專利名稱：仔豬水腫病毒素亞單位滅活疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種仔豬水腫病毒素亞單位滅活疫苗的生產(chǎn)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是屬于獸用生物制品行業(yè)。
背景技術(shù)：
仔豬水腫病是嚴重阻礙著養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的常見疾病之一，其發(fā)病急，死亡快，死亡率極高，發(fā)病后往往來不及治療就死亡，常造成養(yǎng)殖業(yè)主較大經(jīng)濟損失。經(jīng)過幾十年的深入研究，人們對水腫病的發(fā)病機理有了比較詳細的了解，明確了仔豬水腫病的發(fā)生與產(chǎn)類志賀氏毒素II型變異體(stx2e毒素)的大腸埃希氏菌大腸埃希氏菌(Escherichia coli)的兩個致病因子 ~F18ab 菌毛和 stx2e 毒素密切相關(guān)(Imberechts H, De Greve, Schlicker C, et al. Characterization of F18 fimbrial genes fedE and fedF involved in adhesion and length of enterotoxemic Escherichia coli st rain F107/86[J]. Microb Pat hog S印，1996,21 (3) :183-192.) o F18ab菌毛為黏附因子，可黏附于小腸絨毛膜上從而使細菌得以定居，并大量分泌stx2e毒素，該毒素是仔豬水腫病的直接致病因子，該病的臨床癥狀和病理變化均由其引發(fā)。stx2e毒素是一種蛋白外毒素，不但具有很高致病性，也具有很強的免疫原性，用其制備滅活疫苗可以有效預防仔豬水腫病的發(fā)生(Wieler L H, Franke S，Menge C，et al. Investigations on the immunoresponse during edema disease of piglet s after weaning by using a recombinant B subunit of shiga21ike toxin II e.Dtsch Tierarztl Wochenschr, 1995，102 :40-43.)。stx2e毒素是一種高致病性毒素，臨床分離株往往只需分泌少量的毒素就足以對仔豬致病，甚至致死，因此臨床分離株在人工培養(yǎng)條件下往往很難大量培養(yǎng)出該毒素。我們對原用于產(chǎn)志賀氏菌菌素的培養(yǎng)基進行改進，對培養(yǎng)基的組份和成分含量進行優(yōu)化，大大提高了培養(yǎng)基產(chǎn)stx2e毒素的產(chǎn)量和產(chǎn)毒效率，所生產(chǎn)的stx2e毒素毒性高，滅活后免疫原性強，這為制備高效的預防仔豬水腫病的stx2e毒素亞單位疫苗奠定了堅實的基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，我們進行了仔豬水腫病毒素亞單位疫苗的研制工作。研制結(jié)果表明， 我們研制的亞單位疫苗使用劑量小，免疫效力高，安全性好，對仔豬的生長沒有任何不良影響，為防治仔豬水腫病奠定了堅實的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
一、生產(chǎn)用菌株I.菌株來源制造和檢驗用仔豬水腫病的大腸埃希氏菌(Escherichia coli)EDQD株由本申請人分離、鑒定、保存和供應(yīng)，該菌株已于2011年11月22日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為 CGMCC No. 5484。2.菌株特點
(I)形態(tài)和生化特性本菌株為革蘭氏陰性桿菌，兩端鈍圓，大小為0.4 O. 7umX2 3um;能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇和蔗糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，IMViC試驗(吲噪、甲基紅、V-P、枸橡酸鹽試驗)反應(yīng)為-、+、-、-。(2)培養(yǎng)特性菌種在SB固體培養(yǎng)基上，36 37°C培養(yǎng)20小時，菌落光滑、圓整、濕潤，直徑I 2mm。在SB液體培養(yǎng)基中，36 37°C培養(yǎng)20小時，呈均勻一致混濁。(3)血清學特性用O抗原定型血清進行血清型鑒定，應(yīng)為0139。(4)stx2e毒素毒力鑒定以本菌所提取的stx2e毒素，靜脈注射25 40日齡仔豬， O. 03mg/頭，或腹腔注射體重20g左右昆明小鼠，O. Olmg/只，可使所有試驗仔豬或小鼠發(fā)生以后肢癱瘓、共濟失調(diào)為特征的神經(jīng)癥狀，甚至死亡。二、stx2e毒素亞單位疫苗的制備方法I生產(chǎn)用種子制備將大腸埃希氏菌EDQD株(由青島易邦生物工程有限公司分離、 鑒定、保存)凍干的菌種接種改良SB液體培養(yǎng)基(見附件I)，接種固體瓊脂平板，挑取典型菌落若干，經(jīng)PCR鑒定毒素基因合格后(見附件3)，即可用于接種。2菌液培養(yǎng)采用發(fā)酵培養(yǎng)法對大腸埃希氏菌EDQD株進行培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基為改良SB培養(yǎng)基。3毒素提取采用不同飽和度硫酸銨沉淀方法進行毒素提取。提取毒素重懸與原菌液體積1/20,經(jīng)Bradford法(見附注2)測定蛋白含量，以滅活毒素蛋白含量彡48mg/ml為合格。經(jīng)戊二醛溶液滅活后，置2 8°C保存?zhèn)溆谩?水相配制取滅活檢驗合格的stx2e毒素液，調(diào)整蛋白濃度至48mg/ml，按4%終濃度加入滅菌的吐溫-80，加入配液罐中，開啟攪拌電機，勻速攪拌至吐溫-80完全溶解。5油相制備取注射用白油94份、司本-80 6份和硬脂酸鋁I份加入油相制備罐中，開啟攪拌電機，勻速攪拌，同時開啟導熱油開關(guān)，125°C加熱30分鐘，冷卻后，導入貯油 te中備用。6疫苗乳化取油相2份置于乳化罐內(nèi)，開動電機低速攪拌，同時緩緩加入水相I 份，再以4000r/min攪拌40分鐘。乳化后，取樣IOml,以3000r/min離心15分鐘，若有分
層現(xiàn)象，應(yīng)重復攪拌I次。
具體實施例方式本發(fā)明的實施例進行具體說明I生產(chǎn)用種子制備I. I 一級種子繁殖與鑒定將大腸埃希氏菌(Escherichia coli)EDQD株(CGMCC No. 5484)凍干菌種接種于SB固體培養(yǎng)基(見附件I)，37°C培養(yǎng)18小時，挑取光滑圓整的單個菌落，接種于SB液體培養(yǎng)基中，37 °C振蕩(搖床轉(zhuǎn)速150r/min左右)培養(yǎng)15小時左右。無菌取少量菌液進行stx2e毒素基因的PCR鑒定，如可擴增出特異性基因片段且純檢合格，則向菌液中按15%終濃度加入甘油，混勻后小量分裝，作為一級種子。在_20°C以下保存，使用期不超過6個月。I. 2 二級種子繁殖取一級種子融化后，按1%比例接種于SB培養(yǎng)基中，37°C振蕩 (搖床轉(zhuǎn)速150rpm左右)培養(yǎng)15小時左右。無菌取少量菌液進行stx2e毒素基因的PCR 鑒定，如可擴增出特異性基因片段且純檢合格，即可用于擴大培養(yǎng)。在2 8°C保存，應(yīng)不超過7天。2制苗用stx2e毒素的制備2.1細菌培養(yǎng)按以下條件進行發(fā)酵培養(yǎng)二級種子接種量為3%、通氣流量為 200L/分、攪拌速度為150r/min培養(yǎng)時間為5 7小時、培養(yǎng)溫度為36 37°C、消泡劑為 O. 1%花生油。2. 2 stx2e毒素的提取收獲的菌液經(jīng)連續(xù)流離心機離心，菌泥按O. I克/ml比例重新懸浮于生理鹽水中，于冰裕條件下在超聲波破碎儀上作用至90%以上菌體破碎。破碎菌液經(jīng)連續(xù)流離心機離心，取上清于4°C攪拌條件下，緩慢加入將固體硫酸銨直至達到40% 硫酸銨飽和度，繼續(xù)攪拌2小時，于4°C經(jīng)連續(xù)流離心機離心，棄去沉淀物，于上清中繼續(xù)加入固體硫酸銨至達到60%硫酸銨飽和度，繼續(xù)攪拌2小時，于4°C經(jīng)連續(xù)流離心機離心，沉淀重懸與原菌液體積1/20，經(jīng)戊二醛溶液滅活后，置2 8°C保存?zhèn)溆谩?.3 stx2e毒素提取物毒力試驗以本菌所提取的stx2e毒素，腹腔注射體重20g左右昆明小鼠，O. Olmg/只，可使所有試驗仔豬或小鼠發(fā)生以后肢癱瘓、共濟失調(diào)為特征的神經(jīng)癥狀，甚至死亡。3 stx2e毒素的滅活取制備的毒素液，按O. 1%的終濃度加入分析純戊二醛，于 4°C滅活120小時，其間每隔12小時搖振I次。4°C保存供配苗用。4半成品檢驗4.1無菌檢驗按《中華人民共和國獸藥典》(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二〇一〇年版三部.中國農(nóng)業(yè)出版社，2011，)進行，應(yīng)無菌生長。4. 2 stx2e毒素的滅活檢驗將滅活的stx2e毒素腹腔注射體重30g左右昆明小鼠 4只，O. 2ml/只，觀察7日，以小鼠全部存活為stx2e毒素的滅活合格。4. 3滅活毒素蛋白含量測定采用BradforcK見附件2)法進行，以每毫升滅活毒素蛋白含量>48mg為合格。5疫苗制備5. I水相配制取滅菌的吐溫-80 4份、滅活檢驗合格的水腫毒素液96份，加入配液罐中，開啟攪拌電機，勻速攪拌至吐溫-80完全溶解。5.2油乳制備取注射用白油94份、司本-80 6份和硬脂酸鋁I份加入油相制備罐中，開啟攪拌電機，勻速攪拌，同時開啟導熱油開關(guān)，152°C加熱30分鐘，冷卻后，導入貯油 te中備用。5. 3乳化取油相3份置于乳化罐內(nèi)，開動電機低速攪拌，同時緩緩加入水相I份，再以3500r/min攪拌35分鐘，在終止攪拌前加入I %硫柳汞溶液，終濃度達到O. 01 %。乳化后，取樣3 5ml，以3000r/min離心15分鐘，若有分層現(xiàn)象，應(yīng)重復攪拌I次。6分裝定量分裝，加蓋密封。本發(fā)明所涉及微生物大腸埃希氏菌(Escherichia coli)EDQD株菌已于2011年11月22日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No. 5484。本發(fā)明的積極意義本發(fā)明涉及一種是用于預防仔豬水腫病的stx2e毒素亞單位滅活疫苗的制備方法。本發(fā)明是用產(chǎn)類志賀氏毒素II型變異體(stx2e毒素)的大腸埃希氏菌，接種于適宜培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取stx2e毒素亞單位抗原，滅活后與油佐劑混合乳化制成。用于預防仔豬水腫病。本發(fā)明所涉及的仔豬水腫病的stx2e毒素亞單位滅活疫苗使用劑量小，免疫效力高， 安全性好，對仔豬的生長沒有任何不良影響，為防治仔豬水腫病奠定了堅實的基礎(chǔ)。


圖I分離株stx2e毒素基因擴增結(jié)果。圖2stx2e毒素引起小鼠后肢麻痹和小鼠死亡。實施例II生產(chǎn)用種子制備(I) —級種子繁殖與鑒定將大腸埃希氏菌(Escherichia coli)EDQD株凍干菌種接種SB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)18小時，挑取光滑圓整的單個菌落I個，接種于50ml SB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)15小時左右。取少量菌液進行純粹檢驗，純檢合格后按15%終濃度向菌液中加入甘油，混勻后小量分裝，作為一級種子。在_20°C以下保存。(2) 二級種子繁殖及鑒定取一級種子接種SB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)18小時，挑取光滑圓整的單個菌落I個，接種于50ml SB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)15小時左右。取此培養(yǎng)物3. 6ml，接種于360ml SB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)15小時左右。無菌取少量菌液染色鏡檢，如無雜菌，即可用于擴大培養(yǎng)。2培養(yǎng)基SB液體培養(yǎng)基。3制苗用囷液制備(I)菌液培養(yǎng)采用發(fā)酵培養(yǎng)法對菌株進行培養(yǎng)向C15-2型發(fā)酵罐中加入12000ml 培養(yǎng)基，同時加入消泡劑，通入高溫蒸汽滅菌30分鐘，待培養(yǎng)基溫度降至36 37°C，加入 360ml 二級種子，調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度至37°C，調(diào)節(jié)溶氧濃度為35%，發(fā)酵培養(yǎng)6 7小時。(2)純粹性檢驗按中華人民共和國獸藥典(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二〇一〇年版三部，中國農(nóng)業(yè)出版社，2011，本發(fā)明以下簡稱《中國獸藥典》)進行。(3)毒素提取收獲的菌液經(jīng)連續(xù)流離心機離心，菌泥用0. OlM pH7. 4的PBS重懸成250mg/ml的菌液，于冰浴條件下在超聲波破碎儀上作用至90%以上菌體破碎。破碎菌液經(jīng)連續(xù)流離心機離心，取上清于2 8°C攪拌條件下，緩慢加入固體硫酸銨直至達到40% 硫酸銨飽和度，繼續(xù)攪拌2小時，于2 8°C經(jīng)連續(xù)流離心機離心，棄去沉淀物，于上清中繼續(xù)加入固體硫酸銨至達到60%硫酸銨飽和度,繼續(xù)攪拌2小時,于2 8°C經(jīng)連續(xù)流離心機離心，離心后所得沉淀以0. OlM pH7. 4的PBS溶解即為stx2e毒素粗提物，置_20°C凍存?zhèn)溆谩?4)毒素效價測定I) stx2e毒素粗提物蛋白含量的測定測定方法見附注2。2) stx2e毒素粗提物毒力試驗將stx2e毒素提取物稀釋至lmg/ml，10倍稀釋后，腹腔注射昆明小鼠4只，0. 2ml/只，觀察7日。(5)滅活按終濃度為0. I % (體積百分比)的將分析純戊二醛加到以上制備的 stx2e毒素粗提物中，于2 8°C滅活72小時，其間每隔12小時搖振I次制備成stx2e毒素，于2 8°C保存供配苗用。
4半成品檢驗將滅活后的stx2e毒素經(jīng)腹腔注射體重20g左右昆明小鼠4只，
0.2ml/只，觀察7日。5疫苗制備⑴水相制備取滅活檢驗合格的stx2e毒素，調(diào)整蛋白濃度至48mg/ml，按4% (體積百分比)終濃度加入滅菌的吐溫-80，勻速攪拌至吐溫-80完全溶解。(2)油相由易邦公司白油制備車間提供。(3)乳化取油相2份置于乳化罐內(nèi)，開動電機低速攪拌，同時緩緩加入水相I份， 再以4000r/min攪拌40min。乳化后，取樣3 5ml,以3000r/min離心15min,若有分層現(xiàn)
象，應(yīng)重復攪拌I次。(4)分裝定量分裝，加蓋密封后成為仔豬水腫病毒素亞單位滅活疫苗。6成品檢驗(I)性狀外觀觀察疫苗顏色和性狀。劑型取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，觀察擴散情況以判定疫苗劑型。穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，觀察管底析出的水相量。粘度用Iml吸管(下口內(nèi)徑為I. 2mm，上口內(nèi)徑為2. 7mm)吸取25°C左右疫苗，令其垂直自然流出，記錄流出0. 4ml所需的時間。(2)無菌檢驗按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行，觀察結(jié)果。(3)安全檢驗取14 16日齡左右健康仔豬4頭，每頭頸部肌肉注射2ml，觀察10曰。(4)效力檢驗取體重18 25g昆明小鼠(清潔級)8只，每只皮下或肌肉注射疫苗
0.1ml，另設(shè)非免疫對照小鼠8只。免疫后21天，連同非免疫對照一起，試驗小鼠均用以上制備的未經(jīng)滅活的stx2e毒素粗提物腹腔注射2XMLD劑量，觀察10日。(5)醛類殘留量測定按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行。實施例2I生產(chǎn)用菌種生產(chǎn)、鑒定結(jié)果利用大腸埃希氏菌EDQD株基礎(chǔ)種子生產(chǎn)一級種子 50ml (加入10%甘油后按5ml/瓶分裝，_20°C保存)，純凈檢驗結(jié)果表明，所制備的種子液均無其它細菌、霉菌污染。生產(chǎn)二級種子360ml，二級種子也無其它細菌、霉菌污染。用以上種子批制備了 200901批仔豬水腫病毒素亞單位滅活疫苗，疫苗的制備量是1335ml。2批生產(chǎn)及滅活檢驗結(jié)果仔豬水腫病毒素亞單位滅活疫苗實驗室產(chǎn)品批生產(chǎn)記錄及滅活檢驗匯總表，詳見表I。3成品檢驗結(jié)果仔豬水腫病毒素亞單位滅活疫苗實驗室產(chǎn)品成品檢驗匯總表，詳見表2。表I仔豬水腫病毒素亞單位滅活疫苗批生產(chǎn)及滅活檢驗匯總表
項目200901 批生產(chǎn)菌株EDQD基礎(chǔ)種子代次第六代(Ee)培養(yǎng)基SB
權(quán)利要求
1.一種預防仔豬水腫病的Stx2e毒素亞單位疫苗的制備方法，其特征在于主要包括一下幾個步驟(1)生產(chǎn)用種子制備將凍干的大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)EDQD株菌種接種SB 液體培養(yǎng)基，接種固體瓊脂平板，挑取典型菌落若干，經(jīng)PCR鑒定毒素基因合格后，即可用于接種，該菌株已于2011年11月22日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No.5484 ；(2)菌液培養(yǎng)采用發(fā)酵培養(yǎng)法培養(yǎng)菌液,菌液經(jīng)管式離心機離心,菌泥按O.lg/ml比例重新懸浮于生理鹽水中；(3)毒素提取對重懸菌液進行超聲波裂解，加入40%飽和度硫酸銨，經(jīng)連續(xù)流離心機離心，棄沉淀，上清中繼續(xù)加入度硫酸銨至60%飽和度，經(jīng)連續(xù)流離心機離心，沉淀重懸與原菌液體積1/20，經(jīng)戊二醛溶液滅活后，置2 8°C保存?zhèn)溆茫?4)按常規(guī)礦物油佐劑滅活疫苗的方法配制成礦物油佐劑亞單位疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種是用于預防仔豬水腫病的stx2e毒素亞單位滅活疫苗的制備方法。本發(fā)明是用產(chǎn)類志賀氏毒素II型變異體(stx2e毒素)的大腸埃希氏菌，接種于適宜培養(yǎng)基培養(yǎng)，提取stx2e毒素亞單位抗原，滅活后與油佐劑混合乳化制成。用于預防仔豬水腫病。本發(fā)明所涉及的仔豬水腫病的stx2e毒素亞單位滅活疫苗使用劑量小，免疫效力高，安全性好，對仔豬的生長沒有任何不良影響，為防治仔豬水腫病奠定了堅實的基礎(chǔ)。
文檔編號A61K39/08GK102580071SQ20121004705
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月28日
發(fā)明者馮陽, 孫健, 李金積, 杜元釗, 王福軍, 程增青, 鄒敏, 郭玉廣, 郭莉莉, 馬爽 申請人:青島易邦生物工程有限公司