專利名稱：一種預防帕金森病的中藥組合物及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種預防帕金森病的中藥組合物及其用途，具體地說，是以中草藥為原料制備的中成藥。
背景技術：
帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是中老年人常見的神經系統(tǒng)退行性疾患，主要與黑質致密區(qū)多巴胺能神經元變性缺失及由此造成的黑質紋狀體通路多巴胺遞質減少有關。中醫(yī)認為ro屬于“顫證”，多發(fā)生于中老年“天癸”竭時，“天癸”竭表征腎精匱乏，榮衛(wèi)雙虛，上不養(yǎng)肝木，外不濡筋脈，水不涵木則陰虛陽亢、心悸、汗出、潮熱、煩躁頻發(fā)；筋脈失柔現(xiàn)晨僵、四肢拘攣、震顫、強直、疼痛、運動遲緩。綜觀歷代醫(yī)家的經驗，旁及現(xiàn)代醫(yī)學研究，通過臨證觀察，我們認為，治以益氣化痰、柔肝熄風法。益氣補腎以消痰濁，柔肝善陰平定震顫。經過多年的臨床實踐，一般認為，左旋多巴仍是最有效的預防帕金森病藥物。但左旋多巴長期應用3-5年后，大約5%的H)患者會逐漸產生癥狀波動和(或)運動障礙等左旋多巴的“長期綜合征”，即H)運動并發(fā)癥，加之實驗室發(fā)現(xiàn)高濃度多巴胺(dopamine，DA)和左旋多巴會由于自身氧化產生自由基，可導致神經細胞變性壞死，因此，聯(lián)合其他藥物共同預防H)運動并發(fā)癥十分迫切。近年研究表明，PD發(fā)生與表達Dl受體的直接通路及其下游cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)、ERK等信號轉導通路被激活關系密切，其下游信號轉導蛋白多巴胺和環(huán)磷腺苷調節(jié)的憐酸化蛋白 ~32 (dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein of Mr 32000, DARPP-32)的蛋白Thr75位點磷酸化表達的改變可能參與了運動并發(fā)癥的發(fā)病。目前在H)運動并發(fā)癥的預防方面，主要采用COMT抑制劑、金剛烷胺、DR激動劑、 L-dopa甲酯或乙酯等。如中國專利文獻CN 200880108979. 7，公布日2010年8月18日， 公開了一種“用于改善帕金森病的運動并發(fā)癥或精神癥狀的藥劑”，所述的藥劑具有5-羥色胺IA受體部分激動劑作用，同時對多巴胺D3受體具有激動劑作用，對于在反復給藥左旋多巴時伴隨產生的運動并發(fā)癥具有改善和延遲發(fā)病的效果。但是西藥預防副作用較大，不如中藥預防安全可靠。我國在中醫(yī)藥預防H)方面積累了豐富經驗，總結其預防原則有益氣活血法，育陰潛陽法，平肝熄風法，揉筋熄風法，活血化瘀法和通絡熄風等法則，用于預防 PD的中藥組合物也有多種，但是關于預防ro運動并發(fā)癥的中藥組合物卻很少，如中國期刊 《中華中醫(yī)藥雜志》，2011年6月第26卷第6期，刊出的“補腎活血顆粒預防帕金森病運動并發(fā)癥臨床研究”，公開了補腎活血顆?？梢愿纳艸)患者運動并發(fā)癥癥狀，但是并未充分公開所述的補腎活血顆粒的藥物組成和配比。因此，必須積極探索能有效預防帕金森病運動并發(fā)癥、安全可靠的藥物，但是目前關于這類藥物還未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供一種預防帕金森病的中藥組合物。
本發(fā)明的再一的目的是，提供一種上述中藥組合物的用途。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是
一種預防帕金森病的中藥組合物，它是由下列重量份的原料藥制成天麻10-22份、黃 芪10-23份、熟地黃10-25份、白芍藥10-32份、當歸10-28份、鉤藤15-25份。所述的中藥組合物是由下列重量份的原料藥制成天麻12-18份、黃芪13-18份、 熟地黃13-18份、白芍藥16-26份、當歸12-18份、鉤藤18-22份。所述的中藥組合物是由下列重量份的原料藥制成天麻18份、黃芪18份、熟地黃 18份、白芍藥22份、當歸16份、鉤藤20份。所述的中藥組合物的藥劑是片劑、膠囊劑、顆粒、口服液、合劑或糖漿劑。為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是
所述的中藥組合物在制備預防帕金森病藥物中的應用。本發(fā)明優(yōu)點在于
1、本發(fā)明的中藥組合物其配伍符合中藥“君臣佐使”原則，遵循“益氣化痰、柔肝熄風 法”的治療方法，從病原根本入手，對癥下藥，輔助預防帕金森病效果明顯；
2、本發(fā)明的中藥組合物由純中藥制成，具有無毒副作用、價格低等優(yōu)點，易于被患者接
受；
3、本發(fā)明的中藥組合物藥味數(shù)少，原材料豐富，制備工藝簡單，對環(huán)境友好，在預防帕 金森病中有良好的應用前景。


附圖1是中藥組合物對ro大鼠模型AIM總分的影響。附圖2是中藥組合物對ro大鼠模型劑峰旋轉次數(shù)的影響。附圖3是ro大鼠模型紋狀體區(qū)GRK6的免疫組化圖。附圖4是ro大鼠模型紋狀體區(qū)GRK6的免疫組化柱狀圖。附圖5是大鼠模型紋狀體區(qū)GRK6表達的Western圖譜。附圖6是大鼠模型紋狀體區(qū)GRK6表達的定量圖。附圖7是大鼠模型模型紋狀體區(qū)P -arrestinl的免疫組化圖。附圖8是大鼠模型模型紋狀體區(qū)P -arrestinl表達的Western圖譜。附圖9是大鼠模型紋狀體區(qū)磷酸化DARPP-32 (Thr75)的免疫組化圖。附圖10是大鼠模型紋狀體區(qū)磷酸化DARPP-32 (Thr75)表達的Western圖譜。附圖11是大鼠模型紋狀體區(qū)磷酸化ERK1/2的免疫組化圖。附圖12是大鼠模型紋狀體區(qū)磷酸化ERK1/2表達表達的Western圖譜。
具體實施例方式下面結合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式
作詳細說明。實施例1預防帕金森病的中藥組合物的制備(一)
天麻10份、黃芪23份、熟地黃10份、白芍藥32份、當歸10份、鉤藤25份，常規(guī)方法煎煮。實施例2預防帕金森病的中藥組合物的制備(二)天麻22份、黃芪10份、熟地黃25份、白芍藥10份、當歸28份、鉤藤15份，常規(guī)方法煎煮。實施例3預防帕金森病的中藥組合物的制備(三)
天麻10份、黃芪10份、熟地黃25份、白芍藥32份、當歸10份、鉤藤15份，常規(guī)方法煎煮。實施例4預防帕金森病的中藥組合物的制備(四)
天麻22份、黃芪23份、熟地黃25份、白芍藥10份、當歸28份、鉤藤15份，常規(guī)方法煎煮。實施例5預防帕金森病的中藥組合物的制備(五)
天麻10份、黃芪23份、熟地黃10份、白芍藥10份、當歸10份、鉤藤25份，常規(guī)方法煎煮。實施例6預防帕金森病的中藥組合物的制備(六)
天麻22份、黃芪10份、熟地黃10份、白芍藥32份、當歸28份、鉤藤25份，常規(guī)方法煎煮。實施例7預防帕金森病的中藥組合物的制備(七)
天麻12份、黃芪18份、熟地黃13份、白芍藥26份、當歸12份、鉤藤25份，常規(guī)方法煎煮。實施例8預防帕金森病的中藥組合物的制備(八)
天麻18份、黃芪13份、熟地黃18份、白芍藥16份、當歸18份、鉤藤18份，常規(guī)方法煎煮。實施例9預防帕金森病的中藥組合物的制備(九)
天麻12份、黃芪13份、熟地黃18份、白芍藥26份、當歸12份、鉤藤22份，常規(guī)方法煎煮。實施例10預防帕金森病的中藥組合物的制備(十)
天麻18份、黃芪18份、熟地黃18份、白芍藥22份、當歸16份、鉤藤20份，常規(guī)方法煎煮。需要說明的是，實施例1-10所述的常規(guī)方法煎煮是中藥湯劑常規(guī)的制作方法，即將所述的原料藥加水煎煮成湯劑。實施例11預防帕金森病中藥組合物片劑/膠囊的制備
取實施例1-10任一所述的中藥組合物，加6-10倍量水，煎煮1-3小時，濾出藥汁；再加 6-10倍量水，煎煮O. 5-2小時，濾出藥汁；合并二次煎液，靜置，濾取上清液，濃縮，放冷，加濃縮液2-3倍量酒精，攪拌沉淀過夜；取上清液，濃縮至稠浸膏；加入藥用輔料(按照常規(guī)的方法選用藥用輔料)，真空干燥，粉碎制粒，壓制成片劑或填充裝膠囊。實施例12預防帕金森病中藥組合物顆粒的制備
取實施例1-10任一所述的中藥組合物，加7-10倍量水，煎煮1-3小時，濾出藥汁；再加 6-10倍量水，煎煮O. 5-2小時，濾出藥汁；合并二次煎液，靜置，濾取上清液，濃縮，放冷，加濃縮液2-3倍量酒精，攪拌沉淀過夜；取上清液，濃縮至稠浸膏；加入藥用輔料(按照常規(guī)的方法選用藥用輔料)，真空干燥，粉碎制粒，干燥，整粒，得20g顆粒，分裝IOg/袋。實施例13預防帕金森病中藥組合物合劑/ 口服液/糖漿劑的制備取實施例1-10任一所述的中藥組合物，加6-10倍量水，煎煮1-3小時，濾出藥汁；再加 6-10倍量水，煎煮1-2小時，濾出藥汁；合并二次煎液，靜置，濾取上清液，濃縮，放冷，加濃縮液2-3倍量酒精，攪拌沉淀過夜；取上清液，濃縮至稠浸膏；加適當制藥輔料(按照常規(guī)的方法選用藥用輔料)，制成合劑、口服液或糖漿劑。實施例14預防帕金森病中藥組合物療效的動物實驗一、實驗方法
I.ro大鼠模型制備
取65只大鼠進入實驗,其中5只為假手術組,即sham組,于前腦內側束(right medical forebrain, MFB)注射生理鹽水。腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，嚴格平頭顱位固定大鼠于腦立體定向儀，參照包新民所著大鼠腦立體定向圖譜(DeWire SM, Lefkowitz RJ, Shenoy SKj et al. Beta arrestins and cell signaling. Annu Rev Physiol. 2007， 69: 483-510.)，確定右側前腦內側束坐標①前因后3. 7 mm，矢狀縫右側I. 7 mm，顱骨骨膜下7. 8 mm,門齒線2. 4 mm 前囟后4. 4 mm,矢狀縫右側I. 2 mm,盧頁骨骨膜下7. 8 mm,門齒線2. 4 mm。按上述確定的注射位點鉆孔，用10 μ I的微量注射器抽取6-0HDA 6 μ I (含 O. 2%維生素C的生理鹽水配置，濃度4 μ g/μ 1)，每點注射3μ 1，留針10 min后退針，縫合創(chuàng)面。3周后，大鼠腹腔注射阿樸嗎啡(O. 5 mg / kg)，平均旋轉頻率>7次/min為成功 H)模型。分組與治療
將25只成功的ro模型大鼠隨機分為3大組。(I) ro對照組ro模型大鼠腹腔注射 O. 2%維生素C液29天；(2)西藥處理組腹腔注射左旋多巴甲酯/芐絲肼，注射劑量為50 mg/kg左旋多巴甲酯和25 mg/kg芐絲肼，二者均溶于含O. 2%維生素C的消毒生理鹽水中，2 次/d (上午9點和下午5點),持續(xù)29d ； (3)中藥組合物小劑量組、中藥組合物中劑量組、 中藥組合物大劑量組給予如組(2)中的左旋多巴甲酯/芐絲肼的基礎上分別加用實施例 10制備的中藥組合物，按照50g原料藥濃縮至IOOml的比例煎煮，中藥組合物小劑量組使用劑量為7. 2 ml/kg,中藥組合物中劑量組使用劑量為9 ml/kg,中藥組合物大劑量組使用劑量為10. 8 ml/kg,每日I次灌胃，連續(xù)4周。行為學測定
在治療過程中于第2、8、15、22、29天上午用藥后進行大鼠行為學觀察和評分。AM評定AM分成4個組分(上肢AM、口面部AM、軸性AM和旋轉AM)進行評定，每部分又根據(jù)其有無和嚴重程度分為5個等級(0-4):0無；I持續(xù)時間小于30s ;2持續(xù)時間大于30s， 小于60s ；3持續(xù)時間大于60s，外界刺激可使之停止；4持續(xù)時間大于60s，外界刺激不能使之停止。用藥后每20min評估一次，每次觀察lmin。AM總分按觀察時間內總積分的平均值進行統(tǒng)計，理論上I只大鼠一次用藥后各組分AIM最大評分為4分，總AIM評分為16分。 劑峰旋轉次數(shù)注射左旋多巴后，每5min記錄旋轉次數(shù)，最多的旋轉次數(shù)為劑峰旋轉次數(shù)。免疫組化顯示紋狀體β -arrestinl、GRK6、DARPP-32 (Thr75)和 ERK1/2 的變化結束注射后12h，3%戊巴比妥鈉麻醉，左心室灌注4%多聚甲醛固定，斷頭取腦后相同固
定液中后固定8h，經修塊、梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟后用石蠟包埋。行石蠟切片，切片厚度為5 μ m。石臘切片脫臘至水；3%雙氧水室溫避光孵育5min,以消除內源性過氧化氫酶活性；pH7. 7的lnmol/1乙二胺四乙酸-三羥甲基氨基甲烷-氯化氫(EDTA-Tris-HCl)微波加熱修復；1%牛血清白蛋白室溫封20min ;兔抗鼠GRK6抗體、兔抗鼠β -arrestinl多克隆抗體、兔抗鼠DARPP-32抗體、抗磷酸化DARPP-32 (Thr75)抗體、兔抗大鼠總ERK1/2 和兔抗大鼠磷酸化ERK1/2單克隆抗體4°C濕盒內孵育過夜；滴加稀釋的生物素標記二抗， 37°C孵育20min ;滴加稀釋的辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，37°C孵育20min ;聯(lián)苯二胺 (3, 3 ' -diaminobenzidine tetrahydrochloride, DAB)顯色劑顯色，自來水沖洗，之后脫水、透明、封片。各步驟之間均用O.Olmol/1 TBS充分漂洗，TBS代替一抗作為陰性對照。在顯微鏡下觀察免疫組化切片，各觀察區(qū)隨機取5個不重疊視野，于高倍鏡(10X40)下觀察， 采用0LYMPUS-IX50成相系統(tǒng)拍攝，Image-Pro Plus 5. I圖象處理軟件進行半定量分析，計算陽性細胞指數(shù)(IOD) =陽性細胞面積X校正光密度值(測量區(qū)光密度一背景光密度)。法檢測β -arrestinl、GRK6、DARPP-32 (Thr75)和 ERK1/2 的表達
最后一次注射后3h，3%戊巴比妥鈉麻醉，迅速斷頭取腦，冰上剝離雙側紋狀體，超聲裂解，提取總蛋白。測定蛋白濃度后，置_80°C凍存?zhèn)溆谩?0 μ g蛋白樣本經10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，以電轉膜儀轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF) 膜上。封閉液(5%脫脂奶粉)室溫封閉2h，按照相應濃度稀釋抗GRK6抗體(I 500)、 抗 β-arrestinl 抗體(I 500)、抗總 DARPP-32 抗體(I 1000)或抗磷酸化 DARPP-32 (Thr75)抗體(I 1000)、抗總 ERK1/2 抗體(I 1000)或抗磷酸化 ERK1/2 抗體(I 500) 或抗β-actin (I 1000)，4°C輕搖孵育過夜。次日加入二抗，室溫下?lián)u床孵育I h ;滴加 ECL顯色混合液，Bio-Rad凝膠成像儀曝光、顯像。Western blot圖像采用SmartView2000 圖像分析軟件計算各樣本目的蛋白條帶OD值與面積值的乘積，從而進行蛋白條帶密度定量。統(tǒng)計分析方法
實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13. O統(tǒng)計軟件進行分析。所得計量資料以均數(shù)土標準差(
X 土S)表示，多個樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。以P〈0.05
為差異具有統(tǒng)計學意義。二、實驗結果
I.中藥組合物對ro大鼠模型行為的影響
I.I中藥組合物對ro大鼠模型各組分AIM評分的影響
中藥組合物小劑量組、中藥組合物中劑量組、中藥組合物大劑量組和西藥處理組對F1D 大鼠模型各組分AIM評分的影響結果如表I所示。就口面部AM評分而言，第2天各組間均值無顯著差異。第8、15、22、29天各組間均值差異顯著(F=4. 98、F=22. 70、F=30. 96、F=23. 27，P〈0. 01)。其中，中藥組合物小劑量組在第22天口面部AM評分較西藥處理組降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=2. 50，P〈0. 05)，其余幾天差異均無統(tǒng)計學意義；中藥組合物中劑量組第8、15、22、29天口面部AIM評分較中藥組合物小劑量組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=2. 86、t=3. 80、t=4. 38、t=6. 54，均P〈0. 05);中藥組合物中劑量組與中藥組合物大劑量組比較，僅于第22天中藥組合物大劑量組較中藥組合物中劑量組口面部AM評分降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=2. 50，P〈0. 05)。就上肢AM評分而言，第2、8天各組均值無明顯差異，第15、22、29天各組間均值差異有統(tǒng)計學意義(F=15. 12、F=32. 86、F=35. 80，P〈0. 01)。用藥第2天和第8天中藥組合物小劑量組上肢AM評分與西藥處理組比較無顯著性差異，至用藥第15、22、29天中藥組合物小劑量組上肢AM評分低于西藥處理組，差異有統(tǒng)計學意義(t=4. 45、t=4. 47，均P〈0. 05)。 第15、22、29天中藥組合物中劑量組比中藥組合物小劑量組上肢AM評分明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=3. 40、t=4. 04、t=3. 95，均P〈0. 01)。中藥組合物大劑量組與中藥組合物中劑量組之間比較，差異無統(tǒng)計學差異。就軸向AM評分而言，第15、22、29天各組間均值差異有統(tǒng)計學意義(F=3.30、 F=25. 06、F=36. 41，Ρ〈0· 01)。中藥組合物小劑量組用藥至第22,29天軸向AM值比西藥處理組降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=3. 93、t=3. 04，均P〈0. 05);中藥組合物中劑量組與中藥組合物小劑量組比較，僅于第29天差異有統(tǒng)計學意義(t=3. 05，P<0. 05);中藥組合物大劑量組明顯降低了軸向AIM值，但與中藥組合物中劑量組比較，僅于第29天有差異(t=2. 83， P〈0. 05)，其它時間點差異無統(tǒng)計學差異。就旋轉AM評分而言，第8、15、22、29天各組間均值差異顯著(F=IO. 50、F=Il. 62、 F=18. 92、F=61. 26，P〈0. 01)。中藥組合物小劑量組與西藥處理組旋轉AM評分比較，差異無統(tǒng)計學意義。中藥組合物中劑量組用藥至第15、22、29天，旋轉AIM評分比西藥處理組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=3. 43、t=5. ll、t=7. 63，均P〈0. 01);中藥組合物大劑量組與中藥組合物中劑量組比較，第8、15、29天差異明顯(t=3. 81、t=2. 52、t=3. 58，均P〈0. 05 )。表I中藥組與西藥組AM評分的比較G ±S，分)
權利要求
1.一種預防帕金森病的中藥組合物，其特征在于，它是由下列重量份的原料藥制成 天麻10-22份、黃芪10-23份、熟地黃10-25份、白芍藥10-32份、當歸10-28份、鉤藤15-25 份。
2.根據(jù)權利要求I所述的中藥組合物，其特征在于，它是由下列重量份的原料藥制成 天麻12-18份、黃芪13-18份、熟地黃13-18份、白芍藥16-26份、當歸12-18份、鉤藤18-22 份。
3.根據(jù)權利要求I所述的中藥組合物，其特征在于，它是由下列重量份的原料藥制成 天麻18份、黃芪18份、熟地黃18份、白芍藥22份、當歸16份、鉤藤20份。
4.根據(jù)權利要求1-3任一所述的中藥組合物，其特征在于，所述的中藥組合物的藥劑是片劑、膠囊劑、顆粒、口服液、合劑或糖漿劑。
5.根據(jù)權利要求1-3任一所述的中藥組合物，其特征在于，所述的中藥組合物在制備預防帕金森病藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種預防帕金森病的中藥組合物，它是由下列重量份的原料藥制成天麻10-22份、黃芪10-23份、熟地黃10-25份、白芍藥10-32份、當歸10-28份、鉤藤15-25份。本發(fā)明還涉及上述中藥組合物在制備預防帕金森病中的用途。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明的中藥組合物其配伍符合中藥“君臣佐使”原則，從病原根本入手，對癥下藥，輔助預防帕金森病療效確切；由純中藥制成，具有無毒副作用、價格低等優(yōu)點，易于被患者接受；藥味數(shù)目少，原材料豐富，制備工藝簡單，對環(huán)境友好，在預防帕金森病中有良好的應用前景。
文檔編號A61P25/16GK102600371SQ20121006246
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月12日 優(yōu)先權日2012年3月12日
發(fā)明者劉振國, 吳娜, 袁偉恩, 陳偉, 魏江磊 申請人:上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院