本發(fā)明屬制藥領(lǐng)域，涉及寶藿苷Ⅰ新的藥用用途，具體涉及寶藿苷Ⅰ在制備治療哮喘藥物中的用途，尤其是在制備治療過(guò)敏性哮喘藥物中的用途。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了哮喘是一種由多種細(xì)胞和細(xì)胞成分參與的氣道慢性炎癥性疾病，該種慢性炎癥常導(dǎo)致氣道對(duì)多種刺激因子反應(yīng)性增高，出現(xiàn)可逆性氣流受限，引起反復(fù)發(fā)作的喘息、氣急、胸悶、咳嗽等癥狀。有關(guān)哮喘的發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確，研究顯示，遺傳因素與環(huán)境因素共同作用常導(dǎo)致哮喘患者持續(xù)性氣道炎癥、可逆性氣道阻塞、氣道高反應(yīng)性(airway hyperresponsiveness，AHR)和氣道重塑等；其中，變應(yīng)原誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化以及由此誘發(fā)的免疫性炎癥在哮喘中具有重要的作用。

目前，臨床上用于治療哮喘的藥物主要有糖皮質(zhì)激素、腎上腺素β2受體激動(dòng)劑、白三烯調(diào)節(jié)劑、緩釋茶堿等藥物。

寶藿苷Ⅰ是中藥淫羊藿的活性成分，屬于黃酮類化合物。有研究報(bào)道寶藿苷Ⅰ能夠抑制活化的T細(xì)胞增殖，抑制Eca-109細(xì)胞增殖，降低β-catenin、Cyclin D1、Survivin mRNA及蛋白表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖；但是迄今，尚未見(jiàn)有關(guān)寶藿苷Ⅰ對(duì)哮喘及T細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫性炎癥的作用的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供寶藿苷Ⅰ新的藥用用途，涉及寶藿苷Ⅰ在制備治療哮喘藥物中的用途，尤其是寶藿苷Ⅰ作為單一成分在制備治療哮喘藥物中的用途，本發(fā)明中更優(yōu)選寶藿苷Ⅰ作為單一成分在制備治療過(guò)敏性哮喘藥物中的用途。

本發(fā)明提供了寶藿苷Ⅰ在制備治療哮喘藥物中的用途，所述的寶藿苷Ⅰ通過(guò)降低哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性，抑制氣道炎癥，抑制免疫性炎癥相關(guān)趨化因子，調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞型及相關(guān)細(xì)胞因子分泌發(fā)揮抗哮喘作用，所述的寶藿苷Ⅰ能作為治療藥物用于治療哮喘尤其是過(guò)敏性哮喘。

本發(fā)明所述的寶藿苷Ⅰ(英文名稱：BaohuosideⅠ，CAS登記號(hào)：113558-15-9)具有式(Ⅰ)的結(jié)構(gòu)，可市購(gòu)，或以淫羊藿粗提物為原料，利用高效液相色譜法(HPLC)分離制備得到寶藿苷Ⅰ單體，其分子式為：C₂₇H₃₀O₁₀，分子量為：514.5211。

所述的寶藿苷Ⅰ；其外觀：白色粉末；純度：≥99.0％(HPLC)；包裝：1g,或根據(jù)客戶要求提供相應(yīng)包裝；4℃保存；

本發(fā)明進(jìn)行了體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)，通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)觀察了寶藿苷Ⅰ對(duì)卵蛋白誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型的作用以及對(duì)脾臟分離的CD4+T細(xì)胞的作用，結(jié)果表明，所述的寶藿苷Ⅰ能明顯降低哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性，抑制氣道炎癥，降低肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞數(shù)量，抑制趨化因子分泌，促進(jìn)Th1細(xì)胞和Treg細(xì)胞分化，抑制IL-17A，促進(jìn)IFN-γ和IL-10分泌。結(jié)果證實(shí)，所述的寶藿苷Ⅰ能作為治療藥物用于治療哮喘尤其是治療過(guò)敏性哮喘。

本發(fā)明的實(shí)施例中優(yōu)選寶藿苷Ⅰ作為單一成分在制備治療過(guò)敏性哮喘藥物中的用途。

為了便于理解，下面通過(guò)附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。需要特別指出的是，具體實(shí)施例和附圖僅是為了說(shuō)明，顯然本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)本文說(shuō)明，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修正或改變，這些修正和改變也將納入本發(fā)明范圍之內(nèi)。

附圖說(shuō)明

圖1是寶藿苷Ⅰ對(duì)卵蛋白誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型氣道高反應(yīng)性(airway hyperresponsiveness，AHR)的影響，其中，NC：正常對(duì)照組；AS：模型組；DEX：地塞米松對(duì)照組；BL：寶藿苷Ⅰ低劑量組；BM：寶藿苷Ⅰ中劑量組；BH：寶藿苷Ⅰ高劑量組；*:與模型組相比，P<0.05。

圖2是寶藿苷Ⅰ對(duì)卵蛋白誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型氣道炎癥的影響，其中，NC：正常對(duì) 照組；AS：模型組；DEX：地塞米松對(duì)照組；BL：寶藿苷Ⅰ低劑量組；BM：寶藿苷Ⅰ中劑量組；BH：寶藿苷Ⅰ高劑量組。

圖3是寶藿苷Ⅰ對(duì)卵蛋白誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中炎癥細(xì)胞數(shù)量的影響，

其中，NC：正常對(duì)照組；AS：模型組；DEX：地塞米松對(duì)照組；BL：寶藿苷Ⅰ低劑量組；BM：寶藿苷Ⅰ中劑量組；BH：寶藿苷Ⅰ高劑量組；WBC：白細(xì)胞總計(jì)數(shù)；NEU：中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)；LYM：淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)；MON：?jiǎn)魏思?xì)胞計(jì)數(shù)；EOS：嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)；BAS：嗜堿性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)；*：與正常組對(duì)比，p<0.05；#：與模型組對(duì)比p<0.05。

圖4是寶藿苷Ⅰ對(duì)卵蛋白誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型BALF中炎性趨化因子的影響，回收小鼠肺泡灌洗液，ELISA法檢測(cè)趨化因子CCL3和CCL19水平，

其中，NC：正常對(duì)照組；AS：模型組；DEX：地塞米松對(duì)照組；BL：寶藿苷Ⅰ低劑量組；BM：寶藿苷Ⅰ中劑量組；BH：寶藿苷Ⅰ高劑量組；*：與正常組對(duì)比，p<0.05；#：與模型組對(duì)比p<0.05。

圖5是寶藿苷Ⅰ對(duì)小鼠脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞亞型的影響，

其中，NC：正常對(duì)照組；stim：淋巴細(xì)胞刺激復(fù)合物干預(yù)組；B20：寶藿苷Ⅰ20μM劑量組；B40：寶藿苷Ⅰ40μM劑量組；B80：寶藿苷Ⅰ80μM劑量組。

圖6是寶藿苷Ⅰ對(duì)小鼠脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞炎癥因子分泌的影響，

其中，NC：正常細(xì)胞淋巴細(xì)胞刺激復(fù)合物干預(yù)組；B20：寶藿苷Ⅰ20μM劑量組；B40：寶藿苷Ⅰ40μM劑量組；B80：寶藿苷Ⅰ80μM劑量組；*：與正常組對(duì)比，p<0.05。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1寶藿苷Ⅰ對(duì)小鼠哮喘模型氣道高反應(yīng)性AHR的影響

通過(guò)市購(gòu)渠道或以淫羊藿粗提物為原料，利用高效液相色譜法(HPLC)分離制得式(Ⅰ)的寶藿苷Ⅰ單體，其分子式為：C₂₇H₃₀O₁₀，分子量為：514.5211。

采用健康清潔級(jí)7周齡雌性BALB/c小鼠60只，體重16-18g(由上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供)，隨機(jī)分為6組，每組10只，即正常對(duì)照組(NC)、哮喘模型組(AS)、地塞米松干預(yù)組(DEX)、寶藿苷Ⅰ低、中、高劑量干預(yù)組(BL、BM、BH)；小鼠第0天起予一次性腹腔注射20ug卵蛋白和2mg氫氧化鋁的生理鹽水混懸液0.2ml，使小鼠處于致敏狀態(tài)；分別于第7、14和21天以相同方法重復(fù)致敏三次；第25天起予3％卵蛋白超聲霧化吸入，每次約30分鐘誘發(fā)哮喘；小鼠出現(xiàn)呼吸加快、腹肌痙 攣、口唇發(fā)紺、點(diǎn)頭呼吸及站立不穩(wěn)等，表明卵蛋白誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型建立成功；

連續(xù)霧化吸入7天，每天1次；寶藿苷Ⅰ干預(yù)組小鼠第24天起，分別給予5mg/kg，10mg/kg，20mg/kg寶藿苷Ⅰ溶液灌胃，每次0.3ml，連續(xù)灌服8天，每天1次；

對(duì)照組小鼠予等量生理鹽水灌胃，末次激發(fā)后24h內(nèi)，給予不同劑量乙酰甲膽堿(Mch)激發(fā)，檢測(cè)AHR；

結(jié)果顯示，Mch激發(fā)后，哮喘組小鼠氣道阻力R_L明顯增高；低劑量寶藿苷Ⅰ干預(yù)明顯降低氣道阻力R_L(P<0.05)，表明所述的寶藿苷Ⅰ低劑量具有降低AHR的作用。

實(shí)施例2寶藿苷Ⅰ對(duì)卵蛋白誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型氣道炎癥的影響

取實(shí)驗(yàn)小鼠右側(cè)肺組織，常規(guī)處理后，4％中性甲醛浸泡固定，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡觀察炎癥變化；結(jié)果顯示，哮喘模型組小鼠氣道及周圍肺組織可見(jiàn)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及嗜酸粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；寶藿苷Ⅰ干預(yù)能夠明顯減低小鼠氣道壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡充血等炎癥改變。

實(shí)施例3寶藿苷Ⅰ對(duì)卵蛋白誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型BALF中炎性細(xì)胞的影響

實(shí)驗(yàn)小鼠完成肺功能測(cè)定后，在左支氣管處插入氣管灌洗針，開(kāi)胸結(jié)扎右主支氣管和右肺，使用0.3ml PBS灌洗左肺，反復(fù)2次；回收的BALF于4℃下800g×10min離心后將細(xì)胞沉淀用100ul PBS溶液重懸，進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)；結(jié)果顯示，與正常組相比，哮喘模型組，白細(xì)胞總計(jì)數(shù)(WBC)、中性粒細(xì)胞(NEU)、淋巴細(xì)胞(LYM)、單核細(xì)胞(MON)、嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)、嗜堿性粒細(xì)胞(BAS)數(shù)量明顯增高；寶藿苷Ⅰ低劑量組可顯著降低BALF中WBC、NEU、MON和EOS細(xì)胞數(shù)量(p<0.05)。

實(shí)施例4寶藿苷Ⅰ對(duì)卵蛋白誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型BALF中炎性趨化因子的影響

小鼠完成肺功能測(cè)定后，在左支氣管處插入氣管灌洗針，開(kāi)胸結(jié)扎右主支氣管和右肺，使用0.3ml PBS灌洗左肺，反復(fù)2次；回收的BALF于4℃下800g×10min離心后取上清，ELISA法檢測(cè)趨化因子CCL3和CCL19水平；結(jié)果顯示，所述的寶藿苷Ⅰ低、中、高劑量三個(gè)劑量均能夠明顯抑制CCL3分泌(p<0.05)，低劑量寶藿苷Ⅰ明顯抑制CCL19分泌(p<0.05)。

實(shí)施例5寶藿苷Ⅰ對(duì)小鼠脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞亞型的影響

獲得的實(shí)驗(yàn)小鼠脾臟在35mm培養(yǎng)皿中加入4-5ml淋巴細(xì)胞分離液(取用前恢復(fù)至室溫并搖勻)，研磨后將懸有脾臟細(xì)胞的分離液立即轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，覆蓋200-500μl的1640培養(yǎng)基(保持液面分界明顯)，室溫，800g離心30min，吸出淋巴細(xì)胞層，再加入10ml 1640培養(yǎng)基，顛倒洗滌，室溫，250g離心10min收集細(xì)胞；細(xì)胞計(jì)數(shù)，每10⁷個(gè)細(xì)胞加入40μl細(xì)胞分選緩沖液，加入10μl生物素標(biāo)記的抗體混合物，混勻，4℃孵育5min，加入30μl細(xì)胞分選緩沖液，加入20μl抗生物素標(biāo)記的微珠，混勻，4℃孵育10min；將LS分選柱轉(zhuǎn)配于分選器，以3ml細(xì)胞分選緩沖液潤(rùn)柱，將細(xì)胞上柱，收集流下來(lái)的液體，再以3ml細(xì)胞分選緩沖液洗柱，并收集流下來(lái)的液體，即為純化后的CD4+T淋巴細(xì)胞；以FITC-labeled anti-mouse CD4抗體標(biāo)記細(xì)胞表面抗原，4℃孵育20min，PBS洗滌2次，以300μl PBS重懸，流式上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞純度大于95％；

將CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁶/ml，用包含佛波酯PMA、鈣離子載體離子霉素和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑BFA在內(nèi)的淋巴細(xì)胞刺激復(fù)合物刺激細(xì)胞，工作濃度為2μl/10⁶細(xì)胞/ml培養(yǎng)液；將細(xì)胞置于24孔板培養(yǎng)，每孔1000μl體系，分別將終濃度為20、40、80μM濃度的寶藿苷-I加入24孔板的細(xì)胞懸液中，繼續(xù)培養(yǎng)10h，離心，收集上清，用流式抗體標(biāo)記Treg和Th1細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Treg和Th1細(xì)胞比例，結(jié)果顯示，寶藿苷Ⅰ干預(yù)后，小鼠脾臟IFN-γ⁺和Foxp3⁺T細(xì)胞比例均增加。

實(shí)施例6寶藿苷Ⅰ對(duì)小鼠脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞炎癥因子分泌的影響

將上述的CD4⁺T淋巴細(xì)胞細(xì)胞密度調(diào)整為2.5×10⁴/ml，用包含佛波酯PMA、鈣離子載體離子霉素和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑BFA在內(nèi)的淋巴細(xì)胞刺激復(fù)合物刺激細(xì)胞，工作濃度為2μl/10⁶細(xì)胞/ml培養(yǎng)液；將細(xì)胞置于96孔板培養(yǎng)，每孔200μl體系，約5000個(gè)細(xì)胞，然后分別將終濃度為20、40、80μM濃度的寶藿苷-I加入96孔板的細(xì)胞懸液中，繼續(xù)培養(yǎng)24h，離心，收集上清，用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-17A、IFN-γ、IL-10等細(xì)胞因子含量，結(jié)果顯示，在20、40和80μM 3個(gè)劑量下，寶藿苷-I能夠明顯抑制小鼠脾臟CD4⁺T淋巴細(xì)胞IL-17A分泌(p<0.05)，促進(jìn)IL-10分泌(p<0.05)，其中，20μM寶藿苷Ⅰ明顯促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞IFN-γ分泌(p<0.05)；對(duì)IL-4分泌無(wú)明顯作用(p>0.05)。