻射導(dǎo)致熒光強度的劑量依賴性降低(類似于在clo^-存在下的觀察(圖18a)，其通過sdg(圖19a和b)來防止)。這些結(jié)果證明γ-輻射誘導(dǎo)核堿基的氯化并且建立了sdg針對嘌呤堿基的這種輻射誘導(dǎo)修飾的保護(hù)性能。

sdg作用在預(yù)防或減輕通過輻射引起的核堿基氯化中的建議機(jī)制

關(guān)于n-氯化核堿基的恢復(fù)或預(yù)防的機(jī)制，我們建議或通過富電子芳環(huán)的雙電子還原n-cl分子或單電子還原，導(dǎo)致形成游離的n-根，其進(jìn)而從苯酚sdg部分中的-oh基團(tuán)捕獲氫原子。方案1(圖20)表明sdg保護(hù)作用的建議機(jī)制。我們目前的研究結(jié)果提供通過清除次氯酸離子并且保護(hù)免受輻射誘導(dǎo)的dna損傷的sdg的輻射防護(hù)作用的新機(jī)制的證據(jù)。

討論

這項研究的結(jié)果提供以下各項的證據(jù)：i)sdg，一種已知的木脂素抗氧化劑和自由基清除劑，通過化學(xué)方法以及通過輻射在生理溶液中產(chǎn)生的脫毒次氯酸離子；ii)sdg保護(hù)基因組dna以及來自次氯酸鹽誘導(dǎo)的損傷的質(zhì)粒dna；iii)sdg防御(從次氯酸鹽誘導(dǎo)的dna損傷中保護(hù)或恢復(fù))的機(jī)制涉及清除次氯酸鹽和再生來自氯胺(-ncl)的核堿基上的氨基(-nh)；iv)暴露于γ-輻射導(dǎo)致?；撬崧劝沸纬傻脑黾?；v)暴露于γ-輻射導(dǎo)致通過sdg防止的嘌呤堿的增加的氯化；vi)當(dāng)在暴露之前或之后添加時，sdg作用同樣有效地保護(hù)dna免受次氯酸鹽誘導(dǎo)的損傷，即它可以作為核堿基氯化的保護(hù)劑和/或緩和劑；vii)與商業(yè)的sdg、水飛薊賓和槲皮素(天然抗氧化劑黃酮類)相比，合成的sdg(s,s)和sdg(r,r)非對映異構(gòu)體在清除次氯酸離子并且防止次氯酸鹽誘導(dǎo)的dna損傷方面同樣有效。這些結(jié)果證實sdg對于次氯酸鹽誘導(dǎo)的核堿基修飾的保護(hù)和減輕性能。

使用胸部輻射損傷的小鼠模型，我們建立了全谷物飲食亞麻籽，富含木脂素多酚的谷物以及富含sdg的亞麻籽木脂素配制品的組織輻射防護(hù)作用。這些研究強調(diào)木質(zhì)素sdg對輻射誘導(dǎo)的體內(nèi)組織損傷的輻射防護(hù)和輻射減輕性能。提取、純化或合成亞麻籽sdg是體外以及體內(nèi)有效的抗氧化劑。為了探索sdg的治療潛力，我們通過新穎的化學(xué)反應(yīng)合成sdg，并通過評估其還原能力，金屬螯合潛力，和針對·oh自由基、過氧化自由基和dpph自由基的自由基清除活性來確定合成的sdg(r,r)和sdg(s,s)的抗氧化劑性能。我們還通過評估其預(yù)防γ-輻射誘導(dǎo)對質(zhì)粒dna(pbr322)和小牛胸腺dna的損傷的潛力，證明了合成的sdg(r,r)、sdg(s,s)非對映異構(gòu)體的輻射防護(hù)特征。

我們還表明，通過sdg的基因組dna的最大輻射防護(hù)已經(jīng)在約5.0μm濃度下實現(xiàn)，該濃度低于其自由基清除和抗氧化劑作用的ec50值，典型地在130-200μm的范圍內(nèi)。有趣的是，在本研究中確定的sdg在清除輻射誘導(dǎo)的次氯酸鹽中的最大有效性在0.5至5μm內(nèi)。這表明sdg的dna保護(hù)作用部分是由于清除了損傷性clo^-。顯示sdg對次氯酸鹽誘導(dǎo)的2-ap修飾的保護(hù)作用的結(jié)果表明，sdg通過防止次氯酸鹽誘導(dǎo)的對核堿基的損傷來保護(hù)dna。

hocl由活化的嗜中性粒細(xì)胞的髓過氧化物酶使用由nadph氧化酶和氯離子作為底物產(chǎn)生的過氧化氫產(chǎn)生。hocl可以氯化并氧化核堿基。由于hocl可氯化核堿基，因此這可能引起基因毒性。氯化核苷已經(jīng)被鑒定并與炎癥和癌癥相關(guān)。

可能存在若干種潛在的機(jī)制，通過這些機(jī)制sdg可以保護(hù)dna免受輻射誘導(dǎo)的損傷：1)通過清除引起核堿基的氯化和氧化的次氯酸根離子；2)通過清除通過與氯離子反應(yīng)產(chǎn)生次氯酸鹽的·oh自由基。我們觀察到在氯離子存在下在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中以及在單獨的鹽水(初步實驗)中，^·oh的產(chǎn)生急劇下降?？紤]到氯離子在體內(nèi)生理介質(zhì)中的高濃度，次氯酸鹽產(chǎn)生的顯著性和次氯酸鹽誘導(dǎo)的對包括dna的細(xì)胞組分的損傷將是輻射損傷的主要機(jī)制；3)通過與dna堿基對結(jié)合，作為若干黃酮類如lutiolin、山奈酚和槲皮素；4)通過阻斷相似嘌呤和嘧啶堿基，特別是c5、c6和c8上以及在脫氧核糖位點處質(zhì)子的抽取或·oh的添加。這些機(jī)制已被提出用于保護(hù)免受自由基誘導(dǎo)的dna損傷；5)最后，通過還原形成的氯胺，從而再生核酸中的內(nèi)部和外部氨基基團(tuán)。因此，sdg作為次氯酸離子的清除劑以及作為抗氧化劑和自由基清除劑以及來自次氯酸鹽誘導(dǎo)的氯化作用的核堿基的保護(hù)劑可以充當(dāng)dna輻射防護(hù)劑和輻射緩解劑。

次氯酸鹽以ph依賴的量作為次氯酸鹽陰離子(clo^-)，次氯酸(hclo)和游離氯(cl2)的混合物存在于溶液中。在生理ph下，clo^-和hclo是主要分子。與強的單電子氧化劑如^·oh相比，次氯酸鹽是一種雙電子氧化劑，比^·oh更少反應(yīng)性并且更具選擇性。次氯酸鹽可氯化富含電子的芳環(huán)和nh-化合物。它氧化伯醇和仲醇以及芐基亞甲基基團(tuán)和叔次甲基基團(tuán)和酚。上述反應(yīng)的第一步是氯化，然后水解/hcl消除。sdg包含所有上述反應(yīng)位點，除了使sdg分子成為強效次氯酸鹽清除劑的氨基。在方案1(圖20)中，我們提出了通過sdg使用核苷堿基的1-電子或2-電子還原的dna保護(hù)的新穎機(jī)制。

總之，我們已經(jīng)證明sdg清除次氯酸(clo^-)離子并防止輻射誘導(dǎo)的次氯酸鹽和dna損傷。由于已知次氯酸離子通過氯化/氧化修飾dna堿基，并且然后隨后導(dǎo)致dna損傷，因此我們的發(fā)現(xiàn)顯示sdg可用作與癌癥治療的放射治療或意外暴露于輻射相關(guān)的正常組織損傷的輻射防護(hù)劑。

實例4

亞麻籽及其木脂素保護(hù)免受苯并-α-芘的影響

亞麻籽、sdg和木脂素衍生物通過抑制多步致癌作用過程來減輕由煙草和其他環(huán)境致癌物造成的肺部腫瘤發(fā)生(圖21)。在該實例中，提供了實驗，表明在動物模型中,木脂素sdg具有通過調(diào)節(jié)nrf2調(diào)節(jié)的階段ii解毒通路和可能其他機(jī)制的化學(xué)預(yù)防活性。sdg的保護(hù)作用由直接ros清除和/或間接抗氧化/抗炎性能以及降低致癌物毒性和dna損傷來介導(dǎo)。

鼠上皮細(xì)胞暴露于煙草和環(huán)境致癌物苯并-α-芘(bap)誘導(dǎo)破壞性活性氧簇(ros)，如通過氧化還原敏感性熒光染料檢測的(圖23)。早在暴露于致癌物后2小時，熒光強度的強烈增加表明細(xì)胞中ros的產(chǎn)生。

為了證明sdg降低細(xì)胞中致癌物誘導(dǎo)的氧化性dna損傷，將sdg(10μm)添加至暴露于25μm的bap的人上皮細(xì)胞(a549)中，并使用質(zhì)譜法檢測對dna的氧化損傷，如8-氧代-7,8-二氫鳥嘌呤(8-氧代-dguo)的存在指示的。sdg在致癌物暴露后3和6小時減少dna損傷(圖22)。同樣，為了證明sdg防止ros從致癌物暴露中產(chǎn)生，將小鼠上皮細(xì)胞暴露于10或20μmbap和增加濃度的sdg(0、0.1、0.5、1、5μmsdg)，并在2小時后檢測ros。sdg清除有害ros至可忽略的水平(圖24)。

類似地，sdg防止暴露于bap的人上皮細(xì)胞中的基因毒性應(yīng)激。將細(xì)胞暴露于強致癌物如bap，誘導(dǎo)基因毒性應(yīng)激，如通過增加的p53蛋白水平所指示的(圖25)。這通過在5、10、25和50μm濃度下sdg的存在而減輕劑量依賴性。sdg還防止暴露于bap的人上皮細(xì)胞中的氧化性dna損傷。將細(xì)胞暴露于強致癌物如bap，誘導(dǎo)氧化性dna損傷，如通過增加的γ-h2ax(雙鏈dna斷裂的標(biāo)志物)的水平所指示的(圖26)。這通過在5、10、25和100μm濃度下sdg的存在而減輕劑量依賴性。此外，sdg防止暴露于bap的人上皮細(xì)胞中的dna加合物形成。將細(xì)胞暴露于強致癌物如bap誘導(dǎo)dna加合物的形成(圖27)。dna加合物是與致癌物共價連接的dna片段，并與惡性腫瘤的發(fā)展直接相關(guān)。dna加合物水平通過單獨或組合給予sdg或其代謝物ed和el的存在而降低。

亞麻籽及其木脂素在化學(xué)致癌物誘導(dǎo)的肺腫瘤的小鼠模型中提供保護(hù)。給小鼠(a/j菌株)以1mg/kg劑量經(jīng)腹膜內(nèi)注射4次煙草和環(huán)境致癌物bap(每周一次)(圖28)。小鼠在暴露時用亞麻籽或木脂素飲食開始。在暴露后在不同時間評估小鼠，以確定腫瘤負(fù)荷，小鼠重量和總體健康狀況。

亞麻籽降低小鼠中的腫瘤負(fù)荷：

圖29呈現(xiàn)了bap暴露和飲食亞麻籽給予后若干個月，鼠肺的代表性臨床圖像。圖30呈現(xiàn)了bap暴露和飲食亞麻籽給予后若干個月，鼠肺的代表性h&e應(yīng)變肺切片。來自喂食對照飲食(上圖)或亞麻籽(下圖)的小鼠的箭頭指示的結(jié)節(jié)在亞麻籽喂養(yǎng)的小鼠中顯示更小。每個小圖代表不同的動物。

使用針對整體腫瘤面積和結(jié)節(jié)大小(圖31a和b)的圖像分析軟件進(jìn)行形態(tài)學(xué)評估組織學(xué)鼠肺切片。在喂養(yǎng)亞麻籽飲食的小鼠中，腫瘤占據(jù)的肺面積顯著減少(p<0.03)。類似地，存在更小腫瘤結(jié)節(jié)尺寸的趨勢。針對每個肺的腫瘤結(jié)節(jié)的總數(shù)(圖32a)和侵襲肺的腫瘤％(圖32b)，還將組織學(xué)鼠肺切片進(jìn)行了形態(tài)學(xué)評估。每個肺存在更少的腫瘤結(jié)節(jié)的趨勢(a)并且在亞麻籽補充劑下更少的腫瘤侵入的趨勢(b)。

最后，亞麻籽補充劑顯示防止來自由bap誘導(dǎo)的肺癌的耗散效應(yīng)。在bap暴露后縱向測量動物重量200天。飼喂亞麻籽飲食的小鼠暴露于bap下，顯示比當(dāng)對照飲食時暴露于bap的小鼠顯示更高的重量(圖33)。

實例5

亞麻籽及其木脂素保護(hù)細(xì)胞和組織免受石棉誘導(dǎo)的損傷

介紹

惡性間皮瘤(mm)是一種毀滅性的，疼痛的和致死型的癌癥，沒有療法和治療的現(xiàn)實機(jī)會。mm的發(fā)展與暴露至石棉纖維直接相關(guān)。最近的研究表明，石棉誘導(dǎo)的癌癥的發(fā)病機(jī)理是由于通過持續(xù)石棉纖維造成的慢性炎癥和氧化組織損傷。全粒亞麻籽(fs)具有已知的抗氧化劑，抗炎和癌癥化學(xué)預(yù)防性能。在該實例中，在nf2^+/mut；cdkn2a^+/mut小鼠中測試了fs及其富含在飲食中給出的木脂素開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)的木脂素組分(flc)防止急性石棉誘導(dǎo)的炎癥和炎癥細(xì)胞因子釋放的能力。

材料和方法

小鼠飲食和石棉暴露

在嚙齒動物食物中給出了fs和其富含木脂素開環(huán)異落葉松脂素二葡糖苷(sdg)的木脂素組分(flc)。將小鼠(nf2^+/mut；cdkn2a^+/mut)在單次ip推注400mg青石棉石棉后一天(+1)或前一天(-1)置于10％fs或10％flc補充劑飲食上，并且評估3天后腹部炎癥和促炎細(xì)胞因子釋放(參見圖34)。選擇nf2小鼠品系，因為當(dāng)暴露于石棉時其形成mm的加速形式。

組織收獲和分析

使用液相色譜，串聯(lián)質(zhì)譜(lc/ms/ms)，評估亞麻籽木脂素代謝物(如哺乳動物木脂素腸內(nèi)酯(el)和腸二醇(ed))的系統(tǒng)水平(即，血漿)，以確保fs被該小鼠品系的腸道菌群有效代謝，并且水平與其他小鼠模型中的那些可比較。

使用pbs進(jìn)行腹部灌洗，并使用細(xì)胞離心涂片分析確定巨噬細(xì)胞(mf)和嗜中性粒細(xì)胞(pmn)的水平。

討論

使用液相色譜，串聯(lián)質(zhì)譜(lc/ms/ms)，評估亞麻籽木脂素代謝物(如哺乳動物木脂素腸內(nèi)酯(el)和腸二醇(ed))的系統(tǒng)水平(即，血漿)，以確保fs被該小鼠品系的腸道菌群有效代謝，并且水平與其他小鼠模型中的那些可比較(圖37)。巨噬細(xì)胞(mf)和嗜中性粒細(xì)胞(pmn)的腹部灌洗水平表明fs和flc都鈍化由石棉誘導(dǎo)的急性腹部炎癥(圖36和38)。此外，促炎細(xì)胞因子tnf-α和il-1β的水平也通過飲食劑降低(圖37和38)。

結(jié)論：這些發(fā)現(xiàn)表明亞麻籽及其木脂素組分的化學(xué)預(yù)防性能延伸到保護(hù)免受石棉誘導(dǎo)的組織和細(xì)胞損傷。亞麻籽因此可以用作惡性間皮瘤的化學(xué)預(yù)防中的飲食劑。

實例6

體內(nèi)sdg給予的優(yōu)化劑量和動力學(xué)

在本實例中，在通過口服灌胃以水溶性形式給予sdg的小鼠中，呈現(xiàn)了關(guān)于藥物代謝動力學(xué)、生物利用度、和劑量應(yīng)答的數(shù)據(jù)。

劑量研究：向小鼠口服給予5、25、50和100mg/kg體重的sdg劑量(n＝5/劑量)，并且4小時后收集組織用于分析。通過液相色譜和質(zhì)譜分析sdg及其生物活性代謝物ed、el和seco的血漿濃度，并以ng/ml表示(圖39)，而nrf2調(diào)節(jié)的抗氧化劑酶(aoe)(sdg及其代謝物的細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo))的基因表達(dá)水平，使用qrt-pcr從相同動物的肺組織中進(jìn)行確定(圖40)。ho1、nqo1和gst的基因表達(dá)水平增加2-3倍，以少至5mgsdg/kg，并且相對于基線達(dá)到平均6倍的增加，以100mg/kgsdg?；蛩接煞谓M織中蛋白質(zhì)水平的更低但仍顯著增加支持。

藥代動力學(xué)研究：在選擇100mg/kg劑量作為誘導(dǎo)顯著的aoe表達(dá)，同時允許在循環(huán)中檢測sdg的劑量后，進(jìn)行藥代動力學(xué)研究以確定靶組織(即，肺)中的生物利用度和生物效應(yīng)。在15min、30min、和1、2、4、6、8、12小時收集血液樣品以及組織(肺、腦、肝、腎、脾)。如上在血漿和肺中確定sdg水平(圖41)。單次劑量100mgsdg/kg被良好吸收，并且在循環(huán)中在給予后長達(dá)6小時(圖41a)和沖洗的、無血的肺組織中持續(xù)4小時可檢測到完整的sdg(圖41b)。sdg的血漿和肺組織濃度分別在給予后30分鐘達(dá)到0.8和12.6μm的水平。值得注意的是，代表性的aoe基因表達(dá)水平(ho-1、nqo1、gst)的強烈誘導(dǎo)顯著升高(p<0.05)超過基線(圖41c)。觀察到的基因表達(dá)增加與通過蛋白質(zhì)印跡確定的蛋白質(zhì)水平的增加相關(guān)(未顯示)。重要的是，以相同劑量給予每日兩次的sdg持續(xù)7天顯示無不耐受性也無毒性。這些數(shù)據(jù)表明，通過這種可溶性sdg形式可以獲得顯著的生物利用度和效率。因此，大大促進(jìn)了sdg在人類治療中的用途，并且不太可能發(fā)生毒性風(fēng)險。因此，50-100mg/kg(每天1或2mgsdg)的劑量足以在靶組織中誘導(dǎo)預(yù)期的保護(hù)作用，并且可用于進(jìn)一步研究。

實例7

在nrf2缺陷小鼠中bap誘導(dǎo)的肺腫瘤發(fā)生中的sdg對致癌作用的起始或促進(jìn)階段的影響。

來自肺損傷模型的數(shù)據(jù)顯示，fs和fs衍生的sdg在飲食中可以上調(diào)肺中的nrf2和nrf2激活的基因和蛋白質(zhì)。在本實例中，使用nrf2敲除小鼠，測試了這種途徑的活化是sdg的化學(xué)預(yù)防效應(yīng)的重要機(jī)制的假說，并且確定sdg在致癌作用的起始和促進(jìn)階段是否具有活性。

sdg在nrf2缺陷小鼠中的作用。

在這些實驗中，將野生型a/j小鼠中在bap誘導(dǎo)的肺癌模型中口服給予的合成sdg的作用與在a/j背景(目前保持在我們的動物設(shè)施處的集群)上回交的nrf2缺陷小鼠進(jìn)行比較。簡言之，對一組野生型(wt)小鼠和一組敲除(ko)小鼠喂食對照飲食。一組wt小鼠和一組ko小鼠通過其飲用水給予sdg，以達(dá)到50和100mg/kg的每日sdg消耗(以測試在抑制肺癌發(fā)展中劑量應(yīng)答關(guān)系)，如圖42a中所示。sdg給藥研究和動力學(xué)確定sdg應(yīng)當(dāng)給予持續(xù)至少幾天，因為這被確定為飲食在組織中達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)所需的最小時間，隨后4次每周注射i.p.給予的1mg/小鼠苯并[a]芘(bap)?？诜?口服灌胃或在飲用水中)50和100mg/kgsdg均可誘導(dǎo)肺中的期酶表達(dá)(參見圖41)。在4、6和9個月處死小鼠(參見圖42b)，并且收獲肺組織，用于：a)腫瘤負(fù)荷的組織學(xué)評估和通過圖像分析進(jìn)行定量，b)nrf2調(diào)節(jié)的aoe表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡檢測和氧化應(yīng)激，c)在小鼠組織和尿中的8-氧代-7,8-二氫-2’-脫氧鳥苷(8-氧代dguo)水平，和d)dna加合物形成。使用以下各項評估小鼠的亞組的肺炎癥：a)支氣管肺泡灌洗，和b)使用分別針對cd11b/ly6g、cd11b/f4/80、和抗-cd3的抗體對炎性細(xì)胞(如嗜中性粒細(xì)胞、活化的巨噬細(xì)胞和t細(xì)胞)的facs分析。

統(tǒng)計：為了達(dá)到統(tǒng)計顯著性每組需要的并且建議20只小鼠/組的小鼠的最小數(shù)量。

分析：如上所述(圖29和31)，在獲得50和100mg/kgsdg的wt小鼠中預(yù)期腫瘤的數(shù)量和大小的減少，然而在100mg/kg劑量的情況下，結(jié)果更深刻(更少的腫瘤)。在與對照飲食的wt小鼠相比時，由于喪失了使bap解毒的能力，預(yù)期在獲得對照(無藥物)的nrf2ko小鼠中更高數(shù)量的腫瘤。然而，預(yù)期在接受sdg的nfr2ko小鼠中沒有腫瘤減少(與ko小鼠沒有藥物相比)，因為sdg的主要作用是通過nrf2激活介導(dǎo)的。在nrf2/sdg小鼠的腫瘤負(fù)荷中觀察到的任何減少都?xì)w因于也有貢獻(xiàn)的其他機(jī)制，如sdg的直接自由基清除效應(yīng)，其應(yīng)通過測量氧化應(yīng)激的標(biāo)志物來檢測。

sdg和nrf2激活在致癌作用的起始和/或促進(jìn)階段中的作用。

預(yù)期上述數(shù)據(jù)將提供關(guān)于在bap的起始和促進(jìn)階段期間的sdg給予的明確機(jī)械的數(shù)據(jù)。還感興趣的是確定在剛剛起始階段(圖42a，計劃b)期間或在剛剛促進(jìn)階段期間(圖42a，計劃c)的sdg補充劑的功效。因此，使用這些不同的進(jìn)食計劃在野生型a/j小鼠中進(jìn)行此圖解中概述的實驗。

分析：在促進(jìn)或起始期間給予sdg時，預(yù)期腫瘤數(shù)量和大小減少。如上所述在nrf2ko小鼠中重復(fù)研究，以定義ii期酶上調(diào)對該活性的貢獻(xiàn)。最近已報道nrf2在致癌作用期間具有兩個作用，其中一個在腫瘤起始期間是預(yù)防的，并且第二個是促進(jìn)惡性進(jìn)展。這些發(fā)現(xiàn)表明使用nrf2預(yù)防肺癌的惡性進(jìn)展，而nrf2激活劑更適合于肺癌預(yù)防。預(yù)期sdg作為化學(xué)預(yù)防劑是有效的。盡管nrf2在sdg的抗癌作用中起作用，但是可能還涉及其他機(jī)制或甚至更重要，如全身流體(血液)或肺組織中mirna的調(diào)節(jié)。

向吸煙者給予sdg補充劑對氧化應(yīng)激的全身和肺特異性生物標(biāo)志物的影響。

設(shè)計了具有遺傳和生化終點的sdg的口服給予的臨床研究，這些終點是遺傳和生化的。

所選人群：第一組將由從未吸煙的正常健康志愿者組成。該組允許評估感興趣的基因和氧化性生物標(biāo)志物的真實基線水平(可能低)，以便評估在“非刺激”環(huán)境中由sdg補充劑誘導(dǎo)的變化。第二組受試者將由目前主動的吸煙者組成。選擇該組是因為：i)它們處于活動性癌癥初始的高風(fēng)險中并且是化學(xué)預(yù)防試驗中的潛在受試者，并且ii)先前已經(jīng)顯示吸煙誘導(dǎo)在呼吸上皮中的其自身基因組改變，以及活性氧化應(yīng)激。該組允許吸煙者中的基因組和氧化應(yīng)激標(biāo)志物的作圖，并且以確定在已經(jīng)“活化的”環(huán)境中由sdg誘導(dǎo)的什么基因組改變。該組還允許在該高風(fēng)險群體中通過sdg確定升高的氧化應(yīng)激標(biāo)志物的減少。選擇交叉設(shè)計，其中每個患者還將攝入在明膠膠囊劑中給予的安慰劑對照和sdg補充劑(參見圖43)。

劑量：選擇商業(yè)配制品(brevail^tm)以避免在不同批次的原或研磨的亞麻籽觀的情況下察到的sdg含量和生物利用度的顯著變異性?？商娲?，將使用合成的sdg如米什拉(mishra)等人，生物有機(jī)化學(xué)與醫(yī)藥化學(xué)通訊(bioorganic&medicinalchemistryletters)2013,(19):5325所述的合成的sdg。藥理研究表明，每天給藥包含50mg的sdg的這種配制品產(chǎn)生與病例對照研究中癌癥發(fā)病率的降低相關(guān)的最高五分位數(shù)中發(fā)現(xiàn)的enl水平類似的enl水平(中值，63nmol/l)。

臨床研究：該研究將是一個單中心，隨機(jī)，雙盲，兩期交叉試驗。將存在兩個3周的治療期，其間穿插有一個月的清除期(圖43)。交叉設(shè)計的原理是受試者中的治療的比較從比較中去除任何“主體效應(yīng)”，并提高研究的效率和效能。將二十(20)名健康志愿者(10名吸煙者和10名終身不吸煙者)隨機(jī)化來攝取以下各項，按次序，或者是每天50mgsdg(一個膠囊劑brevail^tm或合成sdg)持續(xù)3周，隨后1個月的清除期并且然后安慰劑(由相同提供者(木質(zhì)素研究，圣迭哥，加利福尼亞州)提供的沒有sdg的膠囊劑)再持續(xù)3周，或者是安慰劑持續(xù)3周，一個月的清除，并且然后50mgsdg持續(xù)3周。在基線和第2、3、7、9和10周獲得口腔上皮(通過口腔拭子獲得)、呼氣冷凝液、尿和血液。主動吸煙狀態(tài)將通過尿液可替寧測定來確認(rèn)。該研究將由佩恩(penn)機(jī)構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)，并且所有參與者將提供書面知情同意書。將在基線處給予包括綜合吸煙史和環(huán)境煙草暴露(ets)的詳細(xì)問卷。參加者將每周參加，用于評估副作用，遵守測試劑攝取，收集間歇的煙草和藥物使用的數(shù)據(jù)以及樣品收集。

統(tǒng)計原理/效能分析：感興趣的主要比較是尿氧化應(yīng)激的變化，如通過尿8-氧代-7,8-二氫-2’-脫氧鳥苷(8-氧代-dguo)，呼氣冷凝液的變化(探索性)，以及在sdg治療后研究受試者的頰上皮中基因表達(dá)水平的變化所測量的。預(yù)期20名患者為這項探索性研究提供合理的效能。由于本研究的性能，校正不適用于多重比較。本研究被設(shè)計來獲得sdg補充劑的效果的評估。還要注意，存在有限的效能來測試遺留效應(yīng)，但4周的清除期應(yīng)避免這些關(guān)注點。

口服sdg攝入后頰拭子上皮細(xì)胞中基因表達(dá)變化的評估

在這些實驗中，使用頰粘膜上皮細(xì)胞作為支氣管上皮組織的替代組織。這類細(xì)胞比需要侵入性支氣管鏡檢查的支氣管上皮細(xì)胞更容易獲得(即，通過使用簡單的頰擦拭)。這種方法在人類中的有效性由以下證據(jù)支持，頰上皮可以作為基因陣列研究中氣道支氣管組織的替代組織。

這種方法進(jìn)一步使用小鼠中所攝入的fs進(jìn)行驗證。在對照或10％fs飲食喂養(yǎng)小鼠三周后，收獲一定范圍的組織，并通過免疫印跡分析兩種代表性nrf-2誘導(dǎo)蛋白(ho-1和nqo1)的表達(dá)。觀察到肺和肝臟中這些標(biāo)志物的顯著增加(數(shù)據(jù)未顯示)。重要的是，觀察到兩種蛋白質(zhì)的鼻上皮的明顯可檢測的增加(圖44)，因此驗證鼻咽組織也可以用作肺的替代物。在人類中也有一些可行性數(shù)據(jù)支持這種方法。對2名正常志愿者給予整粒fs(每日40g)持續(xù)一周。取頰拭子，成功提取rna，并且制備cdna。測量nrf2依賴性基因ho-1的相對表達(dá)水平。如圖45中所示，ho-1mrna表達(dá)在一個受試者中增加了34％，在第二個中增加了63％(p<0.05)。這些數(shù)據(jù)表明這種方法是可行的，并且fs和sdg促進(jìn)正常健康志愿者中的nrf2依賴基因。

在試驗中，在基線和在纖維對照和fs飲食的2和4周后，在對照和吸煙受試者中取頰拭子。如上產(chǎn)生mrna和cdna，并且使經(jīng)受rt-pcr以評估代表性抗氧化劑和ii期藥物代謝酶的相對表達(dá)水平，這些酶包括nqo-1、ho-1和谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(gst)。除了是nrf2誘導(dǎo)酶的“經(jīng)典”代表之外，所選擇的酶也可以發(fā)揮重要的機(jī)械作用。nqo1在煙草煙霧中存在的促致癌物的解毒和活化中起雙重作用。nqo1的變體基因型與日本受試者中肺癌風(fēng)險降低顯著相關(guān)。在遺傳研究中，ho-1也被認(rèn)為是針對香煙煙霧中的氧化劑和芳香烴的細(xì)胞保護(hù)劑。因此，ho-1也代表了用于監(jiān)測亞麻籽效應(yīng)的重要生物標(biāo)志物。許多研究已經(jīng)顯示gst多態(tài)性，吸煙和肺癌之間的關(guān)系。重要的是，肺細(xì)胞中苯并[a]芘衍生的dna加合物通過由細(xì)胞色素p-450-和醛酮還原酶介導(dǎo)的代謝產(chǎn)生的反應(yīng)性中間體的解毒通過肺特異性gst來調(diào)節(jié)。由于苯并[a]芘是一種重要的肺致癌物，并且它存在于煙草煙霧中，在吸煙者中g(shù)st被監(jiān)測為亞麻籽的作用的生物標(biāo)志物。

數(shù)據(jù)分析：使源自5個正常的非吸煙志愿者的頰拭子的大量cdna庫用作所有分析的“基線”比較器。使用β-肌動蛋白和gapdh將來自所有試驗樣品的cdna標(biāo)準(zhǔn)化至該庫。一旦標(biāo)準(zhǔn)化，將每個研究樣品與基線比較器進(jìn)行比較，并計算百分比或倍數(shù)變化。主要分析是比較在從不吸煙者和當(dāng)前吸煙者中sdg攝取的3周之前和之后的基因表達(dá)的變化(使用配對t檢驗)。還將這些值與其安慰劑對照樣品中的值進(jìn)行比較。另外的分析將所有時間點的表達(dá)變化與sdg進(jìn)行比較，包括沖洗值(重復(fù)測量anova)，以及在基線和sdg和安慰劑之后非吸煙者和吸煙者之間的比較。比較2與3周數(shù)據(jù)和3周與沖洗數(shù)據(jù)以建立應(yīng)答的動力學(xué)。

確定同一患者群體中通過sdg的氧化應(yīng)激的降低

雖然難以測量人類受試者的氧化應(yīng)激，但最成熟的方法之一是測量isop的尿水平。已經(jīng)開發(fā)了用于這種標(biāo)志物的可靠和可重復(fù)的測定。數(shù)據(jù)獲自等待肺移植的患者，該患者攝取40gfs長達(dá)13周。發(fā)現(xiàn)在fs時，尿isop穩(wěn)定下降，表明氧化應(yīng)激的全身降低(一些isop亞類降低至fs前水平的26％)。代表性患者的數(shù)據(jù)顯示在圖46中。bap，香煙煙霧中的致癌物，引起活性氧簇介導(dǎo)的dna鏈斷裂和8-氧代-7,8-二氫-2'-脫氧鳥苷(8-氧代-dguo)形成?？梢允褂胠c-mrm/ms在生物樣品(尿、肝、肺)中檢測8-氧代-dguo。來自2名人類志愿者的數(shù)據(jù)表明，每日消耗40gfs持續(xù)3周誘導(dǎo)8-氧代-dguo減少的趨勢，在同樣飲食的肺移植患者(n＝5)中也觀察到趨勢(圖47)。

試驗：在試驗中，在對照和吸煙受試者中在多個時間點采集尿液樣品。以盲法方式測量尿液的isop和8-氧代-dguo的水平。

用于評估肺氧化應(yīng)激的呼氣冷凝液：考慮到在這些受試者中進(jìn)行侵入性測試像支氣管鏡檢查是不可行的，使用一種非侵入性樣品收集技術(shù)，呼氣冷凝液(ebc)用于調(diào)研肺氧化劑應(yīng)激。在呼氣中發(fā)現(xiàn)許多物質(zhì)，這些物質(zhì)在通過冷卻(即，冷凝)可獲得的液體中是可檢測的。這種方法的優(yōu)點是它作為實時分析和評估肺中氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物的非侵入性采樣方法是非侵入性的并且是方便的。氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物包括：h2o2、異前列烷(isop)、丙二醛、4-羥基-2-壬烯醛、抗氧化劑、谷胱甘肽和亞硝化應(yīng)激標(biāo)志物。ebc中的異前列烷水平被評估為用于研究fs對肺氧化應(yīng)激的作用的有用的非侵入性方法。從對照受試者和吸煙者收集的ebc來測量8-isop。非吸煙者的水平一致低-接近測試的靈敏度(1.2pg/ml+/-0.6，n＝8)，表明ebc在非吸煙者中沒有用。雖然只有四個吸煙者測量水平，有趣的是，這些受試者中的兩個具有高得多的水平：16pg/ml和6.5pg/ml。因此，在那些具有高基線水平的吸煙者中，ebc用于跟蹤肺特異性氧化應(yīng)激。

數(shù)據(jù)分析。確定每個受試者的基線值，并且使用配對t檢驗評估在治療結(jié)束時(3周)觀察到的變化。另外的分析將所有時間點的表達(dá)變化與sdg進(jìn)行比較，包括沖洗值(重復(fù)測量anova)，以及在基線和sdg之后非吸煙者和吸煙者之間的比較。我們可以比較2與3周數(shù)據(jù)和3周與沖洗數(shù)據(jù)以建立應(yīng)答的動力學(xué)。

亞麻籽木脂素(sdg)的化學(xué)預(yù)防性能

在這些實驗中，測試了類似于蘿卜硫素的sdg可以降低異生物質(zhì)的毒性并且解毒致癌物(如bap)的假說。首先，評估sdg對支氣管上皮細(xì)胞的體外作用。針對下述所有sdg劑量進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗，如mtt測定。第二，評估在bap小鼠模型中口服給予的sdg。

評估在正常小鼠和人原發(fā)性肺上皮細(xì)胞中sdg介導(dǎo)的bap解毒作用和nrf2介導(dǎo)的ii期酶表達(dá)的誘導(dǎo)。

當(dāng)由上皮細(xì)胞代謝激活時，bap(10或20μm)以劑量和時間依賴性方式誘導(dǎo)ros(圖23)。針對小鼠研究，使用永生化的c10小鼠支氣管細(xì)胞系(來源于balb/c小鼠)，假定這些細(xì)胞是非致瘤性的，接觸抑制的，并且包含所有被研究的nrf2調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)。使用a549細(xì)胞進(jìn)行類似的研究(用于模擬人類1型肺泡上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的但高度分化的肺癌細(xì)胞系-參見圖22-23中的數(shù)據(jù))并且重要的是原代人支氣管上皮細(xì)胞。

為了評估直接的ros攔截，將一系列臨床相關(guān)的sdg濃縮物(0.1-10μm)與10μmb[a]p同時加入，并且測量代表直接抗氧化活性的h2dcf熒光的減少。液相色譜/多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜(lc/mrm-ms)也用于確定gssg:gsh比率。bap還可以快速誘導(dǎo)dna加合物形成，該形成可以使用lc-mrm/ms進(jìn)行測量(圖22)。由bap引起的bap誘導(dǎo)的氧化性dna損傷可以通過8-氧代-dguo形成，使用標(biāo)準(zhǔn)comet圖像分析的單個細(xì)胞的尾力矩(數(shù)據(jù)未顯示)，或用于檢測γh2ax的免疫印跡的密度計量分析(數(shù)據(jù)未顯示)來測量。為了評估dna加合物和氧化變化，將一些列sdg濃縮物與10μmb[a]p同時添加，并且測量這些參數(shù)。此外，進(jìn)行mtt細(xì)胞毒性測定以評估在致癌物不存在和存在下對這些細(xì)胞的直接sdg效應(yīng)(fs和flc只能在體內(nèi)測試)。接下來，測試純化的sdg上調(diào)支氣管上皮細(xì)胞中的ii期酶的能力。具體地，測量用木脂素sdg(0.1-10μm)處理孵育0、1、2、4、24、48和72小時后的gst-ya和nqo-1信息和蛋白的誘導(dǎo)。這些酶被選擇作為ii期系統(tǒng)的特征代表性are調(diào)節(jié)酶。進(jìn)行rt-pcr和免疫印跡分析。在鑒定ii期酶上調(diào)的時間過程后，用sdg預(yù)處理上皮細(xì)胞，并在最大ii期誘導(dǎo)的時間點添加bap。使用上述測定評估氧化應(yīng)激，dna損傷和細(xì)胞死亡。

數(shù)據(jù)分析，預(yù)期結(jié)果和其他研究：第一組研究定義了sdg的直接抗氧化劑作用。在sdg自身消失(因此沒有直接的抗氧化劑效應(yīng)存在)的稍后時間點進(jìn)行的第二組研究，定義了sdg由于其ii期酶誘導(dǎo)效應(yīng)的影響。進(jìn)行氧化應(yīng)激和炎癥的另外的測量以確定通過sdg血漿氧化應(yīng)激測量(血漿丙二醛)和促炎應(yīng)激標(biāo)志物(如il-6、il-1α、il1β、tnf-α、c反應(yīng)蛋白)的減少。

在a/j小鼠-化學(xué)致癌物誘導(dǎo)肺腫瘤發(fā)生的鼠模型中，sdg的化學(xué)預(yù)防性能。

在上述相同的研究設(shè)計之后，在a/j小鼠肺中研究口服給予的sdg對bap誘導(dǎo)的致癌作用的進(jìn)展的影響(圖42a，計劃a)。將sdg補充的小鼠與對照直接比較。進(jìn)行的后續(xù)研究包括：僅在起始階段使用sdg的研究(圖42a，計劃b)和僅在促進(jìn)階段使用sdg的研究(圖22a，計劃c)。

統(tǒng)計：動物研究通常包含多于20只小鼠的兩組(例如，對照與50mg/kgsdg)，并且使用anova或其他合適的線性模型進(jìn)行分析。所有計算假設(shè)為雙側(cè)檢驗，α水平為0.05，并且檢驗力至少為80％。

表1：將在3個實驗計劃(參見圖42a：計劃a、b、c)上放置的3個測試組的小鼠在4、6和9個月(3個時間點)處死，即，3×3×3×20個小鼠＝540個小鼠。

實例8

sdg對石棉誘導(dǎo)的致癌作用的影響。

sdg或亞麻籽飲食被假設(shè)為減少石棉誘導(dǎo)的ros/炎癥，導(dǎo)致：1)ros，2)減少細(xì)胞因子；3)減少hmgb1；4)更少的腫瘤發(fā)生病灶；和5)更少的腫瘤。下劃線假說是減少的炎癥和氧化應(yīng)激將導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化減少和更少的腫瘤負(fù)荷(參見圖48)。

為了測試亞麻籽木脂素sdg將減少石棉誘導(dǎo)的炎癥以及氧化和亞硝化應(yīng)激的假設(shè)，將小鼠腹膜巨噬細(xì)胞暴露于不同濃度的青石棉石棉纖維(10、20、30、和40ng/cm²)。在石棉暴露(3、4、6和8小時)后的可變時間處，將細(xì)胞用sdg(50μm)孵育，并且24小時后收集上清液以檢測炎癥細(xì)胞因子分泌和亞硝化/氧化應(yīng)激(圖49)。

sdg在體外通過人類間皮細(xì)胞鈍化石棉誘導(dǎo)的ros分泌(圖50)。檢測細(xì)胞中石棉誘導(dǎo)的ros的實驗計劃：(人間皮細(xì)胞)hm細(xì)胞或小鼠巨噬細(xì)胞在20％dmem中接種24小時；在hbss中添加20μmdcf持續(xù)1小時；用包含h2o2(100μm)，石棉(10μg青石棉/cm²)和/或sdg(50μm)的1％dmem替代上清液；并且在開始石棉暴露后監(jiān)測熒光水平長達(dá)36小時。結(jié)果表明，石棉和h2o2誘導(dǎo)高水平的ros，然而在介質(zhì)中添加sdg顯著降低ros水平至基線水平(圖50)。

評估培養(yǎng)物raw巨噬細(xì)胞中的石棉誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激(ros釋放)。將細(xì)胞用ros敏感染料h2dcfda處理30min，并且然后將它們暴露于載體至40μg/cm2石棉纖維或4um次氯酸鹽溶液，并用分光光度法測量熒光強度持續(xù)90、150分鐘和27小時。石棉誘導(dǎo)的ros在石棉暴露后不久產(chǎn)生，并在觀察期間持續(xù)(圖51)。

在暴露于石棉后幾小時向巨噬細(xì)胞給予sdg降低氧化應(yīng)激(圖52)。雌性c57/bl6小鼠注射2ml巰基乙酸鹽，并且3天后收獲腹膜巨噬細(xì)胞。將2百萬個細(xì)胞/孔接種在6孔板中并暴露于20μg/cm²石棉。在石棉暴露后3、4、6或8小時用25或50μmsdg(合成sdg)處理細(xì)胞。在石棉暴露后24小時收獲細(xì)胞。對冷凍上清液樣品進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，丙二醛，脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物，隨著時間的推移隨著石棉暴露而增加(圖52a)。在將25和50μmsdg添加稻細(xì)胞中的情況下，mda的水平顯著降低(p<0.05)(圖52b)。

暴露于石棉后若干小時向巨噬細(xì)胞給予的sdg減少亞硝酸應(yīng)激(圖53)。為了評估在石棉暴露后細(xì)胞中的鈍化亞硝化應(yīng)激中的sdg，向雌性c57/bl6小鼠注射2ml巰基乙酸鹽并且在3天后收獲的腹膜巨噬細(xì)胞。將2百萬個細(xì)胞/孔接種在6孔板中并暴露于20μg/cm²石棉。在石棉暴露后3、4、6或8小時用25或50μmsdg(合成sdg)處理細(xì)胞。在石棉暴露后24小時收獲細(xì)胞。對冷凍上清液樣品進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，亞硝酸鹽，亞硝化應(yīng)激的標(biāo)志物，隨著時間的推移隨著石棉暴露而增加(圖53a)。在將25和50μmsdg添加稻細(xì)胞中的情況下，mda的水平顯著降低(p<0.05)(圖53b)。

暴露于石棉后若干小時向巨噬細(xì)胞給予的sdg減少炎癥細(xì)胞因子分泌(il-1β)(圖54)。為了評估在石棉暴露后細(xì)胞中鈍性炎癥細(xì)胞因子分泌(il-1β)中的sdg，向雌性c57/bl6小鼠注射2ml巰基乙酸鹽和在3天后收獲的腹膜巨噬細(xì)胞。將2百萬個細(xì)胞/孔接種在6孔板中并暴露于20μg/cm²石棉。在石棉暴露后3、4、6或8小時用25或50μmsdg(合成sdg)處理細(xì)胞。在石棉暴露后24小時收獲細(xì)胞。對新鮮上清液樣品進(jìn)行分析。結(jié)果顯示il-1β，促炎細(xì)胞因子，隨著時間的推移隨著石棉暴露而增加(圖54a)。在將25和50μmsdg添加稻細(xì)胞中的情況下，il1β的水平顯著降低(p<0.05)(圖54b)。

暴露于石棉后若干小時向巨噬細(xì)胞給予的sdg減少炎癥細(xì)胞因子分泌(tnf-α)(圖55)。為了評估在石棉暴露后細(xì)胞中鈍性炎癥細(xì)胞因子分泌(tnf-α)中的sdg，向雌性c57/bl6小鼠注射2ml巰基乙酸鹽和在3天后收獲的腹膜巨噬細(xì)胞。將2百萬個細(xì)胞/孔接種在6孔板中并暴露于20μg/cm²石棉。在石棉暴露后3、4、6或8小時用25或50μmsdg(合成sdg)處理細(xì)胞。在石棉暴露后24小時收獲細(xì)胞。對新鮮上清液樣品進(jìn)行分析。結(jié)果顯示tnf-α，促炎細(xì)胞因子，隨著時間的推移隨著石棉暴露而增加(圖55a)。在將25和50μmsdg添加稻細(xì)胞中的情況下，tnf-α的水平顯著降低(p<0.05)(圖55b)。

簡言之，本實例中的體外實驗證明(1)sdg阻斷人類間皮細(xì)胞和小鼠raw巨噬細(xì)胞中的石棉誘導(dǎo)的ros；(2)sdg阻斷通過暴露于石棉的小鼠腹膜巨噬細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子分泌；和(3)sdg阻斷暴露于石棉的小鼠腹膜巨噬細(xì)胞中的氧化(脂質(zhì)過氧化)和亞硝化應(yīng)激(亞硝酸鹽水平)。這些體外實驗支持體內(nèi)實驗以確定sdg在鈍性慢性炎癥中的有用性并且最終確定由于石棉暴露導(dǎo)致的惡性腫瘤。

因此，使用兩種小鼠模型在石棉誘導(dǎo)的間皮瘤中測試sdg，其中該小鼠在石棉暴露后遺傳傾向形成間皮瘤。使用這些模型，評估亞麻籽和sdg對單一劑量的石棉在小鼠中的急性效應(yīng)，以及測試亞麻籽和sdg是否在這些加速的石棉誘導(dǎo)mm模型中抑制腫瘤的發(fā)展(圖56)。

sdg富集的亞麻籽木脂素飲食(flc)鈍化mextag小鼠中的石棉誘導(dǎo)的腹部炎癥(圖57)。簡言之，向6只雄性mextag小鼠(10-12周齡)ip注射400μg的青石棉石棉，體積為0.5ml。在石棉注射之前，將半數(shù)小鼠置于富含sdg(35％sdg)的flc飲食上持續(xù)兩周-其他小鼠在標(biāo)準(zhǔn)飲食上。3天后，用5ml的pbs灌洗小鼠，并且進(jìn)行灌洗用于sups和細(xì)胞計數(shù)。進(jìn)行細(xì)胞離心涂片并針對差異，計數(shù)3-5個獨立的視野-計算總細(xì)胞的％。與0％fs飼喂的小鼠相比，喂食10％flc的小鼠在腹部灌洗液wbc中具有26％的減少(p＝0.014)(圖57)。

在7周齡、雄性、暴露于石棉的nf2(129sv)(+/-)小鼠中進(jìn)行急性期研究，以評估在飲食中給予的亞麻籽和木脂素sdg配制品的作用。nf2小鼠的石棉暴露的實驗計劃和亞麻籽/sdg木脂素配制品評估示于圖58中。簡言之，在第0天通過腹膜內(nèi)注射將雄性nf2(129sv)(+/-)暴露于400μg石棉。小鼠在石棉暴露前24小時(第-1天)在測試飲食(0％fs、10％fs、10％flc；n＝2只小鼠/組)上開始，并在石棉暴露后第3天處死。使用5ml的1×pbs進(jìn)行腹部灌洗(al)。炎癥細(xì)胞流入在3天達(dá)到峰值，并在石棉暴露后9天逐漸減少。因此，選擇3天作為在所有后續(xù)實驗中評估炎癥的時間點(圖59)。

亞麻籽及其富含sdg的木脂素成分鈍化石棉誘導(dǎo)的炎癥(年輕小鼠)(圖60)。在飲食中fs或flc添加的情況下，總白細(xì)胞(圖60a)降低，雖然不顯著。然而，當(dāng)觀察細(xì)胞差異，并且特別是巨噬細(xì)胞水平時，水平顯著通過亞麻籽和sdg-木脂素飲食減弱(圖60b)。

亞麻籽及其富含sdg的木脂素成分鈍化石棉誘導(dǎo)的炎癥(老年小鼠)(圖61)。與僅300,000個細(xì)胞/ml(高出10倍)相比，通過呈現(xiàn)約3,000,000wbc/ml的腹部灌洗液，暴露于腹部石棉的老齡小鼠(圖61a)對石棉更敏感。結(jié)果表明，炎癥細(xì)胞嗜中性粒細(xì)胞(圖61b)和巨噬細(xì)胞(圖61c)在老齡小鼠中二者都顯著高于年輕小鼠。

圖62：富含sdg的亞麻籽木脂素提取物(在飲食配制品中給出)使老年小鼠中石棉炎癥鈍化(圖62)。在第0天用400μg石棉注射(經(jīng)腹膜內(nèi))雄性nf2(129sv)(+/-)小鼠。小鼠在石棉暴露前一周(第-7天)在測試飲食(0％fs或10％flc)上開始，并在石棉暴露后第3天處死。用5ml1×pbs進(jìn)行腹部灌洗(al)(將1ml腹部灌洗液離心，并且冷凍上清液)。在-80°下冷凍收集血漿。在灌洗液中評估細(xì)胞，并且顯示通過富含sdg的飲食，總wbc和嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞都顯著減少。

富含sdg的亞麻籽木脂素提取物(在飲食配制品中給出)使老年小鼠中石棉炎性細(xì)胞因子分泌和亞硝化應(yīng)激鈍化(圖63)。在第0天用400μg石棉注射(經(jīng)腹膜內(nèi))雄性nf2(129sv)(+/-)小鼠。小鼠在石棉暴露前一周(第7天)在測試飲食(0％fs或10％flc)上開始，并在石棉暴露后第3天處死。用5ml1×pbs進(jìn)行腹部灌洗(al)(將1ml腹部灌洗液離心，并且冷凍上清液)。在-80°下冷凍收集血漿。細(xì)胞因子il1β和tnfα以及亞硝酸鹽的水平被富含sdg的飲食顯著鈍化。

簡言之，這些用nf2小鼠的體內(nèi)實驗證明：(1)飼喂富含sdg的飲食的小鼠具有顯著減少的腹部炎癥，如通過腹部灌洗液wbc所確定；(2)sdg富集的飲食減少腹部灌洗液中嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)量；(3)在飼喂sdg富集的小鼠中，促炎細(xì)胞因子、il-1β和tnfα的水平降低；并且(4)富含sdg的飲食喂養(yǎng)的小鼠具有更低水平的腹部灌洗液亞硝酸鹽，表示減少由暴露于石棉纖維誘導(dǎo)的亞硝化應(yīng)激。

這些實例中的這些研究證明sdg的化學(xué)預(yù)防活性。進(jìn)行更大規(guī)模的生物標(biāo)志物研究以評估頰上皮中的ii期酶的誘導(dǎo)和通過sdg的氧化應(yīng)激減少。在暴露于致癌物的受試者(例如，前體或當(dāng)前吸煙者)中，在口服sdg每天給予后，進(jìn)行另外的測量，測量氧化應(yīng)激和炎癥，并且包括血漿氧化應(yīng)激測量(血漿丙二醛)和促炎應(yīng)激標(biāo)志物(如il-6、il-1α、il1β、tnf-α、c-反應(yīng)蛋白、f2-異前列烷)。

盡管本文已舉例說明并描述了本發(fā)明的某些特征，但是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會想到許多修改、替換、改變和等同。因此，應(yīng)當(dāng)理解，所附權(quán)利要求旨在覆蓋落入本發(fā)明的真實精神內(nèi)的所有這些修改和改變。