作為cmv疫苗的條件性復(fù)制型巨細(xì)胞病毒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用遺傳修飾的條件性復(fù)制缺陷型CMV誘導(dǎo)針對巨細(xì)胞病毒(CMV)的免疫應(yīng)答的方法。本發(fā)明的方法可以用于治療和/或預(yù)防原發(fā)性CMV感染、由潛伏CMV的再活化引起的感染、和以前已經(jīng)遇到的CMV的不同毒株的重疊感染。本發(fā)明也涉及一種復(fù)制缺陷型CMV，其已經(jīng)被重組改變以允許病毒復(fù)制的外部控制。本發(fā)明也包括包含所述復(fù)制缺陷型CMV的組合物。
【專利說明】作為CMV疫苗的條件性復(fù)制型巨細(xì)胞病毒
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及使用遺傳修飾的條件性復(fù)制缺陷型CMV誘導(dǎo)針對巨細(xì)胞病毒(CMV)的免疫應(yīng)答的方法。本發(fā)明也涉及已經(jīng)重組地改變以實(shí)現(xiàn)病毒復(fù)制的外部控制的CMV。本發(fā)明也包括包含所述復(fù)制缺陷型CMV的組合物。
[0002]發(fā)明背景
巨細(xì)胞病毒(CMV)也被稱作人皰疹病毒5型(HHV-5)，是被歸類為皰疹病毒科的β亞科的一個成員的皰疫病毒。根據(jù)疾病控制和預(yù)防中心(Centers for Disease Control andPrevention),發(fā)現(xiàn)CMV感染頗為普遍地存在于人類群體中，據(jù)估算40-80%的美國成人群體已經(jīng)受感染。該病毒主要通過體液傳播，且經(jīng)常從懷孕母體傳遞給胎兒或新生兒。CMV感染在大多數(shù)個體中是潛伏性的，盡管病毒活化可以導(dǎo)致高熱、寒戰(zhàn)、疲勞、頭痛、惡心和脾腫大。[0003]盡管大多數(shù)人CMV感染是無癥狀的，但是免疫受損個體(諸如HIV-陽性的患者、同種異體移植患者和癌癥患者)或其免疫系統(tǒng)尚未充分發(fā)育的人(諸如新生兒)中的CMV感染可以是特別有問題的(Mocarski等人，Cytomegalovirus,在Field Virology中，2701-2772，編輯:Knipes和Howley，2007)。這樣的個體中的CMV感染除了其它有害病況外還可以造成嚴(yán)重病態(tài)，包括肺炎、肝炎、腦炎、結(jié)腸炎、葡萄膜炎、視網(wǎng)膜炎、失明和神經(jīng)病。另外，妊娠期間的CMV感染是出生缺陷的主要原因(Adler，2008 J.Clin Virol,41:231; Arvin 等人，2004 Clin Infect Dis, 39:233; Revello 等人，2008 J MedVirol, 80:1415) oCMV在體內(nèi)感染多種細(xì)胞，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)元、平滑肌細(xì)胞、肝細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞(Plachter等人.1996，Adv.Virus Res.46:195)。盡管臨床CMV分離物在多種細(xì)胞類型中復(fù)制，但是實(shí)驗(yàn)室毒株AD169 (Elek和Stern, 1974, Lancet 1:1)和Towne (Plotkin等人，1975，Infect.1mmun.12:521)幾乎排它地在成纖維細(xì)胞中復(fù)制(Hahn等人，2004，J.Virol.78:10023)。由連續(xù)傳代和所述病毒在成纖維細(xì)胞中的最終適應(yīng)引起的趨性限制，被規(guī)定為減毒的標(biāo)志物(Gerna等人，2005，J.Gen.Virol.86:275; Gerna等人，2002，J.GenVirol.83:1993; Gerna 等人，2003，J.Gen Virol.84:1431; Dargan 等人，2010，J.Gen Virol.91:1535)。已經(jīng)將造成人CMV實(shí)驗(yàn)室毒株中的上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞和樹突細(xì)胞趨性損失的突變定位至3個可讀框(ORF):UL128、UL130和UL131 (Hahn等人，2004， J.Virol.78:10023; Wang和 Shenk, 2005 J.Virol.79:10330; Wang和 Shenk,2005 Proc Natl Acad Sci USA.102:18153)。生化和重構(gòu)研究表明，UL128、UL130和UL131裝配到gH/gL支架上以形成五聚體gH復(fù)合物(Wang和Shenk, 2005 Proc Natl Acad SciUSA.102:1815; Ryckman等人，2008 J.Virol.82:60)。該復(fù)合物在病毒粒子中的恢復(fù)會修復(fù)實(shí)驗(yàn)室毒株中的病毒上皮趨性(Wang和Shenk, 2005 J.Virol.79:10330)。
[0004]已經(jīng)將內(nèi)皮和上皮趨性損失推測為以前評價的疫苗諸如Towne的缺陷(Gerna等人，2002，J.Gen Virol.83:1993; Gerna 等人，2003，J.Gen Virol.84:1431)。得自天然CMV感染的人受試者的血清中的中和抗體的對抗病毒上皮進(jìn)入的活性比對抗成纖維細(xì)胞進(jìn)入的活性高超過15倍(Cui等人，2008 Vaccine 26:5760)。具有原發(fā)性感染的人會快速地形成針對病毒內(nèi)皮和上皮進(jìn)入的中和抗體，但是僅緩慢地形成針對病毒成纖維細(xì)胞進(jìn)入的中和抗體(Gerna等人，2008 J.Gen.Virol.89:853)。此外，在來自接受Towne疫苗的人受試者的免疫血清中不存在對抗病毒上皮和內(nèi)皮進(jìn)入的中和活性(Cui等人，2008 Vaccine 26:5760)。更近年來，描述了一組得自4位具有HCMV感染的供體的人單克隆抗體，并且得自該組的更有效的中和克隆識別五聚體gH復(fù)合物的抗原(Macagno等人，2010 J.Virol.84:1005)。
[0005]發(fā)明概述
本發(fā)明涉及條件性復(fù)制缺陷型CMV (rdCMV)，以及rdCMV在治療患者中的CMV感染或與這樣的感染有關(guān)的病理學(xué)和/或降低其可能性的組合物和方法中的用途。本文描述的rdCMV包含編碼一種或多種融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含與去穩(wěn)定蛋白(destabilizing protein)融合的必需蛋白。在沒有穩(wěn)定劑存在下,所述融合蛋白會被降解。因而，可以在允許復(fù)制的條件下(即，在有穩(wěn)定劑存在下)在組織培養(yǎng)物中培養(yǎng)rdCMV，但是當(dāng)施用給患者時(在沒有穩(wěn)定劑存在下)，會減少復(fù)制，且優(yōu)選地阻止復(fù)制。
[0006]本發(fā)明的一個實(shí)施方案是條件性復(fù)制缺陷型CMV。所述rdCMV包含編碼一種或多種融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含與去穩(wěn)定蛋白融合的必需蛋白。編碼野生型必需蛋白的核酸不再存在于所述rdCMV中，且因而所述融合蛋白是病毒復(fù)制所必需的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述必需蛋白選自:IEl/2、UL51、UL52、UL79和UL84，且所述去穩(wěn)定蛋白是FKBP或其衍生物。
[0007]本發(fā)明的另一個實(shí)施方案是，包含分離的rdCMV和藥學(xué)上可接受的載體的組合物。所述組合物可以進(jìn)一步包含佐劑，所述佐劑包括、但不限于ISCOMATRIX?佐劑和磷酸鋁佐劑。
[0008]本發(fā)明的另一個實(shí)施 方案是，所述rdCMV組合物在患者中誘導(dǎo)針對CMV的免疫應(yīng)答的用途。通過施用本發(fā)明的rdCMV，可以預(yù)防性地或治療性地處理患者。預(yù)防性處理會提供足夠的保護(hù)性免疫以減小CMV感染的可能性或嚴(yán)重程度，所述CMV感染包括原發(fā)性感染、復(fù)發(fā)性感染(即，由潛伏CMV的再活化引起的那些感染)和重疊感染(即，由與患者以前經(jīng)歷的CMV毒株不同的CMV毒株的感染引起的那些感染)。在具體實(shí)施方案中，給育齡女性、特別是青春期早期女性接種疫苗以減小在妊娠期間CMV感染(原發(fā)性感染、復(fù)發(fā)性感染或重疊感染)的可能性，并從而減小CMV向胎兒傳播的可能性。可以進(jìn)行治療性處理以減小當(dāng)前的CMV感染的持續(xù)時間/嚴(yán)重程度。
[0009]本發(fā)明的另一個實(shí)施方案是，制備本發(fā)明的rdCMV的方法，所述方法包括:在有Shield-1存在下，在上皮細(xì)胞諸如ARPE-19細(xì)胞(ATCC登記號CRL-2302)上繁殖所述rdCMV。在一些實(shí)施方案中，在存在于微載體或其它高密度細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)上的上皮細(xì)胞上繁殖所述rdCMV。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1A-1B顯示了具有恢復(fù)的五聚體gH復(fù)合物表達(dá)的CMV毒株的構(gòu)建示意圖。(A)用于操縱AD169病毒基因組的可自切割的細(xì)菌人工染色體(BAC)的制備策略。(B)用于恢復(fù)它的表達(dá)的UL131中的移碼突變的修復(fù)。(C)用ere重組酶基因替換GFP以建立可自切割的 CMV BAC。
[0011]圖2A-2D顯示了常規(guī)滅活方法對gH復(fù)合物免疫原性的影響。使用Y-輻照(A，B)和β_丙內(nèi)酯(BPL) (C，D)來滅活表達(dá)gH復(fù)合物的CMV。通過蝕斑測定來確定滅活動力學(xué)(A，C)，而通過評價得自施用了 CMV的小鼠的血清中對抗病毒上皮細(xì)胞進(jìn)入的中和活性來確定免疫原性(B，D)。
[0012]圖3顯示了表達(dá)gH復(fù)合物的CMV的Shield I濃度依賴性的后代病毒生產(chǎn)，所述CMV含有與FKBP衍生物融合的不同必需蛋白。以0.01 PFU/細(xì)胞的復(fù)數(shù)用rdCMV病毒感染ARPE-19細(xì)胞I h，用新鮮培養(yǎng)基洗滌2次，并在含有0、0.05、0.1 0.5或2μΜ Shield-1的生長培養(yǎng)基中溫育。感染后7天，收集無細(xì)胞的病毒，并通過TCID50測定在有2μΜ ShieldI存在下在ARPE-19細(xì)胞上確定病毒滴度。
[0013]圖4A-4D顯示了 rdCMV在ARPE-19細(xì)胞中的生長動力學(xué)。以0.01 PFU/細(xì)胞的復(fù)數(shù)，用含有(A) IE1/2, (B) UL51、(C) IE1/2-UL51融合蛋白的病毒或(D)親本beMAD病毒感染細(xì)胞。I小時以后，將細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基洗滌2次，并在沒有(空心圓圈)或有(實(shí)心圓圈)2μΜ Shield-1存在下溫育。在感染后的指定時間點(diǎn)收集無細(xì)胞的病毒，并通過TCID50測定在含有2μΜ Shield-1的培養(yǎng)基中的ARPE-19細(xì)胞上定量感染性病毒。
[0014]圖5A-5E IE1/2-UL51 rdCMV在不同細(xì)胞類型中的生長動力學(xué)。用rdCMV病毒感染(A) MRC-5 (B) HUVEC (C) AoSMC (D) SKMC (E) CCF-STTG1 細(xì)胞，并溫育 I 小時。將細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基洗滌2次，然后在沒有(空心圓圈)或有(實(shí)心圓圈)2μΜ Shield-1存在下溫育。在感染后的指定時間點(diǎn)收集無細(xì)胞的病毒，并通過TCID50測定在含有2μΜ Shield-1的培養(yǎng)基中的ARPE-19細(xì)胞上定量感染性病毒。
[0015]圖6A-6C在小鼠、兔和恒河猴中的IE1/2-UL51 rdCMV的免疫原性分析。(A)在第O和4周用beMAD (空心圓圈)或IE1/2-UL51 rdCMV(實(shí)心圓圈)免疫小鼠。(B)在第0、3和8周用IOPg beMAD或指定的rdCMV免疫兔。(C)在第O和8周用IOOPg beMAD或IEl/2-UL51rdCMV免疫恒河猴。在每種情況下，收集血清樣品，并通過CMV微中和測定在ARPE-19細(xì)胞上分析。線指示每組中的中和(NT50)的幾何平均滴度。
[0016]圖7顯示了用雙重融合病毒IE1/2-UL51接種的恒河猴的縱向中和滴度。在第O、8和24周(顯示為紅色三角形)給恒河猴組(n=5)接種指定的疫苗劑量或制劑，一組在第0、4和24周接受gb/mf59 (30 mg/劑量)。在指定的時間點(diǎn)收集免疫血清，并在病毒中和測定中評價?？v向繪制NT50滴度的GMT，顯示該組的標(biāo)準(zhǔn)誤差。AAHS:無定形硫酸羥基磷酸鋁；MX:ISC0MATRIX ；HNS:堿性緩沖液。
[0017]圖8A-8D顯示了以每劑100 μ g (A)或10 μ g (B-D)用雙重融合病毒IE1/2-UL51接種的恒河猴的IFN-YELISP0T。不使用佐劑(A-B)，或者使用AAHS (C)或ISC0MATRIX(D)。用代表HCMV抗原的肽庫刺激PBMC?；疑珬l代表該組的每種抗原的GMT (n=5)。每種抗原的應(yīng)答者比率顯示在圖內(nèi)的每種抗原的頂部。
[0018]圖9A-9B顯示，雙重融合病毒IE1/2-UL51的疫苗接種能夠在恒河猴中誘導(dǎo)⑶8+(A)和⑶4+ (B)表型的T-細(xì)胞應(yīng)答。從施用100 yg或10 μ g劑量的疫苗(以ISC0MATRIX?作為佐劑)的猴收集PBMC。用代表HCMV抗原的肽庫刺激PBMC，隨后針對IFN- Y和CD4+/⑶8+表面T-細(xì)胞標(biāo)志物進(jìn)行染色。將數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為每百萬PBMC的⑶4+/⑶8+陽性的、IFN-Y陽性的細(xì)胞的數(shù)目。線代表接受相同疫苗的組(n=5)的幾何平均值(GMT)。在圖底部的數(shù)字代表2個接種疫苗組(n=10)的GMT。CMV:純化的病毒；SEB:用作陽性對照試劑的促分裂原；MX:1SCOMATRIX。
[0019]圖10顯示，Merck磷酸鋁佐劑(MAPA)可以增強(qiáng)在猴中的中和抗體滴度。在第O和8周，用30 Ug劑量的在HNS (堿性緩沖液)、AAHS或MAPA中配制的雙重融合病毒疫苗免疫恒河猴。在第12周收集血清樣品，并評價中和滴度。線代表該組的幾何平均值。
[0020]圖1IA-1IB顯示了表達(dá)gH的CMV在不同溫度下在漢克平衡鹽溶液(HBSS)中的穩(wěn)定性。(A)在指定的溫度下將CMV樣品在HBSS中儲存4天，然后使用病毒進(jìn)入測定來測量CMV病毒穩(wěn)定性。(B)使用病毒進(jìn)入測定結(jié)果，計算樣品的EC50值。*指示，由于侵染性的完全喪失，不可計算EC50。
[0021]圖12A-12B顯示了在室溫下pH對表達(dá)gH的CMV的穩(wěn)定性的影響。(A)在室溫將CMV樣品在具有不同pH的緩沖液中儲存4天，然后使用病毒進(jìn)入測定來測量CMV病毒穩(wěn)定性。(B)使用病毒進(jìn)入測定結(jié)果，計算樣品的EC50值。
[0022]圖13A-13B顯示了單獨(dú)的尿素或與氯化鈉組合的尿素對表達(dá)gH的CMV病毒穩(wěn)定性的影響。(A)將單獨(dú)的2%尿素或與150mM NaCl組合的2%尿素加給25 mM組氨酸緩沖液(pH 6)中的CMV在室溫保持4天，然后使用病毒進(jìn)入測定來測量CMV病毒穩(wěn)定性。(B)使用病毒進(jìn)入測定結(jié)果，計算樣品的EC50值。
[0023]圖14A-14B顯示了離子強(qiáng)度對表達(dá)gH的CMV病毒穩(wěn)定性的影響。(A)將遞增濃度的 NaCl (O mM、75 mM、150 mM 和 320 mM NaCl)加給 25 mM 組氨酸緩沖液(pH 6)中的 CMV在室溫保持4天，然后使用病毒進(jìn)入測定來測量CMV病毒穩(wěn)定性。(B)使用病毒進(jìn)入測定結(jié)果，計算樣品的EC50值。
[0024]圖15顯示了冷凍保護(hù)劑對表達(dá)gH的CMV對抗凍融循環(huán)的穩(wěn)定性的影響。將指定的冷凍保護(hù)劑加給25 mM組氨酸緩沖液(pH 6)中的CMV，并進(jìn)行3個凍融循環(huán)，然后使用病毒進(jìn)入測定來測量CMV病毒穩(wěn)定性。使用病毒進(jìn)入測定結(jié)果，計算樣品的EC50值。
[0025]圖16A-16B顯示了儲存溫度對在小鼠免疫原性研究中誘導(dǎo)CMV中和抗體的影響。在第O天免疫小鼠，并在第21天加強(qiáng)，隨后在第28天抽血。使用ARPE-19細(xì)胞測試小鼠血清中針對表達(dá)gH的CMV的中和抗體。通過非線性曲線擬合，得到NT50滴度。(A)在免疫原性研究之前，將CMV樣品在不同溫度下儲存3個月。(B)在免疫原性研究之前，且在融化后，將CMV樣品在不同溫度下儲存8小時。
[0026]發(fā)明詳述
本發(fā)明涉及條件性復(fù)制缺陷型CMV (rdCMV)，以及rdCMV在治療患者中的CMV感染或與這樣的感染有關(guān)的病理學(xué)和/或降低其可能性的組合物和方法中的用途。本文描述的rdCMV編碼一種或多種融合蛋白，所述融合蛋白包含與去穩(wěn)定蛋白融合的必需蛋白而非野生型必需蛋白。在沒有穩(wěn)定劑存在下，所述融合蛋白會被宿主細(xì)胞機(jī)(host cellmachinery)降解。在有穩(wěn)定劑存在下，所述融合蛋白被穩(wěn)定化，且不會被降解。
[0027]用于本發(fā)明中的合適融合蛋白保留足夠的必需蛋白活性，以促進(jìn)在有穩(wěn)定劑存在下在宿主細(xì)胞中的病毒復(fù)制，并造成在沒有穩(wěn)定劑存在下CMV復(fù)制的下降(優(yōu)選地大于50%、75%、90%、95%或99%的下降)。優(yōu)選地，用于所述融合蛋白中的必需蛋白編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，且因而不會被包裝進(jìn)rdCMV病毒粒子中。在本文中鑒別出的合適必需蛋白包括由必需基因 IE1/2、UL51、UL52、UL79 和 UL84 編碼的 CMV 蛋白。[0028]去穩(wěn)定蛋白和穩(wěn)定劑的一個實(shí)例描述在美國專利公開2009/0215169中，其公開了使用小分子調(diào)控蛋白穩(wěn)定性的組合物、系統(tǒng)和方法。簡而言之，將蛋白與影響穩(wěn)定性的蛋白FKBP或其衍生物融合。外源添加的、細(xì)胞可滲透的小分子Shield-1 (Shld-1)會與FKBP或其衍生物相互作用并穩(wěn)定所述融合蛋白。在沒有Shield-1存在下，F(xiàn)KBP或其衍生物引導(dǎo)所述融合蛋白被宿主細(xì)胞機(jī)降解。
[0029]在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，將必需的CMV蛋白與FKBP或其衍生物融合。在有Shield-1存在下，所述融合蛋白被穩(wěn)定化。但是，在沒有Shield-1存在下，F(xiàn)KBP或其衍生物引導(dǎo)所述融合蛋白被宿主細(xì)胞機(jī)制降解。
[0030]在沒有融合蛋白存在下，會降低(優(yōu)選地，與不含去穩(wěn)定的必需蛋白的CMV相比，大于50%、75%、90%、95%或99%)或阻止rdCMV的復(fù)制。
[0031]要在本發(fā)明的方法中使用的重組病毒也在它的病毒粒子上展示免疫原性的五聚體gH復(fù)合物。
[0032]實(shí)施方案也包括本文描述的重組CMV或其組合物、或包含所述CMV或組合物或者由它們組成的疫苗，其(i)用于以下用途中，(ii)用作用于以下用途中的藥物，或(iii)用于制備用于以下用途中的藥物:(a)治療(例如，人體)；(b)藥物；(c)抑制CMV復(fù)制；
(d)治療或預(yù)防CMV感染，或，(e)治療、預(yù)防一種或多種CMV相關(guān)疾病，或者延遲一種或多種CMV相關(guān)疾病的發(fā)作或進(jìn)展。在這些用途中，重組CMV、其組合物、和/或包含所述CMV或組合物或者由它們組成的疫苗可以任選地與一種或多種抗病毒劑(例如，抗病毒化合物或抗病毒免疫球蛋白；下文描述的聯(lián)合疫苗)聯(lián)合使用。
[0033]本文中使用的術(shù)語“誘導(dǎo)免疫應(yīng)答”表示，條件性復(fù)制缺陷型CMV在施用它的患者(優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選人)中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力，其中所述應(yīng)答包括、但不限于要素(諸如抗體)的產(chǎn)生，所述要素特異性地 結(jié)合、且優(yōu)選地中和CMV和/或造成T細(xì)胞活化?！氨Ｗo(hù)性免疫應(yīng)答”是這樣的免疫應(yīng)答:其減小患者遭受CMV感染(包括原發(fā)性感染、復(fù)發(fā)性感染和/或重疊感染)的可能性，和/或改善至少一種與CMV感染有關(guān)的病理學(xué)，和/或減輕CMV感染的嚴(yán)重程度/持續(xù)時間。
[0034]本文中使用的術(shù)語“免疫學(xué)上有效的量”表示，當(dāng)施用給患者時可以誘導(dǎo)針對CMV的免疫應(yīng)答的免疫原的量，所述免疫應(yīng)答可以保護(hù)患者免于CMV感染(包括原發(fā)性感染、復(fù)發(fā)性感染和/或重疊感染)，和/或改善至少一種與CMV感染有關(guān)的病理學(xué)，和/或減輕患者中CMV感染的嚴(yán)重程度/持續(xù)時間。所述量應(yīng)該足以顯著減小CMV感染的可能性或嚴(yán)重程度?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的動物模型來評估免疫原施用的保護(hù)作用。例如，可以對抗體或細(xì)胞毒性的T細(xì)胞的中和能力或者免疫T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生能力來測定得自施用免疫原的個體的免疫血清或免疫T細(xì)胞。常用于這樣的評價的測定包括、但不限于病毒中和測定、抗病毒抗原ELISA、干擾素-Y細(xì)胞因子ELISA、干擾素-、ELISP0T、細(xì)胞內(nèi)多細(xì)胞因子染色(ICS)和51鉻(ChiOmimium)釋放細(xì)胞毒性測定。還可以使用動物攻擊模型來確定免疫原的免疫學(xué)上有效的量。
[0035]本文中使用的術(shù)語“條件性復(fù)制缺陷型病毒”表示，可以在某些環(huán)境中復(fù)制、但是不可在其它環(huán)境中復(fù)制的病毒顆粒。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過使病毒復(fù)制必需的一種或多種蛋白的去穩(wěn)定，使病毒成為條件性復(fù)制缺陷型病毒。編碼野生型非去穩(wěn)定的必需蛋白的核酸不再存在于條件性復(fù)制缺陷型 病毒中。在一種或多種必需蛋白被去穩(wěn)定的條件下，病毒復(fù)制與不含去穩(wěn)定的必需蛋白的病毒相比下降了優(yōu)選大于50%、75%、90%、95%、99%或100%。但是，在使去穩(wěn)定的必需蛋白穩(wěn)定化的條件下，病毒復(fù)制可以以不含去穩(wěn)定的必需蛋白的CMV的復(fù)制量的優(yōu)選至少75%、80%、90%、95%、99%或100%進(jìn)行。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過與去穩(wěn)定蛋白(諸如FKBP或其衍生物)融合，使一種或多種必需蛋白去穩(wěn)定。這樣的融合蛋白可以通過穩(wěn)定劑(諸如Shield-Ι)的存在而穩(wěn)定化。本文中使用的術(shù)語“rdCMV”表示條件性復(fù)制缺陷型巨細(xì)胞病毒。
[0036]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，由復(fù)制缺陷型病毒誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答與它的活病毒對應(yīng)物相比在程度和/或?qū)挾确矫媸窍嗤幕蚧旧项愃频摹Ｔ谄渌鼉?yōu)選的實(shí)施方案中，通過電子顯微術(shù)分析得到的復(fù)制缺陷型病毒的形態(tài)學(xué)與它的活病毒對應(yīng)物之間是無法區(qū)別的或與其基本上類似。
[0037]本文中使用的術(shù)語“FKBP”表示SEQ ID NO: 11的去穩(wěn)定蛋白。含有FKBP的融合蛋白會被宿主細(xì)胞機(jī)降解。本文中使用的術(shù)語“FKBP衍生物”表示，已經(jīng)被一個或多個氨基酸取代、缺失和/或添加改變的FKBP蛋白或其部分。所述FKBP衍生物當(dāng)與蛋白融合時保留FKBP的基本上所有的去穩(wěn)定性能，且也保留FKBP的被Shield-1穩(wěn)定化的基本上所有的能力。優(yōu)選的FKBP衍生物在指示的氨基酸位置處具有以下取代中的一個或多個:F15S、V24A、H25R、F36V、E60G、M66T、R71G、D100G、D100N、E102G、K105I 和 L106P。具有 F36V 和 L106P取代的FKBP衍生物(SEQ ID NO: 12)是特別優(yōu)選的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼FKBP或FKBP衍生物的核酸含有至少一些在人類中不常用于內(nèi)源FKBP的密碼子。這會降低融合蛋白的FKBP或FKBP衍生物與人基因組中的它的對應(yīng)物重排或重組的可能性。SEQ ID NO: 13的核酸序列使用這樣的密碼子編碼SEID NO: 12。
[0038]本文中使用的術(shù)語“Shield-Ι”或“Shldl”表示，結(jié)合野生型FKBP及其衍生物并作為穩(wěn)定劑起作用的合成小 分子。與F36V衍生物的結(jié)合牢固度是野生型FKBP的約1，000倍(Clackson等人，1998，PNAS 95:10437-42)?？梢院铣蒘hield-1 (基本上如以下文獻(xiàn)中所述:Holt 等人，1993，J.Am.Chem.Soc.115:9925-38 和 Yang 等人，2000，J.Med.Chem.43:1135-42 和 Grimley 等人，2008，Bioorganic & Medicinal ChemistryLetters 18:759),或者可商購得自 Cheminpharma LLC (Farmington, CT)或 ClontechLaboratories, INC.(Mountain View, CA)。Shield-1 的鹽也可以用在本發(fā)明的方法中。Shield-1具有以下結(jié)構(gòu):
【權(quán)利要求】
1.條件性復(fù)制缺陷型CMV，其包含: (a)五聚體gH復(fù)合物，其包含UL128、UL130、UL131、gH和gL;和 (b)核酸，其編碼必需蛋白和去穩(wěn)定蛋白之間的融合蛋白，其中所述必需蛋白選自IE1/2、UL51、UL52、UL79 和 UL84。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的條件性復(fù)制缺陷型CMV，其中所述去穩(wěn)定蛋白是FKBP或FKBP衍生物，其中所述FKBP衍生物是包含一個或多個選自以下的氨基酸取代的FKBP:F15S、V24A、H25R、F36V、E60G、M66T、R71G、D100G、D100N、E102G、K105I 和 L106P。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的條件性復(fù)制缺陷型CMV，其中所述FKBP衍生物是包含氨基酸取代 F36V 和 L106P 的 FKBP。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任一項(xiàng)所述的條件性復(fù)制缺陷型CMV，其中所述必需蛋白是IE1/2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任一項(xiàng)所述的條件性復(fù)制缺陷型CMV，其中所述必需蛋白是UL51。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任一項(xiàng)所述的條件性復(fù)制缺陷型CMV，其中所述CMV包含編碼至少2種融合蛋白的核酸，其中每一所述融合蛋白中的必需蛋白是不同的。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的條件性復(fù)制缺陷型CMV，其中所述融合蛋白之一包含IE1/2。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的條件性復(fù)制缺陷型CMV，其中所述融合蛋白之一包含UL51。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的條件性復(fù)制缺陷型CMV，其中第一種融合蛋白包含IE1/2，和第二種融合蛋白包含UL51。`
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的條件性復(fù)制缺陷型CMV，其中 (a)所述第一種融合蛋白是SEQID NO:1或與SEQ ID NO:1具有至少95%同一性的氨基酸；和 (b)所述第二種融合蛋白是SEQID NO: 3或與SEQ ID NO: 3具有至少95%同一性的氨基酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的條件性復(fù)制缺陷型CMV，其中所述第一種融合蛋白是SEQID NO:1，和所述第二種融合蛋白是SEQ ID NO: 3。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的條件性復(fù)制缺陷型CMV，其中 (a)所述第一種融合蛋白由SEQID NO:2或與SEQ ID NO:2具有至少95%同一性的核酸編碼；和 (b)所述第二種融合蛋白由SEQID N0:4或與SEQ ID N0:4具有至少95%同一性的核酸編碼。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的條件性復(fù)制缺陷型CMV，其中所述第一種融合蛋白由SEQID NO:2編碼，和所述第二種融合蛋白由SEQ ID N0:4編碼。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的條件性復(fù)制缺陷型CMV，其中所述CMV的基因組是SEQIDNO:14。
15.組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-14中的任一項(xiàng)所述的條件性復(fù)制缺陷型CMV和藥學(xué)上可接受的載體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的組合物，其進(jìn)一步包含佐劑。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述佐劑是ISCOMATRIX?。
18.在患者中誘導(dǎo)針對CMV的免疫應(yīng)答的方法，其包括給所述患者施用免疫學(xué)上有效量的權(quán)利要求15-17中的任一項(xiàng)所述的組合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答是患者中針對CMV感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
20.根據(jù)權(quán)利要求18-19中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述CMV感染是原發(fā)性感染、復(fù)發(fā)性感染或重疊感染。
21.根據(jù)權(quán)利要求18-20中的任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者是人。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述患者具有減弱的免疫。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述具有減弱的免疫的患者具有HIV或AIDS，或者是移植受體。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述患者是育齡女性。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-14中的任一項(xiàng)所述的條件性復(fù)制缺陷型CMV在藥物制造中的用途，所述藥物用于在患者中誘導(dǎo)針對CMV感染的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-14中的任一項(xiàng)所述的條件性復(fù)制缺陷型CMV，其用于藥劑來治療患者中的CMV感染。
27.制備根據(jù)權(quán)利要求2-14中的任一項(xiàng)所述的條件性復(fù)制缺陷型CMV的方法，其包括在有Shield-1存在下，在上皮細(xì)胞中繁殖重組CMV。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述上皮細(xì)胞是人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。`
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞是作為登記號CRL-2302保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的ARPE-19細(xì)胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述Shield-1以至少0.5μΜ的濃度存在。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述Shield-1以至少2μΜ的濃度存在。
32.制備權(quán)利要求15-17中的任一項(xiàng)所述的組合物的方法，其包括: (a)在向培養(yǎng)基中加入了Shield-1的情況下，在上皮細(xì)胞上繁殖所述條件性復(fù)制缺陷型CMV ； (b)從所述培養(yǎng)基收集所述條件性復(fù)制缺陷型CMV； (c)從所述條件性復(fù)制缺陷型CMV基本上去除Shield-1;和 (d)將藥學(xué)上可接受的載體加入到所述條件性復(fù)制缺陷型CMV中。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述上皮細(xì)胞是人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞是作為登記號CRL-2302保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的ARPE-19細(xì)胞。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中在步驟(a)過程中，Shield-1以至少0.5μΜ的濃度存在于所述培養(yǎng)基中。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中在步驟(a)過程中，Shield-1以至少2μΜ的濃度存在于所述培養(yǎng)基中。
37.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述去除為通過超速離心或滲濾。
38.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述去除將Shield-1降低至0.?μΜ以下。
39.組合物，其包含在pH5-7之間的緩沖液中的根據(jù)權(quán)利要求1-14中的任一項(xiàng)所述的條件性復(fù)制缺陷型CMV，所述緩沖液包含:(a)15-35 mM之間的組氨酸；和 (b)100-200 mM 之間的 NaCl。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的組合物，其進(jìn)一步包含5-15%之間的蔗糖。
41.根據(jù)權(quán)利要求38-39中的任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述緩沖液在pH6包含25 mM組氨酸和150 mM NaCl。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的組合物，其進(jìn)一步包含9%w/v的蔗糖。
43.SEQ ID NO: 14 的核酸。`
【文檔編號】A61K48/00GK103889462SQ201280053360
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月9日
【發(fā)明者】T-M.付, D.王, M.B.梅迪 申請人:默沙東公司