Egcg在制備防治心肌能量代謝障礙的食品和藥物的應用的制作方法
【專利摘要】EGCG在制備防治心肌能量代謝障礙的食品和藥物的應用，EGCG的作用靶點為細胞內(nèi)FoxO1信號通路，可抑制心肌能量代謝障礙引發(fā)的心肌細胞自噬，緩解心肌線粒體丟失，EGCG對心肌細胞的有效作用濃度為20uM；或按個體體重的攝取量為5-10mg/kg/日，能夠調(diào)節(jié)心肌能量代謝能力，恢復能量代謝障礙所致的心肌細胞功能不全；還用于抑制心肌細胞H9c2糖代謝障礙相關的自噬上調(diào)；還用于抑制心肌細胞H9c2糖代謝障礙相關的氧化應激；還用于降低心肌細胞H9c2糖代謝障礙相關的胰島素抵抗；本發(fā)明即可以食品功能因子、也可以藥物形式用于心肌能量代謝障礙、心肌胰島素抵抗、高血糖等因素所致心肌損傷等疾病的預防與治療。
【專利說明】EGCG在制備防治心肌能量代謝障礙的食品和藥物的應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物學、營養(yǎng)學和藥學領域，特別涉及表沒食子兒茶素沒食子酸酯 (Epigallocatechin gallate, EGCG)在制備防治心肌能量代謝障礙的食品和藥物的應用。

【背景技術】
[0002] 心肌正常工作需要穩(wěn)定、持續(xù)的能量供應。心肌能量代謝功能障礙是指心肌利用 葡萄糖、脂肪酸能力下降，能量供應發(fā)生障礙，導致心肌細胞功能不全，進而影響心臟的正 常搏動。心肌能量代謝功能障礙不僅是心肌功能不全、冠心病等重要心血管疾病的早期共 同病理特征之一，也是糖尿病等代謝性疾病的重要并發(fā)癥之一。防治心肌能量代謝功能障 礙是降低心血管疾病發(fā)生率、改善糖尿病相關的心肌病的根本手段之一。
[0003] 心肌細胞中，線粒體通過糖、脂的氧化磷酸化，提供細胞90%以上的能量，是細胞 動力工廠。我們近期研究發(fā)現(xiàn)，心肌線粒體功能異常可能是心肌能量代謝、特別是糖代謝能 力損傷的關鍵因素。從改善心肌線粒體功能的角度來預防或治療心肌損傷，可能成為防治 心肌能量代謝障礙以及相關疾病的共同有效途徑。
[0004] 如何靶向于線粒體從而改善線粒體功能？基于大量的實驗證據(jù)，我們提出"線 粒體營養(yǎng)素"理論，即針對線粒體功能障礙相關疾病中的線粒體功能紊亂，我們篩選發(fā) 現(xiàn)一類天然產(chǎn)物或線粒體中關鍵酶的輔基、輔酶可靶向性調(diào)控線粒體相關代謝途徑，有 效緩解線粒體功能障礙，防治疾病，詳見"l.Long J，Aksen〇V V，Rollo CD，Liu J(2012) A complex dietary supplement modulates nitrative stress in normal mice and in a new mouse model of nitrative stress and cognitive aging. Mech Ageing Dev.，' "2. Long J, Gao H, Sun L, Liu J, Zhao-Wilson X(2009)Grape extract protects mitochondria from oxidative damage and improves locomotor dysfunction and extends lifespan in a Drosophila Parkinson's disease model. Rejuvenation Resl2: 321-331.，' "3. Liu J,Shen W, Zhao B, Wang Y, Wertz K, et al. (2009)Targeting mitochondrial biogenesis for preventing and treating insulin resistance in diabetes and obesity:Hope from natural mitochondrial nutrients. Adv Drug Deliv Rev61:1343-1352. "。其中，針對心肌 能量代謝損傷，我們研究發(fā)現(xiàn)，綠荼中的主要成分EGCG，可顯著改善心肌線粒體功能，是一 種重要的線粒體營養(yǎng)素。
[0005] EGCG的化學分子結構式為：' 11 分子式為C22H180 n，分子量為458. 4克/ 摩爾。EGCG占綠茶毛重的9%-13%，是綠茶主要的活性和水溶性成份，具有極強的抗氧化活 性。大量臨床及動物試驗已經(jīng)證實綠茶具有血糖調(diào)節(jié)及提高胰島素敏感性的作用。
[0006] 在防治心血管疾病，綠茶也具有功效。Kim等發(fā)現(xiàn)，于大鼠腸系膜動脈床內(nèi)給與急 性 ECGC 處理可誘導血管舒張，詳見 Kim J, Formoso G, Li Y, Potenza MA, Marasciulo FL, et al. (2007)Epigallocatechin gallate, a green tea polyphenol, mediates NO-dependent vasodilation using signaling pathways in vascular endothelium requiring reactive oxygen species and Fyn. Journal of Biological Chemistry282:13736-13745. 〇 持續(xù)兩周 攝入綠茶能夠顯著改善長期吸煙者血流介導的內(nèi)皮依賴性血管舒張，提高其外周血管內(nèi)皮 祖細胞數(shù)，詳見"Kim W, Jeong MH, Cho SH, Yun JH, Chae HJ, et al. (2006) Effect of green tea consumption on endothelial function and circulating endothelial progenitor cells in chronic smokers. Circulation journal: official journal of the Japanese Circulation Society70:1052.。"此外，EGCG亦能夠改善缺血再灌注誘導的心肌細胞凋亡，改善心肌肥大 和氧化應激，詳見 "Piao CS, Kim DS, Ha KC, Kim HR, Chae HJ, et al· (2011) The Protective Effect of Epigallocatechin-3Gallate on Ischemia/Reperfusion Injury in Isolated Rat Hearts:An ex vivo Approach. The Korean Journal of Physiology&Pharmacologyl5: 259-26 6.。"近期，國內(nèi)學者一項研究發(fā)現(xiàn)短期EGCG干預對早期糖尿病大鼠心肌細胞縫隙連接功能 異常有改善，詳見"于路（2012)EGCG對高糖環(huán)境下大鼠心肌細胞縫隙連接的影響及其機制 探討：浙江大學"。
[0007] 盡管眾多研究揭示了綠茶，尤其是其主要成分EGCG在糖尿病及心血管疾病中的 重要作用，但針對心肌損傷和心肌能量代謝障礙，EGCG是否具有改善作用未見研究報道。特 別是，EGCG是否改善心肌能量代謝障礙？線粒體作為心肌能量代謝的關鍵細胞器，EGCG是 否通過改善線粒體功能防治心肌糖代謝障礙？心肌糖脂代謝障礙是心肌功能不全、冠心病 等心血管疾病的早期共同病理特征，也是糖尿病等代謝性疾病的重要并發(fā)癥之一，目前缺 乏有效的預防和治療手段。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了克服上述現(xiàn)有技術的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供EGCG在制備防治心肌能 量代謝障礙的食品和藥物的應用，EGCG作用于心肌線粒體，有效恢復心肌線粒體功能，改善 糖脂代謝和心肌胰島素抵抗，修復心肌細胞損傷，從而對于心肌能量代謝功能障礙相關疾 病，包括心肌能量代謝障礙、高血糖或糖尿病所致的心肌功能不全、心肌胰島素抵抗等疾病 具有預防和治療作用。
[0009] EGCG源于綠茶，因此EGCG既可以功能食品形式作為預防心肌功能不全、心肌胰島 素抵抗、心肌能量代謝障礙的預防產(chǎn)品，也可以藥物形式治療上述心肌能量代謝障礙及相 關疾病。
[0010] 為了達到上述目的，本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的：
[0011] EGCG在制備防治心肌能量代謝障礙的食品和藥物的應用，EGCG的作用靶點為細 胞內(nèi)FoxOl信號通路，可抑制心肌能量代謝障礙引發(fā)的心肌細胞自噬，緩解心肌線粒體丟 失；EGCG對心肌細胞的有效作用濃度為20uM，或按個體體重的攝取量為5-10mg/kg/日，能 夠有效改善心肌能量代謝和心肌功能。
[0012] 細胞作用濃度為20μΜ EGCG，或按個體體重的攝取量為5-10mg/kg/日，還用于改 善心肌線粒體功能，從而調(diào)節(jié)心肌糖代謝能力，恢復糖代謝障礙所致的心肌細胞功能不全。
[0013] 細胞作用濃度為20 μ M EGCG還用于抑制心肌細胞H9c2糖代謝障礙相關的自噬上 調(diào)。
[0014] 細胞作用濃度為20 μ M EGCG還用于抑制心肌細胞H9c2糖代謝障礙相關的氧化應 激。
[0015] 細胞作用濃度為20 μ M EGCG還用于降低心肌細胞H9c2糖代謝障礙相關的胰島素 抵抗。
[0016] 本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：
[0017] (1)首次發(fā)現(xiàn)心肌細胞線粒體是重要的藥物或功能因子作用靶點，首次證明EGCG 對心肌細胞的有效作用濃度為20uM，或個體攝取量5-10mg/kg體重/天(人體)，能夠有效作 用于心肌線粒體，防治心肌糖代謝障礙，改善心肌功能。
[0018] (2)心肌能量代謝障礙是心血管疾病的共同病理特征。因此，本發(fā)明對于高血糖及 非高血糖因素導致的心肌能量代謝障礙的早期預防具有普遍意義。
[0019] (3)明確EGCG心肌保護作用的分子靶點是FoxOl信號途徑，EGCG可以有效調(diào)節(jié)靶 分子FoxOl的表達。
[0020] (4)EGCG作為綠茶中的有效成分，安全性高，保護效應明確。既可作為食品功能因 子，也可以作為藥物用于代謝障礙相關的心肌損傷的預防和治療。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1是EGCG恢復Goto-Kakizaki大鼠（GK大鼠，一種糖代謝紊亂的大鼠模型，表 現(xiàn)為遺傳性非肥胖型高血糖，心肌功能不全）心臟線粒體功能的柱狀示意圖。其中，圖1A 和圖1B為EGCG喂養(yǎng)的GK大鼠（灌胃劑量100mg/kg體重/天，折算為人口服劑量10mg/ kg體重/天）心臟中線粒體復合物以及VDAC1蛋白變化的蛋白免疫印跡示意圖，圖1A線粒 體相關蛋白的表達量；圖1B線粒體相關蛋白的表達量統(tǒng)計學結果；圖1C為EGCG喂養(yǎng)的GK 大鼠心臟中線粒體呼吸鏈復合體I，III以及a-酮戊二酸脫氫酶活性的柱狀示意圖，數(shù)據(jù)來 源于6組大鼠，以平均值土標準誤的形式表示；+P < 0. 05, ++P < 0. 01，+++P < 0. OOlvs. Wistar 對照組；*Ρ < 0·05，**Ρ < 0·01，***Ρ < O.OOlvs.GK 對照組。
[0022] 圖2是EGCG降低GK大鼠心臟中二相酶，機體中氧化損傷增強一般會激活該類酶 的表達）蛋白表達升高的蛋白免疫印跡示意圖，其中圖2A是二項酶蛋白免疫印跡；其中 圖2B二項酶蛋白表達的統(tǒng)計學結果。+P < 0. 05，+++P < 0. OOlvs.Wistar對照組；*P < 0· 05, **P < 0· Olvs. GK 對照組。
[0023] 圖3是EGCG對GK大鼠心臟中線粒體生成以及線粒體動態(tài)變化相關蛋白表達影響 的蛋白免疫印跡示意圖。其中，EGCG喂養(yǎng)的GK大鼠心臟中線粒體生成相關蛋白表達降低 的蛋白免疫印跡示意圖（圖3A，線粒體生成相關蛋白表達降低的蛋白免疫印跡；圖3B，線粒 體生成相關蛋白表達降低的蛋白的統(tǒng)計學結果）；以及EGCG喂養(yǎng)的GK大鼠心臟中線粒體 動態(tài)學相關蛋白表達的蛋白免疫印跡示意圖，圖3C，線粒體動態(tài)學相關蛋白表達的蛋白免 疫印跡；圖3D，線粒體動態(tài)學相關蛋白表達的蛋白表達的統(tǒng)計學結果），數(shù)據(jù)來源于6組大 鼠，以平均值土標準誤的形式表示；+P < 0. 05, ++P < 0. 01，+++P < 0. OOlvs. Wistar對照 組；*P < 0.05, **P < 0.01，***P <0· OOlvs. GK 對照組。
[0024] 圖4是EGCG抑制GK大鼠心臟中自噬（心肌細胞自噬是線粒體降解或丟失的主要 途徑）相關蛋白表達的蛋白免疫印跡不意圖。其中，圖4A為EGCG喂養(yǎng)的GK大鼠心臟中 自噬標志分子表達降低的蛋白免疫印跡示意圖（圖4B、圖4C為圖A的統(tǒng)計學結果）；圖4D 和4E為EGCG喂養(yǎng)的GK大鼠心臟中調(diào)控自噬上游蛋白表達降低的蛋白免疫印跡示意圖及 其統(tǒng)計學結果。數(shù)據(jù)來源于6組大鼠，以平均值土標準誤的形式表示；+P < 0. 05, ++P < 0.01，+++P < O.OOlvs.Wistar 對照組；*Ρ < 0·05，**Ρ < 0.01，***P < O.OOlvs.GK 對照 組。
[0025] 圖5是EGCG能有效恢復心肌細胞H9c2中由高糖誘導所產(chǎn)生的胰島素抵抗，自噬 上調(diào)，線粒體損失以及氧化應激增加的柱狀示意圖。其中圖5A為EGCG能有效阻止高糖誘 導的H9c2細胞中胰島素抵抗相關蛋白磷酸化降低的蛋白免疫印跡示意圖，圖5B是統(tǒng)計學 結果；圖5C顯示EGCG能有效阻止高糖誘導的H9c2細胞中自噬相關蛋白表達上調(diào)的蛋白免 疫印跡示意圖，5D，5E是統(tǒng)計學結果；圖5F顯示EGCG能有效阻止高糖誘導的H9c2細胞中線 粒體數(shù)目相關蛋白表達減少以及二相酶相關蛋白表達增加蛋白免疫印跡示意圖，圖5G統(tǒng) 計學結果；圖5H為EGCG能有效阻止高糖誘導的H9c2細胞中R0S產(chǎn)生增加的柱狀示意圖； 圖圖51為EGCG能減少高糖誘導的H9c2細胞中自噬泡形成的激光共聚焦示意圖。圖A-G， H9c2細胞用20 μ mol/L EGCG預處理24小時，隨后用25mmol/L葡萄糖處理24小時檢測活性 氧產(chǎn)生的變化；最后用100nm〇l/L胰島素處理10分鐘，收集蛋白用于免疫印跡分析。數(shù)據(jù)來 源于5個獨立重復實驗，以平均值土標準誤的形式表示。+P < 0. 05, ++P < 0. 01，+++P < O.OOlvs.正常對照組，*P < 0.05，#P < O.Olvs.高糖處理組。圖I，H9c2細胞用EGFP-LC3 轉(zhuǎn)染12個小時后，先用20 μ mol/L EGCG預處理24小時，隨后用25mmol/L葡萄糖處理24小 時，激光共聚焦顯微鏡檢測自噬泡的形成。
[0026] 圖6是在高糖作用下，心肌細胞H9c2通過FoxOl來調(diào)控自噬的蛋白免疫印跡示意 圖。其中，圖6A為FoxOIRNA干擾后能抑制高糖誘導的H9c2細胞中自噬上調(diào)的蛋白免疫 印跡示意圖，圖6B，6C為統(tǒng)計學結果；圖6D為FoxOl過表達后通過非轉(zhuǎn)錄調(diào)控的方式增加 H9c2細胞自噬的蛋白免疫印跡示意圖，圖6E、6F統(tǒng)計學結果。數(shù)據(jù)來源于3個獨立重復實 驗，以平均值土標準誤的形式表示。*P < 〇. 〇5，#P < 0. 01，*#P < 0. OOlvs.對照組。

【具體實施方式】
[0027] 下面結合附圖及【具體實施方式】對本發(fā)明做詳細闡述。
[0028] I、材料與方法
[0029] 1、材料
[0030] EGCG ((_)-epigallocatechin-3-gallate)，葡萄糖（Glucose)，膜島素 (Insulin),輔酶 Q1 (CoQl)，癸泛醌（decylubiquinone)，細胞色素 C (Cytochrome C)， 2,6-Dichlorobenzenone_indophenol (DCIP)，2_ (P-鵬苯基)_3 (P-硝基苯基)_5_ 苯基四 氮唑氯（2- (p-iodophenyl) -3 (p-nitrophenyl) -5-phenyl tetrazolium chloride，INT)，輔 酶 A (CoASH)，焦憐酸硫胺素 （thiamine pyrophosphate)，monodansylcadaverine (MDC)以 及針對Tubulin，GAPDH的一抗來自西格瑪奧德里奇公司（Sigma，St Louis, M0XL-DMEM培養(yǎng) 基，青霉素（penicillin),鏈霉素（streptomycin), 2, 7-二氯二氫突光素二乙酸酯（2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2DCFDA)，膜蛋白酶（trypsin)以及針對 OxPhos Complexes I，II，III and IV 的一抗來自 Invitrogen 公司（Carlsbad, USA);針對NQ01, H0-1 ，S0D2, VDAC1, PGC1, mtTFA, DRP1, Mfnl, Mfn2, 0PA1 和 Ac-FoxOl 的一抗來自 Santa Cruz 公司 (Heidelberg, Germany);針對 Fox03a, FoxOl, p-FoxOl (Thr24), Atg5, Atg7, Beclini, LC3B, p-Akt(Ser473)，Akt, p-AMPK a (Thr172)，p-GSK3 β，ΑΜΡΚ α，p-mTOR(Ser2448)，mTOR 的一 抗來自Cell Signaling Technology公司（Beverly, MA, USA);辣根過氧化物酶偶聯(lián)的針對 鼠/兔/山羊的二抗購自杰克遜免疫研究實驗室（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc);胎牛血清購自PAA Laboratories GmbH (Linz, Austria);細胞裂解液購自江蘇海門碧 云天生物技術公司。其他試劑購自本地供銷商。
[0031] 2、實驗方法
[0032] 動物飼養(yǎng)
[0033] 四周齡雄性GK大鼠(本實驗中作為心肌糖代謝障礙模型大鼠）以及同齡Wistar大 鼠購自 SLAC Laboratory Animal Co. Ltd (Shanghai, China) ·按照 NIH 動物飼養(yǎng)原則飼養(yǎng)大 鼠，所有老鼠分為三組，Wistar對照組，GK對照組以及EGCG喂養(yǎng)的GK大鼠組，EGCG的喂養(yǎng) 量為100mg/kg體重/天(折算為人口服劑量為10mg/kg體重/天)，對照組給予相應體積的 生理鹽水。飼養(yǎng)三個月后，收取心臟組織用以實驗。
[0034] 細胞培養(yǎng)
[0035] 大鼠心肌細胞H9c2購自美國ATCC公司，生長在含10%胎牛血清，100單位/毫升 青霉素和100微克/毫升鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基中，并被置于恒溫（37°C )恒濕的5%二氧 化碳培養(yǎng)箱中，2天換液一次，所有細胞處于10代以內(nèi)。
[0036] 蛋白免疫印跡分析
[0037] 收集心臟組織（100mg)或者處理過的H9c2細胞，加入細胞裂解液于冰上孵育30分 鐘。17, 000g離心15分鐘，收集上清，蛋白定量，并將上清保存于-20°C。取約20 μ g蛋白 通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至NC膜上，NC膜用5%脫脂奶粉(溶解于TBST)封 閉1小時，接著用一抗室溫孵育1小時，TBST漂洗3次15分鐘，然后二抗室溫孵育1小時， TBST漂洗3次15分鐘，最后通過化學發(fā)光底物HRP反應，使用感光膠片記錄光亮度的變化。
[0038] 線粒體呼吸鏈復合體酶I，III以及a_酮戊二酸脫氫酶活性的檢測
[0039] 線粒體抽提。將剪碎的大鼠心臟組織用預冷的A液（120mM NaCl，20mM HEPES, 2mMMgC12, ImM EGTA, and5g/l bovine serum albumin ;ρΗ7· 4)重懸，于冰上靜置 5 分 鐘后用勻漿器將其勻漿，將組織勻漿于600g離心10分鐘。收集得到的上清再于17000g 離心10分鐘。線粒體沉淀用A液重懸后，于7000g離心10分鐘，沉淀用B液（300mM sucrose, 2mMHEPES, 0· ImM EGTA;pH7. 4)重懸，并于3500g離心10分鐘，得到的線粒體沉淀 用B液重懸后進行蛋白定量。以上所有操作都在4°C進行。所得到的線粒體保存于_80°C 直至酶活檢測。
[0040] NADH - CoQ 氧化還原酶（complex I)
[0041] 反應體系為：50mmol/L Tris-HC1 ρΗ8· 1，0· 05mmol/L DCIP，0. 35% 牛血清白蛋白 (BSA)，1 μ mol/L 抗霉素 A (antimycin A)，0· 2mmol/L 疊氣納（NaN3)，0. 05mmol/L 輔酶 Q1 (coenzyme Q1 )，通過200 μ mol/L還原態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH)啟動反應，然后在 30°C條件下讀取600nm處吸光值的變化2分鐘。
[0042] CoQ - cytochrome c 還原酶（complex III)
[0043] 反應體系為：50mmol/L Tris-HCl ρΗ7· 8,0· 2mmol/L 疊氮鈉（NaN3)，0· 05% 吐溫-20 (Tween-20)，0· 01% 牛血清白蛋白（BSA)，0· 05mmol/L 細胞色素 C (Cytochrome C)，通過 0. 05mmol/L decylubiquinol啟動反應，然后在30°C條件下讀取550nm處吸光值的變化2分 鐘。
[0044] a-酮戊二酸脫氫酶復合體（a-KGDH)
[0045] 反應體系為：35mmol/L 憐酸鉀緩沖液（potassium phosphate buffer ρΗ7· 25)， 2mmol/L 疊氣納（NaN3)，0· 5mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA)，2· 5 μ mol/L 魚藤麗（rotenone), 5mmol/L氯化鎂（MgCl2)，0. 5mmol/L煙酰胺腺噪呤二核苷酸（NAD+)，0. 2mmol/L焦磷酸硫胺 素(thiamine pyrophosphate)，2mmol/L a_ 1|戊二酸(a_Ketoglutarate)，通過 0· 04mmol/L 輔酶A (CoASH)啟動反應，然后在30°C條件下讀取340nm處吸光值的變化2分鐘。
[0046] 細胞內(nèi)氧化應激的測定
[0047] 按600, 000/孔的比例，將心肌細胞H9c2種在6孔培養(yǎng)板內(nèi)，靜置待細胞貼壁恢復 正常生長狀態(tài)，使用20 μ mol/L EGCG預處理24小時，隨后用25mmol/L葡萄糖處理24小時， 摒棄培養(yǎng)基，用PBS清洗一遍，然后加入溶解在無血清的L-DMEM培養(yǎng)基中的H 2DCFDA于37°C 培養(yǎng)箱中孵育〇. 5小時，接著去除H2DCFDA溶液，用PBS清洗一遍，加入細胞裂解液（lOmmol/ L Tris，150mmol/L NaCl，0· lmmol/L EDTA，0· 5%Triton Χ-100, ρΗ7· 5)，離心（15000g，10min， 4°C )得到上清液用熒光分析儀檢測(激發(fā)光485nm，發(fā)射光538nm)，同時用BCA試劑盒測定 蛋白濃度，最終以熒光0D值/蛋白含量表示活性氧的變化情況。
[0048] 自噬泡（自噬小體和自噬溶酶體）的觀察
[0049] H9c2細胞用EGFP-LC3轉(zhuǎn)染12個小時后，先用20 μ mol/L EGCG預處理24小時，隨 后用25mmol/L葡萄糖處理24小時，摒棄培養(yǎng)基，用多聚甲醛固定15分鐘后，于激光共聚焦 顯微鏡檢測自噬泡的形成。
[0050] FoxOlsiRNA干擾和過表達
[0051] 按照150000/孔的比例，將H9c2細胞接種于6孔板中，第二天按照脂質(zhì)體2000的 說明書進行操作，將FoxOl的siRNA (序列為5'-UGAAUAGCAAGGUGUCUGCTT-3'）轉(zhuǎn)入H9c2細 胞，24小時后，用25mmol/L葡萄糖再處理24小時，收集蛋白用于免疫印跡分析。
[0052] 按照脂質(zhì)體2000的說明書進行操作，將FoxOl野生型表達載體 pCDNA3-Fox01-FLAG以及磷酸化位點突變的表達載體pCDNA3-Fox01 (3A) -FLAG轉(zhuǎn)入心肌細 胞H9c2中，48個小時后，收集蛋白用于免疫印跡分析。
[0053] 統(tǒng)計分析
[0054] 實驗數(shù)據(jù)從至少3次獨立重復實驗中得出的平均值土標準誤表示。使用SPSS統(tǒng) 計軟件的單向方差分析方法（AN0VA)中的Fisher's LSD方法進行結果的差異顯著性分析。 差異顯著性按如下說明：+P < 0.05,++P < 0.01，+++P < 0.001 ;*P < 0.05, #P < 0.01， 林*P < 0·001。
[0055] 實施例一
[0056] EGCG對糖代謝障礙的GK大鼠心臟中線粒體功能紊亂的治療效果
[0057] 分別從正常Wistar大鼠，心肌糖代謝障礙模型GK大鼠和EGCG喂養(yǎng)的GK大鼠心 臟中提取蛋白質(zhì)及線粒體，然后用蛋白免疫印跡的方法來檢測線粒體相關蛋白的表達量， 結果見圖1A，線粒體相關蛋白的表達量；圖1B線粒體相關蛋白的表達量統(tǒng)計學結果）。GK 大鼠心臟中線粒體呼吸鏈復合體以及VDAC1的表達量都有所下降，而EGCG對其有很好的恢 復作用；用酶活測定的方法來檢測線粒體相關酶的酶活性，結果見圖1C，EGCG對于增加GK 大鼠心臟中粒體呼吸鏈復合體酶（I，III)以及a-酮戊二酸脫氫酶復合體酶的酶活性有著 顯著的作用。
[0058] 實施例二
[0059] EGCG對GK大鼠心臟中二相酶表達上調(diào)的恢復效果。
[0060] 二相酶的表達量是體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的重要指標，它的升高也能從側(cè)面反應體內(nèi)的 氧化應激增加。分別從正常Wistar大鼠，糖代謝障礙GK大鼠模型和EGCG喂養(yǎng)的GK大鼠 心臟中提取蛋白質(zhì)，用蛋白免疫印跡的方法來檢測二相酶的表達量。從圖2中可以看出， GK大鼠心臟中的二相酶（NQ01，H01，MnS0D)表達量相對于Wistar大鼠有著顯著的上調(diào)，而 EGCG的飼養(yǎng)能夠有效的減少二相酶的表達量。
[0061] 實施例三
[0062] EGCG對GK大鼠心臟中線粒體生成及動態(tài)學相關蛋白表達量的影響。
[0063] 我們發(fā)現(xiàn)GK大鼠心臟中線粒體有著功能紊亂以及數(shù)目減少的現(xiàn)象，推測這些現(xiàn) 象可能與線粒體生成及動態(tài)變化有關。從圖3A、3B可以看出，GK大鼠心臟線粒體生成相關 蛋白的表達量有所增加，EGCG的飼養(yǎng)對其有恢復作用；從圖3C、3D可以看出，GK大鼠心臟 線粒體融合相關蛋白沒有變化，但分裂相關蛋白Drpl有所減少，EGCG則能夠恢復其到正常 大鼠Wistar的表達水平。
[0064] 實施例四
[0065] EGCG對GK大鼠心臟中自噬相關蛋白表達量上調(diào)的抑制效果。
[0066] 根據(jù)上述結果，我們推測GK大鼠心臟中線粒體功能障礙的現(xiàn)象是由于自噬增加 所引起的，EGCG對自噬可能有一定的抑制作用從而達到恢復線粒體功能的效果。我們用蛋 白免疫印跡的方法來檢測自噬相關蛋白的表達量，結果見圖4A-C，EGCG對于GK大鼠心臟中 的自噬上調(diào)（LC3B，Atg家族蛋白表達量的增加）有著明顯的抑制效果。而從圖4D、4E中可 以看出在胰島素的作用下控制自噬的兩條通路中，mTOR無明顯變化，而FoxOs家族蛋白量 在GK大鼠心臟中的表達量升高會被EGCG所抑制。
[0067] 實施例五
[0068] EGCG能抑制心肌細胞H9c2中糖代謝障礙，自噬增加，氧化應激上調(diào)以及線粒體數(shù) 目減少。
[0069] H9c2細胞用20 μ mol/L EGCG預處理24小時，隨后用25mmol/L葡萄糖處理24小 時，最后用100nm〇l/L的胰島素處理10分鐘，蛋白免疫印跡雜交檢測相關蛋白的表達量。如 圖5A及5B所示，ρ-ΑΚΤ和p-GSK3 β是胰島素抵抗和糖代謝障礙的兩個標志分子，高糖處理 組中ρ-ΑΚΤ和p-GSK3 β有著明顯的下降，說明25mmol/L葡萄糖能夠誘導H9c2細胞產(chǎn)生胰 島素抵抗，而20 μ mol/L EGCG預處理則能夠有效預防胰島素抵抗的發(fā)生；從圖5C及?可以 看出，EGCG對于高糖誘導自噬相關蛋白Fox01，F(xiàn)ox03a，Atg7，Atgl2-Atg5和LC3B的表達升 高都有著明顯的抑制效果；LC3-II/LC3-I的比值代表著自噬的強度，圖5E說明EGCG能有 效的抑制H9c2細胞中由高糖引起的自噬上調(diào)；線粒體功能紊亂與胰島素抵抗密切相關，從 圖5F、5G顯示，高糖誘導可造成H9c2細胞中線粒體成分Complex III，Complex IV和VDAC1 的減少，EGCG則可以阻止這種現(xiàn)象的發(fā)生；活性氧主要是由于線粒體氧化磷酸化過程中電 子滲漏造成的（圖5H)，圖5F、G同時說明EGCG可以抑制由高糖引起的活性氧產(chǎn)生以及相 應的二相酶上調(diào)；當自噬發(fā)生時，細胞內(nèi)的LC3會聚集起來，形成自噬泡，用EGFP-LC3轉(zhuǎn)染 H9c2細胞12小時后，先用20 μ mol/L EGCG預處理24小時，隨后用25 mmol/L葡萄糖處理 24小時，激光共聚焦顯微鏡檢測自噬泡的形成，如圖51，EGCG處理組細胞中的LC3斑點明 顯少于高糖誘導組。
[0070] 實施例六
[0071] FoxOl所調(diào)控的自噬在心肌細胞H9c2糖代謝障礙中起重要作用。
[0072] 動物試驗中我們發(fā)現(xiàn)心肌細胞自噬的上調(diào)與FoxOl有關，我們用FoxOlsiRNA轉(zhuǎn)染 H9c2細胞，隨后用25mmol/L葡萄糖處理24小時，結果發(fā)現(xiàn)FoxOl干擾的H9c2細胞中自噬 下調(diào)，同時線粒體成分Complex IV和VDAC1都有所上升，說明FoxOl在高糖誘導H9c2細胞 的自噬上調(diào)中起重要作用，如圖6A、B、C ;Fox01野生型表達載體p⑶NA3-Fox01-FLAG以及 磷酸化位點突變的表達載體P⑶NA3-Fox01 (3A) -FLAG轉(zhuǎn)染心肌細胞H9c2,結果表明磷酸化 位點突變的FoxOl過表達并不能引起自噬的增加，說明FoxOl過表達后通過非轉(zhuǎn)錄調(diào)控的 方式增加H9c2細胞自噬，如圖6D-F。
[0073] 由上述結果可見，EGCG可以有效的改善心肌糖代謝障礙、胰島素抵抗及其所伴隨 的線粒體功能障礙、自噬增加以及氧化應激上調(diào)，并揭示了 FoxOl可能作為一個EGCG的分 子靶點，在調(diào)控心肌細胞自噬中起了非常重要的作用。
【權利要求】
1. EGCG在制備防治心肌能量代謝障礙的食品和藥物的應用，其特征在于，EGCG的作用 靶點為細胞內(nèi)FoxOl信號通路，可抑制心肌能量代謝障礙引發(fā)的心肌細胞自噬，緩解心肌 線粒體丟失；EGCG對心肌細胞的有效作用濃度為20uM ;或按個體體重的攝取量為5-10mg/ kg/日，能夠有效改善心肌能量代謝和心肌功能。 2. EGCG在制備防治心肌能量代謝障礙的食品和藥物的應用，其特征在于，細胞作用濃 度為20 μ M EGCG，或按個體體重的攝取量為5-10mg/kg/日，還用于改善心肌線粒體功能，從 而調(diào)節(jié)心肌糖代謝能力，恢復糖代謝障礙所致的心肌細胞功能不全。 3. EGCG在制備防治心肌能量代謝障礙的食品和藥物的應用，其特征在于，細胞作用濃 度為20 μ M EGCG還用于抑制心肌細胞H9c2糖代謝障礙相關的自噬上調(diào)。 4. EGCG在制備防治心肌能量代謝障礙的食品和藥物的應用，其特征在于，細胞作用濃 度為20 μ M EGCG還用于抑制心肌細胞H9c2糖代謝障礙相關的氧化應激。 5. EGCG在制備防治心肌能量代謝障礙的食品和藥物的應用，其特征在于，細胞作用濃 度為20 μ M EGCG還用于降低心肌細胞H9c2糖代謝障礙相關的胰島素抵抗。
【文檔編號】A61P3/10GK104042605SQ201410024805
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年1月20日 優(yōu)先權日:2014年1月20日
【發(fā)明者】劉健康, 龍建綱, 劉甲, 唐穎, 馮智輝, 嚴炯 申請人:西安交通大學