專利名稱：能中和狂犬病病毒的結(jié)合分子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明特別涉及中和狂犬病病毒的結(jié)合分子。所述結(jié)合分子可用于狂犬病的暴露后預(yù)防中。
背景技術(shù)：
狂犬病是一種幾乎在全世界分布的病毒感染，其主要影響野生動(dòng)物和家畜，但也包括人，導(dǎo)致破壞性的、幾乎不可改變的致命腦炎。估計(jì)每年有超過70000人喪命，其它數(shù)
百萬(wàn)人需要暴露后治療?？袢〔《臼且环N子彈形狀的、有包膜的、單鏈RNA病毒，分類為彈狀病毒科和狂犬病毒屬?？袢〔《镜幕蚪M編碼5種病毒蛋白質(zhì)RNA-依賴性RNA聚合酶(L)、核蛋白 (N)、磷酸化蛋白質(zhì)(P)、位于病毒蛋白包膜內(nèi)側(cè)的基質(zhì)蛋白(M)、及外表面糖蛋白(G)。G蛋白(62_67kDa)是由505個(gè)氨基酸組成的一種I型糖蛋白，具有2_4個(gè)潛在N 糖基化位點(diǎn)，其中僅一或兩個(gè)是依賴于病毒株而糖基化的。G蛋白形成覆蓋病毒粒包膜外表面的突起，已知其誘導(dǎo)病毒中和抗體。狂犬病可以通過被動(dòng)和主動(dòng)免疫兩種方式治療或者預(yù)防。狂犬病暴露后預(yù)防包括迅速將局部傷口進(jìn)行處理并給予被動(dòng)(抗狂犬病免疫球蛋白)和主動(dòng)免疫(疫苗)措施。目前，抗狂犬病免疫球蛋白(RIG)是從狂犬病病毒免疫的人(HRIG)或者狂犬病病毒免疫的馬(ERIG)的血清樣品中制備的。ERIG以及HRIG的缺點(diǎn)是不能獲得足夠的量， 在HRIG情況中太昂貴。另外，使用ERIG可導(dǎo)致不利反應(yīng)，如過敏性休克。污染已知或未知病原體的可能性是與HRIG相關(guān)的另外的關(guān)注。為了克服這些缺點(diǎn)，提議在暴露后預(yù)防中使用能中和狂犬病病毒的單克隆抗體。本領(lǐng)域已知中和狂犬病病毒的鼠單克隆抗體(見 Schumacher et al.，1989)。然而，由于與給予人體鼠抗體相關(guān)的問題導(dǎo)致鼠抗體在體內(nèi)的應(yīng)用受到限制，所述問題如血清半衰期短，不能觸發(fā)某些人效應(yīng)器功能，及在人體中激發(fā)對(duì)鼠抗體的非所需的明顯免疫應(yīng)答(人抗小鼠抗體(HAMA)反應(yīng))。最近描述了中和人狂犬病病毒單克隆抗體(見Dietzschold et al.，1990， Champion et al.，2000，和Hanlon et al. ,2001) 對(duì)于在暴露后預(yù)防中與HRIG同樣有效的人抗狂犬病單克隆抗體而言，應(yīng)使用單克隆抗體混合物。在這種混合物中，每種抗體應(yīng)結(jié)合病毒上的不同表位或位點(diǎn)，以預(yù)防病毒抗性變體的逃避。目前仍非常需要新的具有改良的暴露后預(yù)防潛力的人狂犬病病毒中和單克隆抗體，特別是具有不同表位識(shí)別特異性的抗體。本發(fā)明提供了這種人單克隆抗體，其可用于進(jìn)行多種狂犬病病毒及其中和抗性變體的暴露后預(yù)防的混合物中。附圖描述

圖1示出狂犬病病毒株CVS-Il與E57逃逸病毒(escape virus)的氨基酸序列對(duì)比。在感染后2天收獲病毒感染的細(xì)胞并分離總RNA。產(chǎn)生cDNA并用于DNA測(cè)序。圖中示
4出了含有突變的區(qū)域，以黑體字表示突變。圖IA示出核苷酸序列對(duì)比。氨基酸上面的數(shù)字表示來(lái)自包括信號(hào)肽的狂犬病病毒糖蛋白的氨基酸編號(hào)。圖IB示出氨基酸序列對(duì)比?？袢〔《咎堑鞍椎氖疽鈭D示于上方。黑框表示信號(hào)肽，灰色框表示跨膜結(jié)構(gòu)域。圖1中的序列也由SEQ ID No :130-141表示。圖2示出狂犬病病毒株CVS-Il與EJB逃逸病毒的氨基酸序列對(duì)比。在感染后2 天收獲病毒感染的細(xì)胞并分離總RNA。產(chǎn)生cDNA并用于DNA測(cè)序。圖中示出含有突變的區(qū)域，突變以黑體字表示。圖2A示出核苷酸序列對(duì)比。氨基酸上面的數(shù)字表示來(lái)自包括信號(hào)肽的狂犬病病毒糖蛋白的氨基酸編號(hào)。圖2B示出氨基酸序列對(duì)比?？袢〔《咎堑鞍椎氖疽鈭D示于上方。黑框表示信號(hào)肽，灰色框表示跨膜結(jié)構(gòu)域。圖2中的序列也由SEQ ID No :142-151 表示。圖3示出載體PDV-C06。圖4示出抗狂犬病病毒scFv與稱作CR-57的生物素化的抗狂犬病病毒抗體的競(jìng)爭(zhēng)ELISA。將用純化的狂犬病病毒G蛋白包被的ELISA平板在加入CR_57bio (0. 5 μ g/ml) 之前與各自的scFv保溫。隨后，在有和無(wú)scFv的條件下監(jiān)測(cè)CR-57bio結(jié)合。圖5示出抗狂犬病病毒scFv與稱作CR-57的抗狂犬病病毒抗體的競(jìng)爭(zhēng)ELISA。將用純化的狂犬病病毒G蛋白包被的ELISA平板在加入過量的scFv之前與CR-57 (1 μ g/ml) 保溫。隨后，在有和無(wú)CR-57的條件下監(jiān)測(cè)scFv結(jié)合。圖6示出抗狂犬病病毒G蛋白IgG與稱作CR-57的抗狂犬病病毒抗體的競(jìng)爭(zhēng) ELISA。將G蛋白(ERA毒株)與未標(biāo)記的IgG(在X軸上示出)保溫。加入生物素化的 CR57 (CR57bio)，使之與G蛋白結(jié)合，然后利用鏈霉親和素-HRP顯色。ELISA信號(hào)以單獨(dú)的 CR57bio結(jié)合百分比示出。圖7示出抗狂犬病病毒G蛋白IgG與稱作CR-57的抗狂犬病病毒抗體的競(jìng)爭(zhēng)FACS 分析。將表達(dá)G蛋白(ERA毒株)的PER. C6細(xì)胞與未標(biāo)記的IgG(在X-軸上示出)保溫。 加入生物素化的CR57(CR57bio)，使之與G蛋白表達(dá)細(xì)胞結(jié)合，然后利用鏈霉親和素-PE顯色。FACS信號(hào)以單獨(dú)的CR57bio結(jié)合百分比示出。圖8示出CVS-Il與E98逃逸病毒的氨基酸序列對(duì)比。在感染后2天收獲病毒感染的細(xì)胞并分離總RNA。產(chǎn)生cDNA并用于DNA測(cè)序。圖中示出含有點(diǎn)突變的區(qū)域，突變以黑體字表示。圖8A示出核苷酸序列對(duì)比。核苷酸上面的數(shù)字表示無(wú)信號(hào)肽序列的狂犬病病毒糖蛋白開放讀框的突變的核苷酸(以黑體字表示)。圖8B示出氨基酸序列對(duì)比。氨基酸上面的數(shù)字表示無(wú)信號(hào)肽序列的狂犬病病毒糖蛋白的突變的氨基酸(以黑體字表示)。圖9示出123個(gè)狂犬病街毒的系統(tǒng)樹(123個(gè)狂犬病病毒G糖蛋白序列，鄰接法 (Neighbor joining)，Kimura-2-參數(shù)方法，靴值(bootstrap) 500)。黑體字表示在 E98 逃逸病毒中觀察到的具有N > D突變的病毒。圖10示出狂犬病糖蛋白上的中和表位。圖中示出了狂犬病病毒糖蛋白的示意圖， 描述了包括新的CR57表位的抗原位點(diǎn)。信號(hào)肽(19個(gè)氨基酸)和跨膜結(jié)構(gòu)域以黑框表示。 圖中示出了二硫鍵。氨基酸編號(hào)得自減去信號(hào)肽序列的成熟蛋白質(zhì)。發(fā)明描述下文闡述了對(duì)本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)進(jìn)行的定義。定義
結(jié)合分子如本文所用，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合分子”是指完整的免疫球蛋白，包括單克隆抗體，如嵌合的、人源化的或者人單克隆抗體，或者是指包含與完整免疫球蛋白競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合免疫球蛋白的結(jié)合配偶體(如狂犬病病毒或其片段，例如G蛋白)的免疫球蛋白片段的抗原結(jié)合和/或可變結(jié)構(gòu)域。無(wú)論結(jié)構(gòu)如何，抗原結(jié)合片段均與完整免疫球蛋白所識(shí)別的相同抗原結(jié)合。抗原結(jié)合片段可包含一種肽或者多肽，所述肽或者多肽包含所述結(jié)合分子的氨基酸序列的至少 2、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200 或者至少250個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基。本文所用術(shù)語(yǔ)“結(jié)合分子”包括本領(lǐng)域已知的所有免疫球蛋白類和亞類。根據(jù)其重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，結(jié)合分子可以分為5個(gè)主要類別的完整抗體IgA、IgD、IgE、 IgG和IgM，這些類別有幾個(gè)可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如IgAl、IgA2、IgGl、IgG2、 IgG3 禾口 IgG4。抗原結(jié)合片段包括Fab、F(ab' )、F(ab' )2、Fv、dAb、Fd、互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價(jià)單鏈抗體、單鏈?zhǔn)删w抗體、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體 (triabody)、四鏈抗體(tetrabody)、(多)肽，其含有至少足以賦予所述(多)肽特異性抗原結(jié)合的免疫球蛋白片段，等等。上述片段可以合成產(chǎn)生或者通過酶或化學(xué)切割完整免疫球蛋白而產(chǎn)生或者通過重組DNA技術(shù)遺傳工程化。生產(chǎn)方法為本領(lǐng)域所熟知，例如 Antibodies :A Laboratory Manual,Edited by:E. Harlow and D,Lane (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 所述，所述文獻(xiàn)在此并入作參考。結(jié)合分子或其抗原結(jié)合片段可具有一或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。如果有一個(gè)以上的結(jié)合位點(diǎn)，則所述結(jié)合位點(diǎn)可以是相同或者不同的。所述結(jié)合分子可以是裸露的或者未綴合的結(jié)合分子，但也可以是免疫綴合物的一部分。裸露的或者未綴合的結(jié)合分子是指與效應(yīng)物(effector)部分或者標(biāo)記如毒性物質(zhì)、 放射性物質(zhì)、脂質(zhì)體、酶未綴合的、可操縱地連接的或者另外物理或者功能結(jié)合的結(jié)合分子。應(yīng)理解裸露的或者未綴合的結(jié)合分子不排除已經(jīng)穩(wěn)定化的、多聚體化的、人源化的或者以任何其它方式操縱的結(jié)合分子，除了與效應(yīng)物部分或標(biāo)記附著。因此，所有翻譯后修飾的裸露和未綴合結(jié)合分子均包括在內(nèi)，包括所述修飾是在產(chǎn)生天然結(jié)合分子的細(xì)胞環(huán)境中進(jìn)行的，通過產(chǎn)生重組結(jié)合分子的細(xì)胞產(chǎn)生的及在最初制備結(jié)合分子后經(jīng)人工導(dǎo)入的。當(dāng)然， 術(shù)語(yǔ)裸露的或者未綴合的結(jié)合分子不排除結(jié)合分子在給予機(jī)體后與效應(yīng)細(xì)胞和/或分子形成功能性結(jié)合的能力，一些這種相互作用是發(fā)揮生物學(xué)作用必需的。因此，缺少相關(guān)的效應(yīng)基團(tuán)或者標(biāo)記用于定義在體外而非在體內(nèi)的裸露的或者未綴合的結(jié)合分子。互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)本文所用術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)決定區(qū)”是指結(jié)合分子如免疫球蛋白的可變區(qū)內(nèi)的序列，其通常在很大程度上提供在形態(tài)和電荷分布上與抗原識(shí)別的表位互補(bǔ)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。CDR區(qū)域可以特異于線性表位、不連續(xù)表位、或者蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)片段的構(gòu)象表位，以其天然構(gòu)象呈遞在蛋白質(zhì)上或者在一些情況中作為變性的蛋白質(zhì)(例如在SDS中溶解)的構(gòu)象呈遞在蛋白質(zhì)上。表位也可以由蛋白質(zhì)的翻譯后修飾組成。功能變體如本文所用術(shù)語(yǔ)“功能變體”是指這樣的結(jié)合分子，其包含一種核苷酸和/或氨基酸序列，該序列與親代結(jié)合分子的核苷酸和/或氨基酸序列相比有一或多個(gè)核苷酸和/或氨基酸發(fā)生改變，并仍能與親代結(jié)合分子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合結(jié)合配偶體，例如狂犬病病毒或其片段。 換句話說(shuō)，親代結(jié)合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修飾不顯著影響或者改變由該核苷酸序列編碼的或者包含該氨基酸序列的結(jié)合分子的結(jié)合特性，即所述結(jié)合分子仍能識(shí)別并結(jié)合其靶位。所述功能變體可具有保守序列修飾，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。這些修飾可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)導(dǎo)入，如定點(diǎn)誘變和隨機(jī)PCR介導(dǎo)的誘變，并且可以包含天然以及非天然的核苷酸和氨基酸。保守氨基酸取代包括其中氨基酸殘基由具有相似結(jié)構(gòu)或者化學(xué)性質(zhì)的氨基酸殘基置換的取代。本領(lǐng)域已經(jīng)定義了具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、 谷氨酸)，具有無(wú)電荷的極性側(cè)鏈氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非極性側(cè)鏈氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-分支側(cè)鏈氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳族側(cè)鏈氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本領(lǐng)域技術(shù)人員明了也可以應(yīng)用除了上述所用氨基酸分類之外的氨基酸殘基家族的其它分類。此外，變體可以具有非保守的氨基酸取代，例如用具有不同結(jié)構(gòu)或者化學(xué)性質(zhì)的氨基酸殘基置換氨基酸。 相似的次要變化也可以包括氨基酸缺失或者插入或者這兩者。確定哪個(gè)氨基酸殘基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫學(xué)活性的指導(dǎo)可以使用本領(lǐng)域熟知的計(jì)算機(jī)程序發(fā)現(xiàn)。核苷酸序列中的突變可以是在一個(gè)基因座的單一改變(點(diǎn)突變)，如轉(zhuǎn)換或者顛換突變，或者在一個(gè)基因座插入、缺失或者改變多個(gè)核苷酸。另外，可以在核苷酸序列內(nèi)的許多基因座進(jìn)行一或多個(gè)改變。所述突變可以通過本領(lǐng)域已知的任何合適方法進(jìn)行。宿主如本文所用術(shù)語(yǔ)“宿主”是指其中已經(jīng)導(dǎo)入載體如克隆載體或者表達(dá)載體的生物體或者細(xì)胞。所述生物體或者細(xì)胞可以是原核或者真核生物或者細(xì)胞。應(yīng)理解該術(shù)語(yǔ)不僅是指特定生物體或細(xì)胞，也是指這種生物體或細(xì)胞的子代。因?yàn)槟承┬揎椨捎谕蛔兓蛘攮h(huán)境影響而可以在隨后的世代中出現(xiàn)，這種子代事實(shí)上與親代生物體或者細(xì)胞也許不同，但是仍包括在本文所用術(shù)語(yǔ)“宿主”范圍內(nèi)。A術(shù)語(yǔ)“人”當(dāng)用于本文所述結(jié)合分子時(shí)，是指直接衍生自人的分子或者基于人序列的分子。當(dāng)結(jié)合分子衍生自或者基于人序列并隨后被修飾時(shí)，在本說(shuō)明書中仍認(rèn)為是人。換句話說(shuō)，術(shù)語(yǔ)人當(dāng)用于結(jié)合分子時(shí)是包括具有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的結(jié)合分子，其基于在人或人淋巴細(xì)胞中出現(xiàn)或不出現(xiàn)的或者是以修飾的形式出現(xiàn)或者不出現(xiàn)的可變區(qū)或者恒定區(qū)。因此，人結(jié)合分子可包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基，包含取代和/或缺失(例如通過體外隨機(jī)或者位點(diǎn)特異性誘變或者體內(nèi)體細(xì)胞突變而導(dǎo)入的突變)。本文所用術(shù)語(yǔ)“基于”是指核酸序列可以精確地從模板拷貝或者具有較少突變，例如通過易錯(cuò)PCR方法或者與模板精確匹配或者具有較少修飾而合成產(chǎn)生?；谌诵蛄械陌牒铣煞肿釉诒疚闹幸舱J(rèn)為是人。單克隆抗體如本文所用術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指單一分子組分即一級(jí)結(jié)構(gòu)即具有單一氨基酸序列的抗體分子制品。單克隆抗體展示對(duì)于特定表位的單一結(jié)合特異性和親和性。因此， 術(shù)語(yǔ)“人單克隆抗體”是指展示單一結(jié)合特異性的抗體，其具有衍生自或者基于人種系免疫球蛋白序列或者衍生自完全合成的序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。制備單克隆抗體的方法與本發(fā)明不相關(guān)。核酸分子如本文所用術(shù)語(yǔ)“核酸分子”是指多聚體形式的核苷酸，包括RNA、cDNA、基因組 DNA的有義和反義鏈，及上述分子的合成形式與混合的聚合物。核苷酸是指核糖核苷酸、 脫氧核苷酸或者任一類型核苷酸的修飾形式。該術(shù)語(yǔ)也包括DNA的單鏈和雙鏈形式。另外，多核苷酸可包括天然發(fā)生的核苷酸或者通過天然發(fā)生的和/或非天然發(fā)生的核苷酸鍵連接在一起的修飾的核苷酸或者這兩者。所述核酸分子可以經(jīng)化學(xué)或者生物化學(xué)修飾或者可以含有非天然的或者衍生的核苷酸堿基，這易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員所意識(shí)到。這種修飾包括例如標(biāo)記、甲基化、用類似物取代一或多個(gè)天然發(fā)生的核苷酸、核苷酸間修飾 (internucleotide modification)如無(wú)電荷的鍵(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸等)、帶電荷的鍵(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、懸垂部分(pendent moiety)(例如多肽)、嵌入劑(例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)、螯合劑、烷化劑及修飾的鍵(例如 α端基異構(gòu)核酸等)。該術(shù)語(yǔ)還包括任何拓?fù)錁?gòu)象，包括單鏈、雙鏈、部分雙鏈、三鏈、發(fā)夾、 環(huán)形和扣鎖構(gòu)象。該術(shù)語(yǔ)還包括合成的分子，其模擬多核苷酸通過氫鍵及其它化學(xué)相互作用結(jié)合指定序列的能力。本領(lǐng)域已知這種分子，并包括例如其中肽鍵代替分子主鏈中的磷酸鍵的分子。除非特別指出，則提及核酸序列時(shí)涵蓋其互補(bǔ)體。因此，提及具有特定序列的核酸分子時(shí)應(yīng)理解涵蓋其互補(bǔ)鏈及其互補(bǔ)序列?；パa(bǔ)鏈也可用于例如反義治療、雜交探針和PCR引物中。藥物可接受的賦形劑“藥物可接受的賦形劑”是指與活性分子如藥物、制劑或者結(jié)合分子組合以制備合適或者方便劑型的任何惰性物質(zhì)?！八幬锟山邮艿馁x形劑”是以應(yīng)用的劑量和濃度應(yīng)用時(shí)對(duì)于受者(recipient)是無(wú)毒的、或者至少其毒性對(duì)于其指定用途是可接受的賦形劑，并且與包含藥物、制劑或者結(jié)合分子的制劑的其它成分相容。暴露后預(yù)防“暴露后預(yù)防(PEP)”是針對(duì)可能暴露于狂犬病動(dòng)物的人而言?？赡艿谋┞栋ㄒ┞?即通過牙齒對(duì)皮膚的任何穿透)，包括動(dòng)物咬傷及非咬傷暴露。非咬傷暴露包括在實(shí)驗(yàn)室或者洞穴中暴露于大量霧狀散開的狂犬病病毒及移植了死于狂犬病的患者角膜的手術(shù)受者。開放性創(chuàng)傷、擦傷、粘膜的污染，或者理論上被狂犬病動(dòng)物唾液或者其它潛在感染性物質(zhì)(如神經(jīng)組織)擦傷也構(gòu)成了非咬傷暴露。其它自身接觸，如撫摸狂犬病動(dòng)物及與狂犬病動(dòng)物的血液、尿液或者糞便接觸不構(gòu)成暴露，不是預(yù)防的指征。PEP應(yīng)在暴露后立即進(jìn)行。如果未暴露則無(wú)需進(jìn)行暴露后預(yù)防。在所有暴露后預(yù)防方案中，除了先前已經(jīng)免疫接種的人之外，均應(yīng)同時(shí)進(jìn)行主動(dòng)和被動(dòng)免疫。特異性結(jié)合如本文所用術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”在描述結(jié)合分子例如抗體與其結(jié)合配偶體例如抗原的相互作用時(shí)，是指該相互作用依賴于結(jié)合配偶體上特殊結(jié)構(gòu)的存在，例如抗原決定簇或者表位。換句話說(shuō)，抗體優(yōu)先結(jié)合或者識(shí)別結(jié)合配偶體，甚至當(dāng)結(jié)合配偶體存在于其它分子或者生物體的混合物時(shí)也如此。這種結(jié)合是通過共價(jià)或者非共價(jià)相互作用或者這兩者而介導(dǎo)的。再換句話說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”是指免疫特異性結(jié)合一種抗原或其片段而非免疫特異性結(jié)合其它抗原。免疫特異性結(jié)合抗原的結(jié)合分子可以較低的親和性結(jié)合其它肽或者多肽，例如通過放射性免疫分析(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、BIAC0RE或者本領(lǐng)域已知的其它方法確定。免疫特異性結(jié)合抗原的結(jié)合分子或其片段可以與相關(guān)抗原交叉反應(yīng)。 優(yōu)選地，免疫特異性結(jié)合抗原的結(jié)合分子或其片段與其它抗原不交叉反應(yīng)。治療有效量術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指有效進(jìn)行狂犬病暴露后預(yù)防的本文結(jié)合分子的量。^^術(shù)語(yǔ)“載體”是指其中可以插入第二種核酸分子以導(dǎo)入宿主中的核酸分子，在所述宿主中其將被復(fù)制，在一些情況中被表達(dá)。換句話說(shuō)，載體能轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的核酸分子?？寺≥d體以及表達(dá)載體涵蓋在如本文所用術(shù)語(yǔ)“載體”中。載體包括但非限于質(zhì)粒、粘粒、細(xì)菌人工染色體(BAC)和酵母人工染色體(YAC)及衍生自噬菌體或者植物或者動(dòng)物(包括人) 病毒的載體。載體包含由指定宿主識(shí)別的復(fù)制起點(diǎn)，在表達(dá)載體情況中包含啟動(dòng)子及由宿主識(shí)別的其它調(diào)節(jié)區(qū)域。含有第二種核酸分子的載體例如通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或者通過利用細(xì)菌或者病毒進(jìn)入機(jī)制而導(dǎo)入細(xì)胞中。本領(lǐng)域已知將核酸導(dǎo)入細(xì)胞中的其它方式，例如對(duì)于植物細(xì)胞通常使用電穿孔或者粒子轟擊方式等。將核酸導(dǎo)入細(xì)胞中的方法依賴于細(xì)胞類型等因素。這對(duì)于本發(fā)明無(wú)關(guān)緊要。某些載體在其被導(dǎo)入的宿主中能自發(fā)復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的載體可以在細(xì)菌中復(fù)制)。其它載體基于導(dǎo)入宿主而可以整合進(jìn)宿主基因組中，從而隨著宿主基因組而復(fù)制。發(fā)明概述本發(fā)明提供了能特異性結(jié)合并中和狂犬病病毒的結(jié)合分子。此外，本發(fā)明涉及至少編碼這些結(jié)合分子的結(jié)合區(qū)域的核酸分子。本發(fā)明進(jìn)一步提供了本發(fā)明的結(jié)合分子對(duì)處于發(fā)生得自狂犬病病毒的疾病危險(xiǎn)中的對(duì)象進(jìn)行暴露后預(yù)防中的應(yīng)用。發(fā)明詳述本發(fā)明第一方面包括能特異性結(jié)合狂犬病病毒的結(jié)合分子。優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合分子還具有狂犬病病毒中和活性。優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合分子是人結(jié)合分子?；蛘?，它們也可以是其它動(dòng)物的結(jié)合分子?？袢〔《臼强袢《緦俚囊徊糠?。狂犬病毒屬共包括11 個(gè)基因型狂犬病病毒(基因型1) >Lagos蝙幅病毒(基因型2、,Mokola病毒(基因型3)、 Duvenhage病毒(基因型4)、歐洲蝙幅狂犬病毒1 (基因型5)、歐洲蝙幅狂犬病毒2 (基因型 6)、澳大利亞蝙幅狂犬病毒(基因型7)、Aravan病毒(基因型8)、Khujand病毒(基因型 9)、Irkut病毒(基因型10)和Wfest Caucasian病毒(基因型11)。除了結(jié)合狂犬病病毒， 本發(fā)明的結(jié)合分子還能結(jié)合狂犬病毒屬的其它基因型。優(yōu)選地，所述結(jié)合分子還能中和狂犬病毒屬的其它基因型。此外，本發(fā)明的結(jié)合分子甚至能結(jié)合和/或中和彈狀病毒科除了狂犬病毒屬之外的病毒。這個(gè)科包括細(xì)胞彈狀病毒屬(cytorhabdovirus) ^phemerovirus 屬、狂犬病毒屬、核彈狀病毒屬(nucleorhabdovirus)、彈狀病毒屬(rhabdovirus)和 vesiculovirus 屬。所述結(jié)合分子能特異性結(jié)合天然形式或者滅活/減毒形式的狂犬病病毒。狂犬病病毒的滅活可以通過用如下方式處理而進(jìn)行β-丙內(nèi)酯(BPL)處理(White and Chappel,1982)、在56°C加熱30分鐘以上、、射線照射、用乙酰乙撐亞胺或者乙撐亞胺處理或者用抗壞血酸和硫酸銅處理72小時(shí)(Madhusudana et al.，2004)。也可以使用本領(lǐng)域已知的普通病毒滅活方法，例如巴氏消毒法(濕熱)、干熱處理、蒸汽熱處理、低PH處理、有機(jī)溶劑 /去污劑處理、納米過濾；也可以使用UV光照射。優(yōu)選地，通過用β-丙內(nèi)酯(BPL)處理進(jìn)行滅活。測(cè)試狂犬病病毒是否仍具有感染性或者部分或全部滅活的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，可見于Laboratory techniques in rabies，Edited by :F. -X Meslin,M. M. Kaplan and H.Koprowski(1996),4th edition，Chapter 36，World Health Organization,Geneva 所述。所述結(jié)合分子也能特異性結(jié)合狂犬病病毒的一或多個(gè)片段，如衍生自狂犬病病毒或者用狂犬病病毒蛋白和/或(多)肽轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的一或多種蛋白質(zhì)和/或(多)肽制品。 對(duì)于治療和/或預(yù)防方法如狂犬病病毒的暴露后預(yù)防方法而言，所述結(jié)合分子優(yōu)選能特異性結(jié)合狂犬病病毒的表面易接近的蛋白如M蛋白(見Ameyama et al. 2003)或者G蛋白。 對(duì)于診斷目的，人結(jié)合分子還能特異性結(jié)合不在狂犬病病毒表面上呈遞的蛋白質(zhì)。多種已知狂犬病病毒株的表面可接近的和內(nèi)部蛋白質(zhì)的氨基酸序列可見于EMBL數(shù)據(jù)庫(kù)和/或其它數(shù)據(jù)庫(kù)。優(yōu)選地，所述片段至少包含本發(fā)明的人結(jié)合分子識(shí)別的抗原決定簇。本文所用術(shù)語(yǔ)“抗原決定簇”是能以足夠高親和性結(jié)合本發(fā)明的人結(jié)合分子以形成可檢測(cè)的抗原結(jié)合分子復(fù)合物的一個(gè)部分，如狂犬病病毒(多)肽、(糖)蛋白、或其類似物或片段。本發(fā)明的結(jié)合分子可以是完整的免疫球蛋白分子，如多克隆或單克隆抗體，特別是人單克隆抗體，或者所述結(jié)合分子可以是抗原結(jié)合片段，包括但非限于Fab、F(ab')、 F(ab' )2、Fv、dAb、Fd、互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價(jià)單鏈抗體、單鏈?zhǔn)删w抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體及含有至少免疫球蛋白的一個(gè)片段的(多)肽，該片段足以賦予對(duì)狂犬病病毒或其片段的特異性抗原結(jié)合。本發(fā)明的結(jié)合分子可以非分離的形式或者以分離的形式應(yīng)用。此外，本發(fā)明的結(jié)合分子可以單獨(dú)應(yīng)用或者于包含至少一種人結(jié)合分子(或者其變體或片段)的混合物中應(yīng)用。換句話說(shuō)，所述結(jié)合分子可以組合應(yīng)用， 例如作為包含兩或多種結(jié)合分子、其變體或者片段的藥物組合物。例如，具有狂犬病病毒中和活性的結(jié)合分子可以在單一治療中組合以達(dá)到所需的預(yù)防、治療或者診斷作用。RNA病毒如狂犬病病毒在病毒復(fù)制期間利用其自身的RNA聚合酶。這些RNA聚合酶趨于易錯(cuò)。這樣在病毒感染期間導(dǎo)致所謂的“準(zhǔn)種”形成。每個(gè)準(zhǔn)種均具有獨(dú)特地RNA基因組，可導(dǎo)致病毒蛋白質(zhì)的氨基酸組成中的差異。如果這種突變發(fā)生在病毒結(jié)構(gòu)蛋白中，則該病毒由于T或B細(xì)胞表位中的變化而從宿主免疫系統(tǒng)中逃避。當(dāng)用兩種結(jié)合分子如人單克隆抗體處理個(gè)體時(shí)發(fā)生這種情況的可能性高于用多克隆抗體混合物(HRIG)處理個(gè)體的情況。因此，用兩種人單克隆抗體混合物治療狂犬病的先決條件是這兩種抗體識(shí)別其靶抗原即狂犬病病毒糖蛋白上的不重疊、不競(jìng)爭(zhēng)的表位。從而使狂犬病逃逸病毒發(fā)生的機(jī)會(huì)降至最低。結(jié)果，本發(fā)明的結(jié)合分子優(yōu)選能與狂犬病病毒的不同的、不重疊的、不競(jìng)爭(zhēng)的表位反應(yīng)，如狂犬病病毒G蛋白上的表位。結(jié)合分子的混合物可進(jìn)一步包含至少一種其它的治療劑，如適于狂犬病暴露后預(yù)防的藥物。典型地，本發(fā)明的結(jié)合分子可以結(jié)合其結(jié)合配偶體，即狂犬病病毒或其片段如狂犬病病毒蛋白，親和性常數(shù)(Kd值)低于0. 2X 101、1. OX 101、1. OX 10、、1. OX 10- ，優(yōu)選低于1.0X101，更優(yōu)選低于1.0X10_9M，更優(yōu)選低于Ι.ΟΧΙΟ,Μ，更優(yōu)選低于 ^父^^丸特別優(yōu)選低于^父川—1、。所述親和性常數(shù)可以根據(jù)抗體同種型而變化。例如，對(duì)于IgM同種型的親和性結(jié)合是指至少大約1. OX 10_7Μ的結(jié)合親和性。親和性常數(shù)可例如使用表面等離子共振方法測(cè)定，即通過檢測(cè)生物傳感器基質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)濃度的變化分析實(shí)時(shí)生物特異性相互作用的光學(xué)現(xiàn)象，例如使用BIAC0RE系統(tǒng)(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden)。本發(fā)明的結(jié)合分子可以結(jié)合純化/分離形式的或者非純化/非分離形式的狂犬病病毒。所述結(jié)合分子可以結(jié)合溶解形式的狂犬病病毒，例如樣品中的狂犬病病毒，或者可以結(jié)合與載體或者底物例如微滴定平板、膜和珠等結(jié)合或附著于其的狂犬病病毒。載體或者底物可以由玻璃、塑料(例如聚苯乙烯)、多糖、尼龍、硝化纖維素或者特氟隆等制成。這種支持物的表面可以是實(shí)心的或者有孔的，并且可以是任何方便使用的形狀?；蛘?，所述結(jié)合分子還可以結(jié)合狂犬病病毒片段，如狂犬病病毒的蛋白質(zhì)或者(多)肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子能特異性結(jié)合狂犬病病毒G蛋白或其片段。所述狂犬病病毒蛋白或(多) 肽可以是溶解形式或者是與上述載體或底物結(jié)合或者附著于其的狂犬病病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用G蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可以用作所述結(jié)合分子的結(jié)合配偶體。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子中和狂犬病病毒的感染性。 這可以通過阻止狂犬病病毒與其宿主細(xì)胞上的受體附著而實(shí)現(xiàn)，所述受體如鼠P75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白受體、神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(CD56)和乙酰膽堿受體，或者通過抑制RNA釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中或者阻止RNA轉(zhuǎn)錄或者翻譯而實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)特殊實(shí)施方案中，與不存在所述結(jié)合分子的條件下狂犬病病毒感染宿主細(xì)胞相比，本發(fā)明的結(jié)合分子阻止狂犬病病毒感染宿主細(xì)胞至少 99%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、60%、50%、45%、40%、45%、35%、30%、 25%、20%，或者至少 10%。中禾口可鑼Ij如 Laboratory techniques in rabies, Edited by F. -X Meslin, Μ. M. Kaplan and H. Koprowski(1996),4th edition, Chapters 15-17, World Health Organization, Geneva所述進(jìn)行測(cè)定。此外，本發(fā)明的人結(jié)合分子可以是能有助于包膜的狂犬病病毒裂解的補(bǔ)體固定結(jié)合分子(complement fixing binding molecule) 0 本發(fā)明的人結(jié)合分子也可以作為調(diào)理素和增大對(duì)狂犬病病毒的吞噬作用，通過促進(jìn)其由Fc 或Ob受體攝取或者通過凝集狂犬病病毒使其更易于被吞噬而實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含至少一個(gè)⑶R3區(qū)域，其包含選自如下的氨基酸序列SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5,SEQ ID NO 6,SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10,SEQ ID NO :11、 SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO 23和SEQ ID NO :24。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述⑶R3區(qū)域是重鏈⑶R3區(qū)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含一條可變重鏈，其基本上包含選自如下的氨基酸序列:SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO30,SEQ ID N0:31、SEQ ID NO 32,SEQ ID NO 33,SEQ ID NO34,SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41、 SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO 47,SEQ ID N0:48和SEQ ID NO :49。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含一條可變重鏈，其基本上包含SEQ ID NO 335的第1-119位氨基酸的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子包含一條包含SEQ ID N0:26所示氨基酸序列的可變重鏈和包含SEQ ID NO :50所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO 27所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO :51所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO 所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO :52所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO : 所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO :53所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO :30所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO 54所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO 31所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO :55所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO :32所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO :56所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO :33所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO :57所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO 34所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO :58所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO :35所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO 59所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO 36所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO :60所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO :37所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO :61所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO :38所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO :62所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO :39所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO :63所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO :40所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO 64所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO 41所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO :65所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO :42所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO :66所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO :43所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO :67所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO :44所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO :68所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO :45所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO :69所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO :46所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO :70所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO :47所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO :71所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO :48所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO :72所示氨基酸序列的一條可變輕鏈、包含SEQ ID NO :49所示氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO :73所示氨基酸序列的一條可變輕鏈。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的人結(jié)合分子包含包含SEQ ID NO 335的第1-119位氨基酸的氨基酸序列的一條可變重鏈及包含SEQ ID NO 337的第1-107位氨基酸的氨基酸序列的一條可變輕鏈。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的具有狂犬病病毒中和活性的結(jié)合分子是以 IgG形式給予的，優(yōu)選IgGl形式。本發(fā)明的另一方面包括所述結(jié)合分子的功能變體。如果變體分子能與親代結(jié)合分子競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合狂犬病病毒或其片段，則認(rèn)為該分子是本發(fā)明的結(jié)合分子的功能變體。 換句話說(shuō)，所述功能變體仍能結(jié)合狂犬病病毒或其片段。所述功能變體也應(yīng)仍具有狂犬病病毒中和活性。功能變體包括但非限于與一級(jí)結(jié)構(gòu)序列基本上相似、但含有例如體外或者
12體內(nèi)修飾的衍生物，所述修飾是在親代結(jié)合分子中未發(fā)現(xiàn)的化學(xué)和/或生物化學(xué)修飾。這種修飾包括乙?；?、?；?、ADP-核糖基化、酰胺化、共價(jià)附著黃素、共價(jià)附著血紅素部分、共價(jià)附著核苷酸或者核苷酸衍生物、共價(jià)附著脂質(zhì)或者脂質(zhì)衍生物、共價(jià)附著磷酯酰肌醇、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、去甲基化、共價(jià)交聯(lián)形成、胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲?；?、Y羧化、糖基化、GPI-錨形成、羥化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、PEG化、蛋白酶解加工、磷酸化、異戊二烯化、外消旋、硒酰化(selenoylation)、硫酸化、轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)的向蛋白質(zhì)中加入氨基酸如精氨?；⒈樵诘鞍谆??；蛘?，功能變體可以是本發(fā)明所述的結(jié)合分子，與親代結(jié)合分子的氨基酸序列相比，其包含含有一或多個(gè)氨基酸的取代、插入、缺失或者其組合的氨基酸序列。此外，功能變體可包含在氨基端或者羧基端或者這兩端氨基酸序列截短。本發(fā)明的功能變體與親代結(jié)合分子相比可具有相同或不同的(較高或者較低)結(jié)合親和性，但是仍能結(jié)合狂犬病病毒或其片段并仍能中和狂犬病病毒。例如，本發(fā)明的功能變體與親代結(jié)合分子相比可具有增加或者降低的對(duì)狂犬病病毒或其片段的結(jié)合親和性，或者具有較高或者較低的狂犬病病毒中和活性。優(yōu)選地，修飾可變區(qū)的氨基酸序列，包括但非限于構(gòu)架區(qū)、高變區(qū)、特別是⑶R3區(qū)。 通常，輕鏈和重鏈可變區(qū)包含三個(gè)高變區(qū)，包含三個(gè)CDR，及所謂構(gòu)架區(qū)(FR)的更保守的區(qū)域。所述高變區(qū)包含CDR的氨基酸殘基和高變環(huán)的氨基酸殘基。在本發(fā)明范圍內(nèi)的功能變體與本文所述親代結(jié)合分子具有至少大約50% _99%、優(yōu)選至少大約60% _99%、更優(yōu)選至少大約70% -99%、更優(yōu)選至少大約80% -99%、最優(yōu)選至少大約90% -99 %、特別是至少大約95% -99%、特別是至少大約97% -99%的氨基酸序列同源性。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的計(jì)算機(jī)算法如Gap或者Bestfit最佳對(duì)比氨基酸序列并確定相似或者相同的氨基酸殘基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)親代結(jié)合分子在其序列中包含一個(gè)糖基化位點(diǎn)導(dǎo)致結(jié)合分子基于在真核細(xì)胞中表達(dá)而糖基化，并因此可能消除與抗原的結(jié)合時(shí)，產(chǎn)生功能變體。產(chǎn)生的功能變體不再含有糖基化位點(diǎn)，但是仍能結(jié)合狂犬病病毒并且仍具有中和活性。功能變體可以通過本領(lǐng)域已知的一般分子生物學(xué)方法改變親代結(jié)合分子或其部分而獲得，所述方法包括但非限于易錯(cuò)PCR、寡核苷酸指導(dǎo)的誘變和定點(diǎn)誘變。此外，功能變體可具有互補(bǔ)固定活性，能有助于包膜的狂犬病病毒的裂解和/或作為調(diào)理素及增大對(duì)狂犬病病毒的吞噬作用，通過促進(jìn)Fc或Ob受體對(duì)其攝取或者通過凝集狂犬病病毒使其更易于被吞噬而實(shí)現(xiàn)。另一方面，本發(fā)明包括免疫綴合物，即包含至少一種本文所述結(jié)合分子或其功能變體并且進(jìn)一步包含至少一種標(biāo)記如可檢測(cè)的部分/制劑的分子。本發(fā)明還涵蓋了本發(fā)明的免疫綴合物的混合物或者至少一種本發(fā)明的免疫綴合物與另一種分子如治療劑或者另一種結(jié)合分子或免疫綴合物的混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫綴合物可包含一或多個(gè)標(biāo)記。這些標(biāo)記可以是彼此相同或者不同，并且可以與所述結(jié)合分子非共價(jià)地結(jié)合/綴合。所述標(biāo)記也可以通過共價(jià)鍵與所述結(jié)合分子直接結(jié)合/綴合，所述共價(jià)鍵包括但非限于二硫鍵、氫鍵、靜電鍵、重組融合和構(gòu)象鍵合。或者，所述標(biāo)記通過一或多種連接化合物與所述鍵合分子結(jié)合/綴合。將標(biāo)記與結(jié)合分子綴合的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本發(fā)明的免疫綴合物的標(biāo)記可以是治療劑，但優(yōu)選是可檢測(cè)的部分/制劑。包含可檢測(cè)制劑的免疫綴合物可診斷性用于例如評(píng)定對(duì)象是否感染了狂犬病病毒，或者用于監(jiān)測(cè)狂犬病病毒感染的發(fā)生或進(jìn)展作為部分臨床測(cè)試程序，以例如確定提供的治療方案的效力。然而，它們也可用于其它檢測(cè)和/或分析和/或診斷目的。可檢測(cè)的部分/制劑包括但非限于酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、正電子發(fā)射金屬及非放射性順磁性金屬離子。用于標(biāo)記結(jié)合分子以進(jìn)行檢測(cè)和/或分析和/或診斷的標(biāo)記依賴于特異性檢測(cè)/ 分析/診斷技術(shù)和/或使用的方法而定，所述方法如對(duì)(組織)樣品進(jìn)行的免疫組織化學(xué)染色、流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)、掃描激光器細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)、熒光免疫分析、酶聯(lián)免疫吸附分析 (ELISA)、放射性免疫分析(RIA)、生物分析(例如中和化分析)、Western印跡等。對(duì)于組織樣品的免疫組織化學(xué)染色，優(yōu)選的標(biāo)記是催化可檢測(cè)產(chǎn)物產(chǎn)生和局部沉積的酶。與結(jié)合分子典型綴合以使其可以進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色的酶為本領(lǐng)域所熟知，包括但非限于乙酰膽堿酯酶、堿性磷酸酶、β -半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、辣根過氧化物酶和脲酶。產(chǎn)生和沉積可目測(cè)的產(chǎn)物的典型底物也為本領(lǐng)域所熟知。隨后，本發(fā)明的免疫綴合物可以使用膠體金標(biāo)記，或者它們可以用放射性同位素標(biāo)記，如33P、32P、35SJH* 1251。本發(fā)明的結(jié)合分子可以通過本領(lǐng)域熟知的方法通過螯合劑直接或者間接附著于放射性核素。當(dāng)本發(fā)明的結(jié)合分子用于流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)、掃描激光器細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)或者熒光免疫分析時(shí)，其可以用熒光團(tuán)標(biāo)記?？捎糜跓晒鈽?biāo)記本發(fā)明的結(jié)合分子的眾多熒光團(tuán)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。當(dāng)本發(fā)明的結(jié)合分子用于使用標(biāo)記的抗生物素蛋白、鏈霉親和素、 captavidin或者neutravidin進(jìn)行二級(jí)檢測(cè)時(shí)，結(jié)合分子可以使用生物素標(biāo)記以形成合適的輔基復(fù)合物。當(dāng)本發(fā)明的免疫綴合物用于體內(nèi)診斷時(shí)，結(jié)合分子也可以通過與例如磁共振成像 (MRI)造影劑如二亞乙基三胺五乙酸釓、超聲造影劑或者X線造影劑綴合或者通過放射性同位素標(biāo)記而可被檢測(cè)到。此外，本發(fā)明的結(jié)合分子、其功能變體或者免疫綴合物也可以附著于固體支持物， 以特別用于體外免疫分析或者純化狂犬病病毒或其片段。這種固體支持物可以是有孔或者無(wú)孔的、平面或者非平面的，包括但非限于玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、 聚氯乙烯或者聚丙烯支持物。人結(jié)合分子也可例如與過濾介質(zhì)綴合，如與NHS-活化的 Sepharose或者CNBr-活化的kpharose綴合以進(jìn)行免疫親和層析。它們也可以典型地通過生物素一鏈霉親和素相互作用而附著于順磁性微球。所述微球可用于從含有狂犬病病毒或其片段的樣品中分離狂犬病病毒或其片段。另一個(gè)例子，本發(fā)明的人結(jié)合分子可附著于用于ELISA的微滴定平板表面。本發(fā)明的結(jié)合分子或其功能變體可以與標(biāo)記序列如促進(jìn)純化的肽融合。標(biāo)記序列的例子包括但不限于六組氨酸標(biāo)記、血凝素(HA)標(biāo)記、myc標(biāo)記或者flag標(biāo)記。 或者，抗體可以與第二種抗體綴合形成抗體異源綴合物。另一方面，本發(fā)明的人結(jié)合分子可以與一或多種抗原綴合/附著。優(yōu)選地，這些抗原是由給予了結(jié)合分子一抗原綴合物的對(duì)象的免疫系統(tǒng)識(shí)別的抗原。所述抗原彼此可以相同或不同。將抗原與結(jié)合分子附著的綴合方法為本領(lǐng)域所熟知，包括但非限于使用交聯(lián)劑。人結(jié)合分子結(jié)合狂犬病病毒，附著于人結(jié)合分子的抗原將引發(fā)對(duì)于該綴合物的強(qiáng)力T細(xì)胞進(jìn)攻，最后導(dǎo)致狂犬病病毒的破壞。 除了直接或者間接通過例如接頭通過綴合而化學(xué)產(chǎn)生免疫綴合物，免疫綴合物也可以作為包含本發(fā)明的人結(jié)合分子和合適標(biāo)記的融合蛋白而產(chǎn)生。融合蛋白可以通過本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生，例如通過框內(nèi)構(gòu)建包含編碼人結(jié)合分子的核苷酸序列及編碼合適標(biāo)記的核苷酸序列的核酸分子、然后表達(dá)所述核酸分子而重組產(chǎn)生。本發(fā)明的另一方面提供了編碼至少一種本發(fā)明的結(jié)合分子或其功能變體的核酸分子。這種核酸分子可用作中間物進(jìn)行克隆，例如在上述親和性成熟過程中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子是分離的或者純化的。技術(shù)人員意識(shí)到這些核酸分子的功能變體也是本發(fā)明的一部分。功能變體是用標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼可以直接翻譯的核酸序列，以提供與從親代核酸分子中翻譯的序列相同的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述核酸分子編碼包含⑶R3區(qū)、優(yōu)選重鏈⑶R3區(qū)的結(jié)合分子，其包含選自如下的氨基酸序列:SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5,SEQ ID NO :6,SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10,SEQ ID N0:11、 SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO 23 禾口 SEQ ID NO :24。更優(yōu)選地，所述核酸分子編碼包含可變重鏈的人結(jié)合分子，所述可變重鏈包含選自如下的氨基酸序列:SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、 SEQ ID NO36,SEQ ID NO37,SEQ ID NO 38,SEQ ID NO39,SEQ ID NO40,SEQ ID N0: 41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 48和SEQ ID NO :49。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子編碼包含可變重鏈的結(jié)合分子，所述可變重鏈基本上包含SEQ ID NO 335的第1-119位氨基酸的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸分子編碼包含包含SEQ ID NO J6所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO :50所示氨基酸序列的可變輕鏈的結(jié)合分子，或者編碼包含 SEQ ID NO :27所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO :51所示氨基酸序列的可變輕鏈，或者編碼包含SEQ ID NO 所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO :52所示氨基酸序列的可變輕鏈，或者編碼包含SEQ ID NO : 所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO :53所示氨基酸序列的可變輕鏈，或者編碼包含SEQ ID NO :30所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO 54所示氨基酸序列的可變輕鏈，或者編碼包含SEQ ID NO 31所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO :55所示氨基酸序列的可變輕鏈，或者編碼包含 SEQ ID NO :32所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO :56所示氨基酸序列的可變輕鏈，或者編碼包含SEQ ID NO :33所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO :57所示氨基酸序列的可變輕鏈，或者編碼包含SEQ ID NO :34所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO :58所示氨基酸序列的可變輕鏈，或者編碼包含SEQ ID NO :35所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO :59所示氨基酸序列的可變輕鏈，或者編碼包含SEQ ID NO :36所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO :60所示氨基酸序列的可變輕鏈，或者編碼包含 SEQ ID NO :37所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO :61所示氨基酸序列的可變輕鏈，或者編碼包含SEQ ID NO :38所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO :62所示氨基酸序列的可變輕鏈，或者編碼包含SEQ ID NO :39所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO :63所示氨基酸序列的可變輕鏈，或者編碼包含SEQ ID NO :40所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO 64所示氨基酸序列的可變輕鏈，或者編碼包含SEQ ID NO 41所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO :65所示氨基酸序列的可變輕鏈，或者編碼包含 SEQ ID NO :42所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO :66所示氨基酸序列的可變輕鏈，或者編碼包含SEQ ID NO :43所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO :67所示氨基酸序列的可變輕鏈，或者編碼包含SEQ ID NO :44所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO :68所示氨基酸序列的可變輕鏈，或者編碼包含SEQ ID NO :45所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO :69所示氨基酸序列的可變輕鏈，或者編碼包含SEQ ID NO :46所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO :70所示氨基酸序列的可變輕鏈，或者編碼包含 SEQ ID NO :47所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO :71所示氨基酸序列的可變輕鏈，或者編碼包含SEQ ID NO :48所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO :72所示氨基酸序列的可變輕鏈，或者編碼包含SEQ ID NO :49所示氨基酸序列的可變重鏈及包含SEQ ID NO :73所示氨基酸序列的可變輕鏈。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述核酸分子編碼包含可變重鏈和可變輕鏈的人結(jié)合分子，所述可變重鏈包含一種氨基酸序列，該氨基酸序列包含SEQ ID NO :335的第1-119位氨基酸，所述可變輕鏈包含一種氨基酸序列，該氨基酸序列包含SEQ ID NO 337的第1-107位氨基酸。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明結(jié)合分子可變重鏈的核酸分子基本上包含選自如下的核苷酸序列:SEQ ID NO :74, SEQ ID NO 75, SEQ ID NO 76, SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO :78、SEQ ID NO :79、SEQ ID NO :80、SEQ ID NO :81、SEQ ID NO :82、SEQ ID NO :83、SEQ ID NO :84、SEQ ID NO :85、SEQ ID NO :86、SEQ ID NO :87、SEQ ID NO :88、SEQ ID NO :89、SEQ ID NO :90、SEQ ID NO :91、SEQ ID NO :92、SEQ ID NO :93、SEQ ID NO :94、 SEQ ID NO 95, SEQ ID NO 96和SEQ ID NO :97.優(yōu)選地，編碼本發(fā)明結(jié)合分子的可變重鏈的核酸分子基本上包含一種核苷酸序列，該序列包含SEQ ID NO :334的第1-357位核苷酸。在本發(fā)明的另一個(gè)特定實(shí)施方案中，編碼本發(fā)明結(jié)合分子的可變輕鏈的所述核酸分子基本上包含選自如下一組的核苷酸序列SEQ ID NO 98, SEQ ID NO 99、SEQ ID NO: 100,SEQ ID NO =IOUSEQ ID NO 102、SEQ ID NO 103,SEQ ID NO 104,SEQ ID NO 105,SEQ ID NO :106,SEQ ID NO 107,SEQ ID NO 108,SEQ ID NO 109,SEQ ID NO 110,SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO :112、SEQ ID NO :113、SEQ ID NO :114、SEQ ID NO :115、SEQ ID NO :116、 SEQ ID NO :117, SEQ ID NO 118、SEQ ID NO 119、SEQ ID NO :120 和 SEQ ID N0:121。優(yōu)選地，編碼本發(fā)明人結(jié)合分子的可變輕鏈的核酸分子基本上包含一種核苷酸序列，該核苷酸序列包含SEQ ID NO 336的第1-321位核苷酸。本發(fā)明的另一方面提供了包含本發(fā)明的一或多種核酸分子的載體，即核酸構(gòu)建體。載體可以衍生自質(zhì)粒，如F、Rl、RPl、Col、pBR322、T0L, Ti等；粘粒；噬菌體，如λ噬菌體、λ 類噬菌體、] 13、]\111、？1、？22、00、11-6￥611、11-0(1(1、12、14、17等；植物病毒，如苜?；ㄈ~病毒、雀麥花葉病毒、毛狀病毒組(capillovirus)、香石竹潛病毒組(carlavirus)、 香石竹斑駁病毒組(carmovirus)、caulivirus、線形病毒組(clostervirus)、豇豆花葉病毒組(comovirus)、隱病毒(cryptovirus)、南瓜花葉病毒組(cucumovirus)、香石竹環(huán)斑病毒組(dianthovirus)、蠶豆萎蔫病毒組(fabavirus)、斐濟(jì)病毒組(fi jivirus)、真菌
1傳棒狀病毒組(furovirus)、雙粒病毒組(geminivirus)、大麥病毒(hordeivirus)、等軸不穩(wěn)定環(huán)斑病毒組(ilarvirus)、黃矮病毒組(Iuteovirus)、machlovirus、玉米雷亞多非納病毒組(marafivirus)、壞死病毒組(necrovirus)、線蟲傳多面體病毒(η印ovirus)、 phytor印virus、植物彈狀病毒、馬鈴薯X病毒組(potexvirus)、馬鈴薯Y病毒組 (potyvirus)、南方菜豆花葉病毒組(sobemovirus)、水稻條紋葉枯病毒組(tenuivirus)、 煙草花葉病毒(tobamovirus)、煙草脆裂病毒組(tobravirus)、番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus)、番爺叢矮病毒(tombusvirus)、菜菁黃花葉病毒組(tymovirus) 等；或者動(dòng)物病毒，如腺病毒、沙粒病毒科、桿狀病毒科、雙RNA病毒科、布尼安病毒科 (bunyaviridae)、杯狀病毒禾斗(calciviridae)、心病毒屬(cardioviruses)、冠形病毒禾斗、 被蓋病毒科、囊狀病毒科、Epstein-Barr病毒、腸道病毒、線狀病毒科、黃病毒科、足口病病毒(Foot-and-Mouth disease virus)、嗜肝DNA病毒科、肝炎病毒、皰疹病毒科、免疫缺陷病毒、流感病毒、絲狀病毒科、虹彩病毒科、正粘病毒科、乳多空病毒、副粘病毒科、細(xì)小病毒科、小RNA病毒科、脊髓灰質(zhì)炎病毒、多DNA病毒科、痘病毒科、呼腸孤病毒科、反轉(zhuǎn)錄病毒、 彈狀病毒科、鼻病毒、Semliki !^rest病毒、四病毒科、披膜病毒科、toroviridae、痘苗病毒、皰疹性口腔炎病毒等。載體可用于克隆和/或表達(dá)本發(fā)明的人結(jié)合分子，甚至可以用于基因治療。與一或多種表達(dá)調(diào)節(jié)核酸分子可操縱地連接的、包含本發(fā)明的一或多種核酸分子的載體也涵蓋在本發(fā)明范圍內(nèi)。載體的選擇依賴于重組方法及使用的宿主。將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中可以通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、lipofectamine轉(zhuǎn)染或者電穿孔進(jìn)行。載體可自主復(fù)制或者可以與其導(dǎo)入的染色體一起復(fù)制。優(yōu)選地，所述載體含有一或多個(gè)選擇標(biāo)記。標(biāo)記的選擇可依賴于選擇的宿主細(xì)胞，盡管這對(duì)于本發(fā)明無(wú)關(guān)緊要并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。所述標(biāo)記包括但非限于卡那霉素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、zeocin、來(lái)自單純皰疹病毒的胸苷激酶基因(HSV-TK)、小鼠二氫葉酸還原酶基因(dhfr)。本發(fā)明還包括包含編碼人結(jié)合分子的一或多種核酸分子的載體，其與編碼可用于分離結(jié)合分子的蛋白質(zhì)或肽的一或多個(gè)核酸分子可操縱地連接。這些蛋白質(zhì)或肽包括但非限于谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶、麥芽糖結(jié)合蛋白、金屬結(jié)合多組氨酸、綠色熒光蛋白、熒光素酶和β-半乳糖苷酶。 本發(fā)明另一方面涉及含有上述載體的一或多個(gè)拷貝的宿主。優(yōu)選地，所述宿主是宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞包括但非限于哺乳動(dòng)物、植物、昆蟲、真菌或細(xì)菌來(lái)源的細(xì)胞。細(xì)菌細(xì)胞包括但非限于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，如芽孢桿菌屬(Bacillus)、鏈霉菌屬(Sti^ptomyces) 和葡萄球菌屬Staphylococcus)的一些菌種，或者革蘭氏陰性細(xì)菌如埃希氏菌屬 (Escherichia)的一些菌種，如大腸桿菌(E. coli)及假單胞菌屬(Pseudomonas)。在真菌細(xì)胞中優(yōu)選使用酵母細(xì)胞。在酵母中的表達(dá)可以通過使用酵母株如巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和多形漢遜氏酵母 (Hansenula polymorpha)進(jìn)行。此外，昆蟲細(xì)胞如果蠅細(xì)胞和Sf9細(xì)胞可以用作宿主細(xì)胞。 除此之外，宿主細(xì)胞可以是植物細(xì)胞。通過已知方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)基因)的植物或者植物細(xì)胞，例如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、葉盤轉(zhuǎn)化、通過聚乙二醇誘導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔、超聲、顯微注射或者bolistic基因轉(zhuǎn)移。另外，合適的表達(dá)系統(tǒng)可以是桿狀病毒系統(tǒng)。本發(fā)明優(yōu)選使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、COS細(xì)胞、BHK細(xì)胞或者Bowes黑素瘤細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞提供的表達(dá)的蛋白質(zhì)具有與哺乳動(dòng)物天
17然分子最相似的翻譯后修飾。由于本發(fā)明涉及給予人體的分子，因此特別優(yōu)選完全的人表達(dá)系統(tǒng)。因此，更優(yōu)選宿主細(xì)胞是人細(xì)胞。人細(xì)胞的例子是HeLa、911、AT1080、A549、293 和HEK293T細(xì)胞。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人視網(wǎng)膜細(xì)胞如911細(xì)胞，或者是于1996年2月 29 日保藏在歐洲動(dòng)物細(xì)胞保藏中心(ECACC ；CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Great Britain)的細(xì)胞系，保藏號(hào)為9602^40，以PER. C6 商標(biāo)銷售(PER. C6是Crucell Holland B. V.的注冊(cè)商標(biāo))。在本申請(qǐng)中，“PER. C6”是指以保藏號(hào)9602^40保藏的細(xì)胞，或者祖細(xì)胞、上游或者下游傳代以及來(lái)自保藏的細(xì)胞祖先的后代，以及前述任何細(xì)胞的衍生物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，人生產(chǎn)細(xì)胞包含可表達(dá)形式的編碼腺病毒El區(qū)域的核酸序列的至少功能部分。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞衍生自人視網(wǎng)膜，并且用包含腺病毒El序列的核酸無(wú)限增殖化，如于1996年2月四日以保藏號(hào)9602^40保藏在歐洲動(dòng)物細(xì)胞保藏中心(ECACC ；CAMR, Salisbury,ffiltshire SP4 OJG, Great Britain)的細(xì)胞系，商標(biāo)為PER. C6 。宿主細(xì)胞中重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行。以商標(biāo)PER. C6 銷售的細(xì)胞作為感興趣蛋白質(zhì)的生產(chǎn)平臺(tái)的應(yīng)用已經(jīng)在WO 00/63403中描述，所述文獻(xiàn)在此以其全文并入作參考。產(chǎn)生本發(fā)明的結(jié)合分子或功能變體的方法是本發(fā)明的另一部分。所述方法包括如下步驟a)在有益于結(jié)合分子或其功能變體表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主，及b)任選地，回收表達(dá)的結(jié)合分子或其功能變體。表達(dá)的結(jié)合分子或其功能變體可以從無(wú)細(xì)胞提取物中回收，但優(yōu)選從培養(yǎng)基中回收。從無(wú)細(xì)胞提取物或者培養(yǎng)基中回收蛋白質(zhì)如結(jié)合分子的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。可通過上述方法獲得的結(jié)合分子或者其功能變體也是本發(fā)明的一部分。或者，在宿主如宿主細(xì)胞中表達(dá)之后，本發(fā)明的結(jié)合分子或其功能變體可以通過常規(guī)肽合成儀合成產(chǎn)生，或者使用衍生自本發(fā)明的DNA分子的RNA核酸在無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中產(chǎn)生?？赏ㄟ^上述合成產(chǎn)生方法或者無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)獲得的結(jié)合分子或其功能變體也是本發(fā)明的一部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子或其功能變體可以通過轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物產(chǎn)生，例如表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或者兔。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物具有一個(gè)基因組，該基因組包含編碼上述所有或部分人結(jié)合分子的人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因。所述轉(zhuǎn)基因非人哺乳動(dòng)物可以用純化的或者濃縮的狂犬病病毒或其片段制品免疫。免疫非人哺乳動(dòng)物的方案為本領(lǐng)域所熟知。lming Antibodies A Laboratory Manual, Edited by :E.Harlow, D.Lane(1998), Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York及Current Protocols in Immunology,Edited by J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, Ε. M. Shevach, W. Strober (2001), John Wiley & Sons Inc.，New ^rk所描述，所述文獻(xiàn)在此并入作參考。另一方面，本發(fā)明提供了一種鑒別能特異性結(jié)合狂犬病病毒的結(jié)合分子如本發(fā)明人單克隆抗體或其片段或者本發(fā)明的核酸分子的方法，所述方法包括如下步驟a)將可復(fù)制的遺傳包裝表面上的結(jié)合分子集合與狂犬病病毒或其片段在有益于結(jié)合的條件下接觸， b)至少選擇一次與狂犬病病毒或其片段結(jié)合的可復(fù)制遺傳包裝，及c)分離并回收與狂犬病病毒或其片段結(jié)合的可復(fù)制遺傳包裝。所述選擇步驟可以在存在狂犬病病毒的條件下進(jìn)行。所述狂犬病病毒可以是分離的或者是非分離的，例如存在于感染個(gè)體的血清和/或血液中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述狂犬病病毒是滅活的。或者，所述選擇步驟可以在存在狂犬病病毒片段如狂犬病病毒胞外部分、衍生自狂犬病病毒的一或多種(多)肽如G蛋白、包含這些蛋白質(zhì)或(多)肽的融合蛋白等的條件下進(jìn)行。在另一個(gè)實(shí)施方案中，用狂犬病病毒G蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用于選擇程序。再一方面，本發(fā)明提供了一種獲得本發(fā)明的結(jié)合分子或者核酸分子的方法，其中所述方法包括如下步驟a)進(jìn)行上述鑒別結(jié)合分子的方法，所述結(jié)合分子如本發(fā)明的人單克隆抗體或其片段或者本發(fā)明的核酸分子，及b)從回收的可復(fù)制遺傳包裝中分離所述結(jié)合分子和/或編碼所述結(jié)合分子的核酸。一旦使用上述鑒別結(jié)合分子或者編碼結(jié)合分子的核酸分子的方法確定或者鑒別了新的單克隆抗體，則編碼scFv或Fab的DNA可以從細(xì)菌或者可復(fù)制遺傳包裝中分離，組合標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生編碼二價(jià)scFv或者具有所需特異性的全部人免疫球蛋白(例如IgG、IgA或者IgM)的構(gòu)建體。這些構(gòu)建體可以轉(zhuǎn)染進(jìn)合適的細(xì)胞系中，產(chǎn)生完全的人單克隆抗體(見Huls et al. ,1999 ；Boel et al.，2000)。本文所用可復(fù)制遺傳包裝applicable genetic package)可以是原核或者真核生物，包括細(xì)胞、孢子、細(xì)菌、病毒、(細(xì)菌)噬菌體和多核糖體。優(yōu)選的可復(fù)制遺傳包裝是噬菌體。人結(jié)合分子如單鏈Fv' s在可復(fù)制的遺傳包裝上展示，即它們附著于位于可復(fù)制遺傳包裝外表面的基團(tuán)或者分子上?？蓮?fù)制遺傳包裝是一種包含被篩選的人結(jié)合分子的可篩選單位，其與編碼結(jié)合分子的核酸分子連接。所述核酸分子應(yīng)該是可在體內(nèi)(例如載體) 或者體外(例如通過PCR、轉(zhuǎn)錄和翻譯)復(fù)制的。在體內(nèi)復(fù)制可以是自發(fā)的(對(duì)于細(xì)胞)， 在宿主因子的幫助下(對(duì)于病毒)或者在宿主和輔助病毒二者的幫助下(對(duì)于噬菌粒)復(fù)制。展示人結(jié)合分子集合的可復(fù)制遺傳包裝是通過將被展示的編碼外源結(jié)合分子的核酸分子導(dǎo)入可復(fù)制遺傳包裝的基因組中，與通常在可復(fù)制遺傳包裝外表面表達(dá)的內(nèi)源蛋白形成融合蛋白而形成的。融合蛋白的表達(dá)、轉(zhuǎn)運(yùn)至外表面及裝配導(dǎo)致外源結(jié)合分子在可復(fù)制遺傳包裝的外表面展示。本發(fā)明再一方面涉及能結(jié)合狂犬病病毒或其片段并且可通過上述鑒別方法獲得的人結(jié)合分子。本發(fā)明另一方面涉及一種鑒別潛在具有狂犬病病毒中和活性的結(jié)合分子的方法， 所述方法包括如下步驟(a)將可復(fù)制遺傳包裝表面上的結(jié)合分子集合與狂犬病病毒在有益于結(jié)合的條件下接觸，(b)從未結(jié)合的結(jié)合分子中分離和回收與狂犬病病毒結(jié)合的結(jié)合分子，(C)分離至少一種回收的結(jié)合分子，(d)檢驗(yàn)分離的結(jié)合分子是否具有狂犬病病毒中和活性，特征在于步驟a中所述狂犬病病毒被滅活。滅活的狂犬病病毒在被滅活之前可以純化?？梢岳帽绢I(lǐng)域熟知的適于病毒的純化方法進(jìn)行純化，例如通過甘油墊(glycerol cushion)離心。步驟a中滅活的狂犬病病毒在使用之前可以固定在合適的材料上?；蛘?， 步驟a中的狂犬病病毒仍可以是活性的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟a中使用狂犬病病毒的片段，如一種狂犬病病毒的多肽如G蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用經(jīng)狂犬病病毒G 蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞選擇潛在具有狂犬病病毒中和活性的結(jié)合分子。如本文所示，當(dāng)表達(dá)狂犬病病毒G蛋白的細(xì)胞包括在選擇方法中時(shí)，選擇的中和抗體的數(shù)目與其中僅使用純化的狂犬病病毒G蛋白和/或滅活的狂犬病病毒的選擇方法相比是比較高的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，上述鑒別潛在具有狂犬病病毒中和活性的結(jié)合分子的方法進(jìn)一步包括分離和回收及任選分離含有可變重鏈3-30種系基因的人結(jié)合分子的步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過本領(lǐng)域已知的方法鑒別特異的種系基因，例如通過核苷酸測(cè)序。分離和回收含有可變重鏈3-30種系基因的結(jié)合分子的步驟可以在步驟c之前或者之后進(jìn)行。 如下文所示，本發(fā)明的大多數(shù)中和狂犬病病毒的人單克隆抗體包含這種特異性Vh種系基因。鑒別和獲得(中和)結(jié)合分子例如抗體的噬菌體展示方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法。例如在美國(guó)專利 No. 5，696，108 ;Burton and Barbas, 1994 ；de Kruif et al.， 1995b ；及 Phage Display :A Laboratory Manual. Edited by :CF Barbas, DR Burton, JK Scott and GJ Silvernan(2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New ^rk中描述。這些文獻(xiàn)在此均以其全文并入作參考。為了構(gòu)建噬菌體展示文庫(kù)，例如以單鏈Fv(SCFV)或者Fab形式將人單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因集合在噬菌體、優(yōu)選絲狀噬菌體顆粒的表面上表達(dá)(見de Kruifet al.，1995b)。表達(dá)抗體片段的噬菌體大型文庫(kù)典型含有1.0X109以上的抗體特異性，并且可以從在免疫的或未免疫的個(gè)體的B淋巴細(xì)胞中表達(dá)的免疫球蛋白V區(qū)中裝配。在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，人結(jié)合分子的噬菌體文庫(kù)、優(yōu)選scFv噬菌體文庫(kù)，是從分離自細(xì)胞的RNA中制備的，所述細(xì)胞得自已經(jīng)針對(duì)狂犬病進(jìn)行免疫接種或者暴露于狂犬病病毒的對(duì)象。RNA可以分離自骨髓或者外周血，優(yōu)選分離自外周血淋巴細(xì)胞。所述對(duì)象可以是接種了或者暴露于狂犬病病毒的動(dòng)物，但優(yōu)選是已經(jīng)接種或者已經(jīng)暴露于狂犬病病毒的人。優(yōu)選所述人對(duì)象已經(jīng)進(jìn)行了免疫接種。本發(fā)明的另一方面包括上述可復(fù)制遺傳包裝表面上的人結(jié)合分子集合，如scFv噬菌體文庫(kù)。或者，噬菌體展示文庫(kù)可以從免疫球蛋白可變區(qū)中構(gòu)建，其已經(jīng)在體外部分裝配以在文庫(kù)(半合成文庫(kù))中導(dǎo)入額外的抗體多樣性。例如，體外裝配的可變區(qū)在對(duì)于抗體特異性重要的那些分子區(qū)域例如CDR區(qū)域中含有合成產(chǎn)生的、隨機(jī)化的或者部分隨機(jī)化的 DNA序列?？袢〔《咎禺愋允删w抗體可以選自文庫(kù)，通過將靶抗原如來(lái)自狂犬病病毒的抗原固定在固相上，隨后將靶抗原暴露于噬菌體文庫(kù)以使得可以與表達(dá)特異于固相上結(jié)合的抗原的抗體片段的噬菌體結(jié)合。通過洗滌除去未結(jié)合的噬菌體，將結(jié)合的噬菌體從固相洗脫以感染大腸桿菌并隨后進(jìn)行增殖。通常需要多輪選擇和增殖以足以富集特異性結(jié)合靶抗原的噬菌體。在將噬菌體文庫(kù)暴露于靶抗原之前，如果需要，首先可通過將噬菌體文庫(kù)暴露于與固相結(jié)合的非靶抗原而進(jìn)行扣除。噬菌體也可以針對(duì)與復(fù)合抗原的結(jié)合而選擇，所述復(fù)合抗原如狂犬病病毒蛋白或(多)肽的混合物、表達(dá)一或多種狂犬病病毒蛋白或(多) 肽的宿主細(xì)胞或者(滅活的)狂犬病病毒自身。抗原特異性噬菌體抗體可以從文庫(kù)中選擇， 通過將其上結(jié)合了滅活的狂犬病病毒制品的固相與噬菌體抗體文庫(kù)保溫，以使得例如噬菌體的scFv或者Fab部分與狂犬病病毒制品的蛋白/多肽結(jié)合而進(jìn)行。在保溫及幾次洗滌以除去未結(jié)合的和松散附著的噬菌體之后，洗脫已經(jīng)與該制品的scFv或Fab部分結(jié)合的噬菌體，并用于感染大腸桿菌以擴(kuò)增新的特異性。通常，需要進(jìn)行一或多輪選擇以從大量未結(jié)合噬菌體中分離感興趣的噬菌體?；蛘?，可以將已知的狂犬病病毒蛋白或(多)肽在宿主細(xì)胞中表達(dá)，這些細(xì)胞可用于選擇特異于所述蛋白質(zhì)或(多)肽的噬菌體抗體。使用這些宿主細(xì)胞的噬菌體展示方法可以通過在篩選期間通過加入過量的不包含靶分子或者與靶分子相似但不相同的非靶分子的宿主細(xì)胞扣除不相關(guān)的結(jié)合物而擴(kuò)展和改良，從而顯著增加發(fā)現(xiàn)相關(guān)結(jié)合分子的機(jī)會(huì)(這種方法稱作MAbstract 方法，MAbstract⑧是CrucellHolland B. V.的注冊(cè)商標(biāo)，也見并入本文作參考的美國(guó)專利No. 6，265, 150所述)。另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的至少一種結(jié)合分子、至少一種其功能變體或片段、至少一種免疫綴合物或者其組合的組合物。所述組合物可進(jìn)一步包含穩(wěn)定分子，如白蛋白或者聚乙二醇，或者鹽。優(yōu)選地，使用的鹽是保留人結(jié)合分子的所需生物學(xué)活性但無(wú)任何非所需的毒性作用的鹽。如果需要，本發(fā)明的人結(jié)合分子可以包被在一種材料中或用一種材料包被，以保護(hù)其免于酸或者可以使結(jié)合分子滅活的其它天然或非天然條件的作用。再一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明至少一種核酸分子的組合物。所述組合物可包含水溶液如含有鹽(例如NaCl或者如上述鹽)、去污劑(例如SDS)和/或其它合適成分的水溶液。此外，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含本發(fā)明的至少一種結(jié)合分子、至少一種其功能變體或片段、至少一種免疫綴合物、至少一種組合物或其組合。本發(fā)明的藥物組合物進(jìn)一步包含至少一種藥物可接受的賦形劑。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含至少一種額外的結(jié)合分子， 即所述藥物組合物可以是結(jié)合分子的cocktail/混合物。所述藥物組合物可以包含本發(fā)明的至少兩種結(jié)合分子，或者包含至少一種本發(fā)明的結(jié)合分子和至少一種另外的抗狂犬病病毒結(jié)合分子。所述另外的結(jié)合分子優(yōu)選包含⑶R3區(qū)，該CRD3區(qū)包含SEQ ID N0:25所示氨基酸序列。包含包含SEQ ID NO :25所示氨基酸序列的CDR3區(qū)的結(jié)合分子可以是一種嵌合的或者人源化的單克隆抗體或其功能片段，但優(yōu)選是人單克隆抗體或其功能片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含重鏈可變區(qū)，該重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO :273所示氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含輕鏈可變區(qū)，該輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO 275所示氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含分別包含SEQ ID NO :123和 SEQ ID NO :125所示氨基酸序列的重鏈和輕鏈。藥物組合物中的結(jié)合分子應(yīng)該能與狂犬病病毒的不同的、非競(jìng)爭(zhēng)的表位反應(yīng)。所述表位可以存在于狂犬病病毒的G蛋白上，可以是不同的非重疊的表位。所述結(jié)合分子應(yīng)該是高親和性的，并且應(yīng)該具有廣泛的特異性。優(yōu)選地，它們中和盡可能多的狂犬病病毒固定毒株和街毒。更優(yōu)選地，它們還呈現(xiàn)對(duì)狂犬病毒屬其它基因型或者甚至彈狀病毒科其它病毒的中和活性，而與其它病毒或者正常的細(xì)胞蛋白無(wú)交叉反應(yīng)性。優(yōu)選地，所述結(jié)合分子能中和混合物中其它結(jié)合分子的逃逸變體。本發(fā)明的另一方面涉及一種藥物組合物，其包含至少兩種中和狂犬病病毒的結(jié)合分子，優(yōu)選本發(fā)明的人結(jié)合分子，特征在于所述結(jié)合分子能與狂犬病病毒的不同的、非競(jìng)爭(zhēng)的表位反應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含第一種中和狂犬病病毒的結(jié)合分子和第二種中和狂犬病病毒的結(jié)合分子，所述第一種結(jié)合分子能與位于狂犬病病毒G蛋白的抗原位點(diǎn)I的表位反應(yīng)，所述第二種結(jié)合分子能與位于狂犬病病毒G蛋白的抗原位點(diǎn)III 的表位反應(yīng)?？袢〔《咎堑鞍椎目乖Y(jié)構(gòu)最初由Lafon et al. (1983)闡述?？乖稽c(diǎn)是使用一組小鼠mAb及其各自的mAb抗性病毒變體鑒別的。此后，抗原位點(diǎn)已經(jīng)通過鑒別 mAb抗性變體的糖蛋白中氨基酸突變而作圖(見kifet al.，1985 ；Prehaud et al.，1988 ； 和Benmansour et al.，1991)。大多數(shù)狂犬病中和mAb針對(duì)抗原位點(diǎn)II (見Benmansour et al.，1991)，其是包含氨基酸34-42和氨基酸198-200的一個(gè)不連續(xù)的構(gòu)象表位(見 Prehaud et al.，1988)?？乖稽c(diǎn)III是在氨基酸330-338的一個(gè)連續(xù)構(gòu)象表位并且具有兩個(gè)荷電殘基K330和R333，影響病毒的致病性(見Seifet al.，1985 ；Coulon et al.， 1998 ；和Dietzschold et al.，1983)。僅有一個(gè)mAb，509-6限定了構(gòu)象抗原位點(diǎn)I，位于第 231 位氨基酸(見 Benmansour et al.，1991 ；和 Lafon et al.，1983)。已知抗原位點(diǎn) IV 具有重疊線性表位(見 Tordo，1996 ；Bunschoten et al.，1989 ；Luo et al.，1997 ；和 Ni et al. ,1995) ο Benmansour et al. (1991)還描述了位于第342-343位的一個(gè)小位點(diǎn)的存在， 盡管其與抗原位點(diǎn)III緊鄰，但與其截然不同。CR-57表位與目前已知的狂犬病病毒糖蛋白上的線性和構(gòu)象中和表位的序列對(duì)比(圖10)表明CR-57表位位于與構(gòu)象抗原位點(diǎn)I相同的區(qū)域中，由單一的mAb 509-6限定?；贑R04-098的逃逸病毒糖蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列，由這種抗體識(shí)別的表位看起來(lái)位于與連續(xù)構(gòu)象抗原位點(diǎn)III相同的區(qū)域中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物組合物包含第一種中和狂犬病病毒的結(jié)合分子和第二種中和狂犬病病毒的結(jié)合分子，所述第一種結(jié)合分子包含至少一個(gè)CDR3區(qū)、優(yōu)選重鏈⑶R3區(qū)，其包含SEQ ID NO 25所示氨基酸序列，第二種結(jié)合分子包含至少一個(gè)⑶R3 區(qū)、優(yōu)選重鏈CDR3區(qū)，其包含選自如下的氨基酸序列SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 10,SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :16 和 SEQ ID NO :22。更優(yōu)選地，第二種中和狂犬病病毒的結(jié)合分子包含至少一個(gè)⑶R3區(qū)、優(yōu)選重鏈⑶R3區(qū)，其包含SEQ ID NO 14所示氨基酸序列。優(yōu)選地，第一種中和狂犬病病毒的結(jié)合分子包含分別包含SEQ ID NO :123和SEQ ID NO :125所示氨基酸序列的重鏈和輕鏈，第二種中和狂犬病病毒的結(jié)合分子包含分別包含 SEQ ID NO :335和SEQ ID NO :337所示氨基酸序列的重鏈和輕鏈。優(yōu)選地，第一種中和狂犬病病毒的結(jié)合分子的重鏈和輕鏈分別由SEQ ID NO :122和SEQ ID NO :1 編碼，第二種中和狂犬病病毒的結(jié)合分子的重鏈和輕鏈分別由SEQ ID NO :334和SEQ ID NO :336編碼。包含兩種結(jié)合分子的藥物組合物(其中結(jié)合分子的Pi不同)當(dāng)選擇使這兩種結(jié)合分子均最佳穩(wěn)定的合適緩沖液時(shí)有困難。當(dāng)調(diào)節(jié)所述組合物的緩沖液的PH以增加一種結(jié)合分子的穩(wěn)定性時(shí)，這將降低另一種結(jié)合分子的穩(wěn)定性。結(jié)合分子的穩(wěn)定性降低甚至不穩(wěn)定可導(dǎo)致其沉淀或者聚集，或者導(dǎo)致其自發(fā)降解，引起結(jié)合分子的功能性喪失。因此， 本發(fā)明的另一方面提供了包含至少兩種結(jié)合分子、優(yōu)選人結(jié)合分子的藥物組合物，特征在于所述結(jié)合分子的等電點(diǎn)(Pl)彼此不同，小于大約1.5、1.4、1.3、1.2、1. 1、1. 0、0. 9、0. 8、 0. 7,0. 6,0. 5,0. 4,0. 3，優(yōu)選小于(包括)0. 25pl單位。pi可以通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定，例如利用等電聚焦，或者基于結(jié)合分子的氨基酸序列計(jì)算。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子是本發(fā)明的結(jié)合分子，所述藥物組合物是本發(fā)明的藥物組合物。優(yōu)選地，所述結(jié)合分子是單克隆抗體，例如人單克隆抗體如IgGl抗體。優(yōu)選地，所述結(jié)合分子能結(jié)合和/或中和一種感染因子，例如病毒、細(xì)菌、酵母、真菌或者寄生蟲。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子能結(jié)合和/ 或中和狂犬病毒屬病毒，例如狂犬病病毒。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，兩種結(jié)合分子的計(jì)算出的pi均在8. 0-9. 5、優(yōu)選8. 1-9. 2、更優(yōu)選在8. 2-8. 5之間。優(yōu)選地，所述結(jié)合分子分別具有 SEQ ID NO 14 和 SEQ ID NO 25 所示的重鏈 CDR3 區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了兩或多種人或其它動(dòng)物結(jié)合分子包括但非限于抗體的混合物，其中至少一種結(jié)合分子衍生自抗體噬菌體或者其它可復(fù)制包裝展示技術(shù)，至少一種結(jié)合分子可通過雜交瘤技術(shù)獲得。當(dāng)使用不同的技術(shù)時(shí)，選擇具有相容Pl的結(jié)合分子對(duì)于獲得組合物是非常有益的，其中每種結(jié)合分子均是足夠穩(wěn)定的以便于貯存、 處理和隨后的應(yīng)用。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物中存在的結(jié)合分子彼此增強(qiáng)了中和活性，即當(dāng)將它們組合時(shí)協(xié)同起作用。換句話說(shuō)，所述藥物組合物可呈現(xiàn)狂犬病病毒及甚至狂犬病毒屬病毒的協(xié)同中和活性。如本文所用術(shù)語(yǔ)“協(xié)同”是指結(jié)合分子當(dāng)組合應(yīng)用時(shí)的組合作用高于其單獨(dú)應(yīng)用時(shí)作用的加和。本發(fā)明的藥物組合物成分的范圍和比率應(yīng)基于其各自的效力確定，并且在體外中和分析或者動(dòng)物模型如倉(cāng)鼠中測(cè)試。此外，本發(fā)明的藥物組合物可包含至少一種其它的治療、預(yù)防和/或診斷劑。所述另外的治療和/或預(yù)防劑可以是抗病毒制劑如病毒唑或者α-干擾素。本發(fā)明的結(jié)合分子或藥物組合物在用于人體之前可以在合適的動(dòng)物模型系統(tǒng)中測(cè)試。這種動(dòng)物模型系統(tǒng)包括但非限于小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、猴等。典型地，藥物組合物必需是無(wú)菌的及在生產(chǎn)和貯存條件下是穩(wěn)定的。本發(fā)明的人結(jié)合分子、其變體或片段、免疫綴合物、核酸分子或者組合物可以是粉末形式，在給予之前或在給予時(shí)在合適的藥物可接受的賦形劑中重建(reconstitution)。在制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉末情況中，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(凍干)，這樣產(chǎn)生活性成分加上來(lái)自預(yù)先過濾滅菌溶液的任何其它所需成分的粉末?；蛘?，本發(fā)明的結(jié)合分子、其變體或片段、免疫綴合物、核酸分子或者組合物可以于溶液中，在給予之前或者給予時(shí)可以加入和/或混合合適的藥物可接受的賦形劑以提供單位劑量的可注射形式。優(yōu)選地，本發(fā)明中使用的藥物可接受的賦形劑適合高藥物濃度，可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性，如果需要的話可以延緩吸收。給予所述藥物組合物的最佳途徑的選擇受到許多因素的影響，包括組合物中活性分子的物理一化學(xué)性質(zhì)、臨床狀況的緊急程度及活性分子的血漿濃度與所需治療作用之間的關(guān)系。例如，如果需要，本發(fā)明的人結(jié)合分子可以與載體一起制備，這樣將保護(hù)其免于迅速釋放，如控制釋放制劑，包括植入體、經(jīng)皮貼片及微囊化輸送系統(tǒng)?？梢允褂每缮锟山到獾摹⑸锵嗳莸木酆衔?，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。 此外，可以用防止人結(jié)合分子滅活的材料或混合物包被人結(jié)合分子或者與其共同給予。例如，人結(jié)合分子可以在合適的載體例如脂質(zhì)體或者稀釋劑中給予對(duì)象。給予途徑通?？煞譃閮煞N主要方式，口服和胃腸外給予。本發(fā)明的人結(jié)合分子和藥物組合物的優(yōu)選給予方式是給予傷口內(nèi)和周圍及臀肌區(qū)肌內(nèi)注射。人結(jié)合分子和藥物組合物的配制依賴于給予途徑。另一方面，本發(fā)明的結(jié)合分子、功能變體、免疫綴合物、組合物或者藥物組合物可以用作藥物。因此，本發(fā)明另一方面提供了一種使用本發(fā)明的人結(jié)合分子、功能變體、免疫綴合物、組合物或者藥物組合物的治療和/或預(yù)防狂犬病毒屬病毒感染的方法。所述狂犬病毒屬病毒可以是任何已知基因型的病毒，但優(yōu)選是狂犬病病毒。上述分子或組合物可以用于狂犬病的暴露后預(yù)防中。上述分子或組合物可與可用于診斷、預(yù)防和/或治療狂犬病病毒的其它分子聯(lián)合應(yīng)用。它們可以在體外、離體或在體內(nèi)應(yīng)用。例如，本發(fā)明的人結(jié)合分子、功能變體、免疫綴合物或者藥物組合物可以與狂犬病疫苗共同給予?；蛘?，所述疫苗也可以在給予本發(fā)明的分子或組合物之前或者之后給予。給予本發(fā)明的分子或組合物及疫苗適于暴露后預(yù)防?？袢∫呙绨ǖ窍抻诩兓碾u胚細(xì)胞(PCEC)疫苗(RabAvert)、人二倍體細(xì)胞疫苗 (HDCV ；Imovax vaccine)或者吸附的狂犬病疫苗(RVA)。
本發(fā)明的組合物和藥物組合物中的分子是以治療或者診斷有效量典型配制的。 可以調(diào)節(jié)劑量方案以提供最佳的所需應(yīng)答(例如治療應(yīng)答)。合適的劑量范圍可例如是 0. l-100IU/kg 體重，優(yōu)選 1. 0-50IU/kg 體重，更優(yōu)選 10-30IU/kg 體重，如 20IU/kg 體重。優(yōu)選地，給予單一推注(bolus)本發(fā)明的結(jié)合分子或者藥物組合物。本發(fā)明的分子和藥物組合物優(yōu)選是無(wú)菌的。本領(lǐng)域熟知使得這些分子和組合物無(wú)菌的方法。暴露后預(yù)防的給藥方案是在先前未接種狂犬病病毒疫苗的個(gè)體在暴露后第0、3、7、14和觀天肌內(nèi)給予5劑狂犬病疫苗。本發(fā)明的人結(jié)合分子或者藥物組合物應(yīng)該在第0天給予傷口中和傷口周圍，或者在暴露后盡快給予，在遠(yuǎn)離接種的部位肌內(nèi)給予剩余的體積。未接種的個(gè)體給予抗狂犬病病毒人結(jié)合分子，但技術(shù)人員清楚需要這種治療的接種個(gè)體也可以給予抗狂犬病病毒人結(jié)合分子。另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的結(jié)合分子或其功能變體、免疫綴合物、核酸分子、 組合物或者藥物組合物在制備診斷、預(yù)防、治療或組合用于得自狂犬病毒屬病毒感染的疾病的藥物中的應(yīng)用。所述狂犬病毒屬病毒可以是任何已知基因型的病毒，但優(yōu)選是狂犬病病毒。優(yōu)選上述分子用于制備狂犬病暴露后預(yù)防的藥物中。本發(fā)明還提供了試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明的至少一種結(jié)合分子、至少一種其功能變體、至少一種免疫綴合物、至少一種核酸分子、至少一種組合物、至少一種藥物組合物、至少一種載體、至少一種宿主，或者其組合。任選地，本發(fā)明的試劑盒的上述組分包裝在合適的容器中，并標(biāo)記了診斷、預(yù)防和/或治療的指定疾病。上述組分可以貯存在單位劑量或者多劑量容器中，例如密封的安瓿、小瓶、瓶子、注射器和試管中，是水相優(yōu)選無(wú)菌溶液或者是用于重建的凍干的優(yōu)選無(wú)菌的制劑。所述容器可以由多種材料制成，如玻璃或者塑料，可以具有一個(gè)無(wú)菌的進(jìn)入口(例如該容器可以是具有可用皮下注射針刺穿的塞子的靜脈內(nèi)注射溶液袋或者小瓶)。所述試劑盒另外包含包含藥物可接受的緩沖液如磷酸鹽緩沖鹽水、Ringer' s溶液和葡萄糖溶液的多個(gè)容器。所述試劑盒可進(jìn)一步包括商業(yè)上和使用者需要的其它材料，包括用于一或多種合適宿主的其它緩沖劑、稀釋劑、過濾器、針頭、注射器、培養(yǎng)基。所述試劑盒中通常在治療、預(yù)防或診斷產(chǎn)品的商業(yè)包裝中附帶使用說(shuō)明書，說(shuō)明書中含有關(guān)于例如這種治療、預(yù)防或診斷產(chǎn)品的適應(yīng)癥、使用、劑量、生產(chǎn)、給予、禁忌癥和/或使用注意事項(xiàng)的信息。目前，HRIG產(chǎn)品用于狂犬病暴露后預(yù)防。1500IU的成人劑量HRIG僅在IOml體積中提供(75kg個(gè)體，20IU/kg)。更濃縮的HRIG產(chǎn)品是不可能的，因?yàn)槟壳翱色@得的IOml劑量含有l(wèi)-1.5g的總IgG。鑒于目前HRIG產(chǎn)品具有兩個(gè)缺點(diǎn)。首先，其通常在解剖學(xué)上不適合在咬傷傷口中和其周圍給予推薦的完全劑量，其次，目前給予的HRIG的體積與明顯的疼痛相關(guān)。本發(fā)明提供了解決這些缺點(diǎn)的方法，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含大約 2ml或更少體積(如果需要)的全部成人劑量。這種藥物組合物可包含例如能中和狂犬病病毒的兩種結(jié)合分子，優(yōu)選CR57和CR04-098。所述藥物組合物進(jìn)一步包含一種藥物可接受的賦形劑，體積為大約ani?？梢杂懈蟮捏w積，但是考慮到與注射更大體積相關(guān)的疼痛因此不希望更大的體積。低于2ml也是可能的。所述藥物組合物包含成功進(jìn)行暴露后預(yù)防需要的全部成人劑量(IU)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥物組合物貯存在IOml小瓶中，例如 IOml的具有塞子的ready-to-use小瓶(I型玻璃)中。通過提供IOml小瓶，在個(gè)體存在較大創(chuàng)傷表面積的情況中可以選擇將藥物組合物稀釋為更大體積。本發(fā)明還提供了一種試劑盒，其包含至少一個(gè)包含藥物組合物的容器(例如小瓶)。所述試劑盒可進(jìn)一步包含具有適于將藥物組合物稀釋為更大體積的稀釋劑的第二種容器。合適的稀釋劑包括但非限于藥物組合物的藥物可接受的賦形劑和鹽水溶液。此外，所述試劑盒可包含稀釋該藥物組合物的說(shuō)明書和/或給予稀釋或未稀釋的該藥物組合物的說(shuō)明書。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種檢測(cè)樣品中狂犬病病毒的方法，所述方法包括如下步驟 a)將樣品與診斷有效量的本發(fā)明的結(jié)合分子、功能變體或免疫綴合物接觸，及b)確定所述結(jié)合分子、功能變體或者免疫綴合物是否特異性結(jié)合樣品的分子。所述樣品可以是生物學(xué)樣品，包括但非限于(潛在)感染對(duì)象的血液、血清、組織或者其它生物學(xué)材料。所述(潛在)感染的對(duì)象可以是人，但是對(duì)懷疑是狂犬病病毒攜帶者的動(dòng)物也可以使用本發(fā)明的人結(jié)合分子、功能變體或者免疫綴合物測(cè)試狂犬病病毒的存在與否。首先對(duì)樣品進(jìn)行操縱，使其更適合檢測(cè)方法。操縱意味著對(duì)懷疑含有和/或含有狂犬病病毒的樣品進(jìn)行處理，由此狂犬病病毒分解為抗原成分如蛋白質(zhì)、(多)肽或者其它抗原片段。優(yōu)選地，將本發(fā)明的結(jié)合分子、功能變體或者免疫綴合物與該樣品在使得人結(jié)合分子與樣品中可能存在的狂犬病病毒或者其抗原成分之間形成免疫復(fù)合物的條件下接觸。如果免疫復(fù)合物形成則表明該樣品中存在狂犬病病毒，然后通過合適方式檢測(cè)并測(cè)定。這種方法包括均質(zhì)(homogeneous) 和異質(zhì)(heterogeneous)結(jié)合免疫分析，如放射性免疫分析(RIA)、ELISA、免疫熒光、免疫組織化學(xué)、FACS, BIAC0RE和Western印跡分析。此外，本發(fā)明的結(jié)合分子可用于鑒別狂犬病病毒蛋白如G蛋白的表位。所述表位可以是線性的，但也可以是結(jié)構(gòu)和/或構(gòu)象的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的結(jié)合分子與狂犬病病毒蛋白如狂犬病病毒G蛋白的一系列重疊肽如15-mer肽的結(jié)合可以利用PEPSCAN 分析(見 WO 84/03564,WO 93/09872,Slootstra et al. 1996)。人結(jié)合分子與每種肽的結(jié)合可以在基于PEPSCAN的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)中檢測(cè)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以對(duì)包含狂犬病病毒蛋白的肽的隨機(jī)肽文庫(kù)篩選能與本發(fā)明的人結(jié)合分子結(jié)合的肽。在上述分析中，中和狂犬病病毒的人結(jié)合分子的應(yīng)用可以鑒別一或多個(gè)中和表位。發(fā)現(xiàn)的肽/表位可以用作疫苗或者用于狂犬病的診斷。另一方面，本發(fā)明提供了一種篩選與本發(fā)明的結(jié)合分子或功能變體所結(jié)合的表位不同的、優(yōu)選非重疊的狂犬病病毒表位特異性結(jié)合的結(jié)合分子或結(jié)合分子功能變體的方法，所述方法包括如下步驟a)將被篩選的結(jié)合分子或功能變體、本發(fā)明的結(jié)合分子或功能變體與狂犬病病毒或其片段(例如狂犬病病毒G蛋白)接觸，b)測(cè)定被篩選的結(jié)合分子或功能片段是否能與本發(fā)明的結(jié)合分子或功能變體競(jìng)爭(zhēng)特異性結(jié)合狂犬病病毒或其片段。如果未檢測(cè)到競(jìng)爭(zhēng)，則被篩選的結(jié)合分子或功能變體結(jié)合不同的表位。在上述篩選方法的一個(gè)特定實(shí)施方案中，可以對(duì)人結(jié)合分子或其功能變體進(jìn)行篩選，以鑒別能結(jié)合與包含⑶R3區(qū)(該⑶R3區(qū)包含SEQ ID NO 25氨基酸序列)的結(jié)合分子識(shí)別的表位不同的表位的人結(jié)合分子或其功能變體。優(yōu)選地，所述表位是非重疊或者非競(jìng)爭(zhēng)性的。技術(shù)人員已知上述篩選方法也可用于鑒別能結(jié)合相同表位的結(jié)合分子或其功能變體。在進(jìn)一步的步驟中，可以確定不能競(jìng)爭(zhēng)性特異性結(jié)合狂犬病病毒或其片段的經(jīng)篩選的結(jié)合分子是否具有中和活性。也可以確定能競(jìng)爭(zhēng)性特異性結(jié)合狂犬病病毒或其片段的經(jīng)篩選的結(jié)合分子是否具有中和活性。在篩選方法中發(fā)現(xiàn)的中和抗狂犬病病毒的結(jié)合分子或其功能變體也是本發(fā)明的另一部分。在篩選方法中，“與相同表位特異性結(jié)合”包括特異性結(jié)合與本發(fā)明的人結(jié)合分子結(jié)合的表位基本上或者實(shí)質(zhì)上相同的表位。阻斷或者與本發(fā)明的人結(jié)合分子競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合狂犬病病毒的能力典型表明篩選的結(jié)合分子與狂犬病病毒上的表位或者結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，所述表位或者結(jié)合位點(diǎn)與本發(fā)明的結(jié)合分子免疫特異性識(shí)別的狂犬病病毒上的結(jié)合位點(diǎn)在結(jié)構(gòu)上重疊?；蛘?，這可以表明篩選的結(jié)合分子與本發(fā)明的結(jié)合分子免疫特異性識(shí)別的結(jié)合位點(diǎn)十分鄰近的表位或者結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，以空間排阻或者抑制本發(fā)明的結(jié)合分子與狂犬病病毒或其片段的結(jié)合。通常，競(jìng)爭(zhēng)性抑制是通過一種分析測(cè)定的，其中將抗原組合物，即包含狂犬病病毒或其片段(如G蛋白)的組合物與參考結(jié)合分子及篩選的結(jié)合分子混合。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述參考結(jié)合分子可以是本發(fā)明的人結(jié)合分子之一，篩選的結(jié)合分子可以是本發(fā)明的另一種人結(jié)合分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，參考結(jié)合分子可以是包含CDR3區(qū)的結(jié)合分子， 該CDR3區(qū)包含SEQ ID NO :25的氨基酸序列，篩選的結(jié)合分子可以是本發(fā)明的人結(jié)合分子之一。在另一個(gè)實(shí)施方案中，參考結(jié)合分子可以是本發(fā)明的人結(jié)合分子之一，篩選的結(jié)合分子可以是包含⑶R3區(qū)的結(jié)合分子，該⑶R3區(qū)包含SEQ ID NO :25的氨基酸序列。通常，篩選的結(jié)合分子過量存在?；贓LISA的方案適合用于這種簡(jiǎn)便的競(jìng)爭(zhēng)性研究中。在某些實(shí)施方案中，可以預(yù)先將參考結(jié)合分子與不同量的篩選結(jié)合分子混合(例如1 10、1 20、 1 30、1 40、1 50、1 60、1 70、1 80、1 90 或者 1 100) —段時(shí)間，之后用于抗原組合物。在其它實(shí)施方案中，參考結(jié)合分子與不同量的篩選的結(jié)合分子可以在暴露于抗原組合物期間簡(jiǎn)便地混合。在任何情況中，通過使用物種或者同種型二級(jí)抗體，技術(shù)人員均可以僅檢測(cè)結(jié)合的參考結(jié)合分子，其結(jié)合可以由于識(shí)別基本相同的表位的篩選的結(jié)合分子的存在而降低。在進(jìn)行參考結(jié)合分子與任何篩選的結(jié)合分子之間的結(jié)合分子競(jìng)爭(zhēng)性研究中(不論物種或者同種型)，技術(shù)人員可首先用可檢測(cè)的標(biāo)記對(duì)參考結(jié)合分子進(jìn)行標(biāo)記，所述標(biāo)記例如是生物素、酶、放射性標(biāo)記或者在隨后可以鑒別的其它標(biāo)記。在這些情況中，將標(biāo)記的參考結(jié)合分子與篩選的結(jié)合分子以不同比率預(yù)先混合或者保溫(例如1 10、 1 20、1 30、1 40、1 50、1 60、1 70、1 80、1 90 或者 1 100)，及(任選在合適的時(shí)間之后)分析標(biāo)記的參考結(jié)合分子的反應(yīng)性，將其與無(wú)潛在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分子保溫的情況中獲得的對(duì)照值進(jìn)行對(duì)比。所述分析再可以是基于抗體雜交的任何免疫學(xué)分析， 參考結(jié)合分子通過檢測(cè)其標(biāo)記而可以被檢測(cè)，例如在生物素化的參考結(jié)合分子的情況中使用鏈霉親和素或者通過使用生色底物連同酶標(biāo)記(如3，3' 5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 底物與過氧化物酶)檢測(cè)，或者通過簡(jiǎn)便檢測(cè)放射性標(biāo)記檢測(cè)。結(jié)合與參考結(jié)合分子相同的表位的篩選的結(jié)合分子能有效地競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，并因此顯著降低參考結(jié)合分子的結(jié)合，通過結(jié)合標(biāo)記的減少而表明。結(jié)合不同的非競(jìng)爭(zhēng)表位的結(jié)合分子示出標(biāo)記未減少。(標(biāo)記的) 參考結(jié)合分子在不存在與競(jìng)爭(zhēng)性不相關(guān)的結(jié)合分子的情況中的反應(yīng)性是對(duì)照高值。對(duì)照低值是通過將標(biāo)記的參考結(jié)合分子與實(shí)際上相同類型的未標(biāo)記的參考結(jié)合分子一起保溫，當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)發(fā)生并降低標(biāo)記的參考結(jié)合分子的結(jié)合時(shí)獲得的數(shù)值。在測(cè)試分析中，在存在篩選的結(jié)合分子的情況中，標(biāo)記的參考結(jié)合分子反應(yīng)性顯著降低表明存在識(shí)別相同表位的結(jié)合分子，即與標(biāo)記的參考結(jié)合分子“交叉反應(yīng)”的結(jié)合分子。如果其反應(yīng)性不降低，則所述結(jié)合分子結(jié)合不同的非競(jìng)爭(zhēng)表位。通過這些競(jìng)爭(zhēng)分析鑒別的結(jié)合分子(競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分子)包括但非限于與參考結(jié)合分子結(jié)合的表位或者結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的抗體、抗體片段及其它結(jié)合劑，以及與參考結(jié)合分子結(jié)合的表位十分鄰近的表位或者結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的抗體、抗體片段及其它結(jié)合劑，以在篩選的結(jié)合分子與參考結(jié)合分子之間發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。優(yōu)選地，本發(fā)明的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分子當(dāng)過量存在時(shí)抑制參考結(jié)合分子與選擇的靶位的特異性結(jié)合至少10%，優(yōu)選至少25%、50%， 最優(yōu)選至少75 % -90 %或者甚至更高。與本發(fā)明的結(jié)合分子的大約相同、基本上相同、實(shí)質(zhì)上相同、或者相同的表位結(jié)合的一或多種競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分子的鑒別是一個(gè)簡(jiǎn)單的技術(shù)操作。 因?yàn)楦?jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分子是通過與參考結(jié)合分子相對(duì)比而鑒別，所以應(yīng)理解鑒別與參考結(jié)合分子結(jié)合相同或者基本上相同表位的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分子不是在任何情況下均必須實(shí)際確定參考結(jié)合分子和競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分子所結(jié)合的表位?；蛘撸ㄟ^這些競(jìng)爭(zhēng)分析鑒別的結(jié)合不同的非競(jìng)爭(zhēng)性表位的結(jié)合分子包括但非限于抗體、抗體片段及其它結(jié)合劑。本發(fā)明另一方面提供了鑒別結(jié)合分子或者編碼這種結(jié)合分子的核酸分子的方法， 所述結(jié)合分子潛在地具有中和導(dǎo)致活體疾病的感染因子的活性，其中所述方法包括如下步驟a)將可復(fù)制遺傳包裝表面上的結(jié)合分子集合與至少一種在其表面上表達(dá)導(dǎo)致活體發(fā)生疾病的感染因子的蛋白質(zhì)的細(xì)胞在有益于結(jié)合的條件下相接觸，b)從與所述細(xì)胞未結(jié)合的結(jié)合分子中分離并回收與在其表面上表達(dá)導(dǎo)致活體發(fā)生疾病的感染因子蛋白質(zhì)的細(xì)胞結(jié)合的結(jié)合分子，c)分離至少一種回收的結(jié)合分子，d)檢驗(yàn)分離的結(jié)合分子是否具有中和導(dǎo)致活體發(fā)生疾病的感染因子的活性。在其表面上表達(dá)導(dǎo)致活體發(fā)生疾病的感染因子的蛋白質(zhì)的細(xì)胞可以是用所述蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知除了蛋白質(zhì)之外的感染因子抗原也可成功用于該方法中。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是PER. C6 細(xì)胞。 然而，其它(El-無(wú)限增殖化的)細(xì)胞系也可以用于表達(dá)蛋白質(zhì)，如BHK、CHO、NS0, HEK293 或者911細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子是人結(jié)合分子。所述感染因子可以是病毒、細(xì)菌、酵母、真菌或者寄生蟲。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)是在感染因子表面上正常表達(dá)的蛋白質(zhì)，或者包含可在表面接近的蛋白質(zhì)的至少一部分。在一個(gè)特定實(shí)施方案中， 可復(fù)制遺傳包裝表面上的結(jié)合分子集合用用于表達(dá)感染因子蛋白質(zhì)的細(xì)胞扣除/反選擇 (subtracted/counterselected)，即該細(xì)胞與步驟a中使用的細(xì)胞相同，條件是它們?cè)谄浔砻嫔喜槐磉_(dá)感染因子蛋白質(zhì)。被扣除/反選擇的細(xì)胞可以是未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞?；蛘?，細(xì)胞可以用一種蛋白質(zhì)或其(胞外)部分轉(zhuǎn)染，所述蛋白質(zhì)在序列或者結(jié)構(gòu)方面與感染因子的蛋白質(zhì)相似和/或高度同源，和/或其衍生自相同科或者甚至相同屬的感染因子。本發(fā)明另一方面涉及具有狂犬病病毒中和活性的結(jié)合分子，特征在于所述人結(jié)合分子包含至少一個(gè)重鏈⑶R3區(qū)，該⑶R3區(qū)包含SEQ ID NO :25的氨基酸序列，進(jìn)一步特征在于所述人結(jié)合分子具有至少2500IU/mg蛋白質(zhì)的狂犬病病毒中和活性。更優(yōu)選地，所述人結(jié)合分子具有至少^00IU/mg蛋白質(zhì)、3000IU/mg蛋白質(zhì)、3200IU/mg蛋白質(zhì)、3400IU/ mg蛋白質(zhì)、3600IU/mg蛋白質(zhì)、3800IU/mg蛋白質(zhì)、4000IU/mg蛋白質(zhì)、4200IU/mg蛋白質(zhì)、 4400IU/mg 蛋白質(zhì)、4600IU/mg 蛋白質(zhì)、4800IU/mg 蛋白質(zhì)、5000IU/mg 蛋白質(zhì)、5200IU/mg 蛋白質(zhì)、5400IU/mg蛋白質(zhì)的狂犬病病毒中和活性。結(jié)合分子的中和活性通過體外中和分析測(cè)定(修改的 RFFIT (快速熒光灶抑制試驗(yàn)，rapid fluorescent focus inhibition test))。 這個(gè)分析在實(shí)施例章節(jié)中詳細(xì)描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含一條可變重鏈，該可變重鏈包含SEQ ID NO 273所示氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述結(jié)合分子包含一條重鏈，該重鏈包含 SEQ ID NO :123所示氨基酸序列。所述結(jié)合分子的可變輕鏈可包含SEQ ID NO :275所示的
27氨基酸序列。所述結(jié)合分子的輕鏈可包含SEQ ID NO :125所示的氨基酸序列。編碼上述結(jié)合分子的核酸分子也是本發(fā)明的一部分。優(yōu)選地，所述核酸分子包含 SEQ ID NO :122所示核苷酸序列。另外，所述核酸分子還可包含SEQ ID NO :1 所示核苷酸序列。本發(fā)明還提供了包含所述核酸分子的載體及包含這種載體的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞如人細(xì)胞。適于產(chǎn)生人結(jié)合分子的細(xì)胞的例子是HeLa、911、AT1080、 A549、293和HEK293T細(xì)胞。優(yōu)選的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人視網(wǎng)膜細(xì)胞如911細(xì)胞或者于1996 年2月四日保藏在歐洲動(dòng)物細(xì)胞保藏中心(ECACC ;CAMR，Salisbury，Wiltshire SP4 OJG, Great Britain)的保藏號(hào)為 96022940 的細(xì)胞系，其商標(biāo)為 PER. C6 (PER. C6 是 Crucell Holland B. V.的注冊(cè)商標(biāo))。在本申請(qǐng)中，“PER. C6”是指以保藏號(hào)9602^40保藏的細(xì)胞或其祖先、上游或下游傳代以及來(lái)自保藏細(xì)胞的祖先的后代以及任何前述細(xì)胞的衍生物。
實(shí)施例為了例證本發(fā)明，提供了如下實(shí)施例。所述實(shí)施例非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1人抗狂犬病病毒抗體CR-57和CR-JB的表位識(shí)別為了確定稱作CR-57和CR-JB的人單克隆抗體是否識(shí)別非重疊的、非競(jìng)爭(zhēng)的表位， 產(chǎn)生稱作CR-57和CR-JB的人單克隆抗體的逃逸病毒。通過將相應(yīng)抗體基因的可變重鏈和輕鏈編碼區(qū)導(dǎo)入稱作pcDNA3002 (Neo)的人IgGl表達(dá)載體中，CR-57和CR-JB基本如(見 Jones et al.，2003)所述產(chǎn)生。所得載體pgS057Cll和pgSOJBCll用于在細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，所述細(xì)胞來(lái)自于1996年2月四日以保藏號(hào)9602^40保藏在歐洲動(dòng)物細(xì)胞保藏中心 (ECACC ;CAMR，Salisbury，Wiltshire SP4 0JG, Great Britain)的商標(biāo)為 PER. C6 的細(xì)胞系。這些抗體的重鏈和輕鏈的核苷酸和氨基酸序列分別示于SEQ ID N0:122-U9。將狂犬病病毒株CVS-Il的系列稀釋液(0. 5ml)(稀釋范圍I(T1-KTs)與恒定量( 4IU/ml)的抗體CR-57或CR-JB (0. 5ml)在37°C /5% CO2條件下保溫1小時(shí)，之后加入含有小鼠成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞(MNA細(xì)胞)或者BSR細(xì)胞(幼倉(cāng)鼠腎樣細(xì)胞系)的孔中。在存在人單克隆抗體CR-57或CR-JB的條件下選擇3天后，收獲含有潛在逃逸病毒的培養(yǎng)基(Iml)，在4°C貯存直至進(jìn)一步應(yīng)用。隨后，將細(xì)胞用丙酮在4°C固定20分鐘，在37°C /5% CO2條件下用抗狂犬病病毒N-FITC抗體綴合物(Centocor)染色過夜。通過免疫熒光記錄每個(gè)孔中轉(zhuǎn)化灶 (foci)的數(shù)目，選擇含有1-6個(gè)轉(zhuǎn)化灶的孔中的培養(yǎng)基進(jìn)行病毒擴(kuò)增。所有的E57逃逸病毒均從一個(gè)轉(zhuǎn)化灶中產(chǎn)生，E57B1除外(3個(gè)轉(zhuǎn)化灶)。EJB逃逸病毒分別分離自1個(gè)轉(zhuǎn)化灶(EJB3F)、3個(gè)轉(zhuǎn)化灶(EJB2B)、4個(gè)轉(zhuǎn)化灶(EJB2C)、5個(gè)轉(zhuǎn)化灶(EJB2E、2F)或者6個(gè)轉(zhuǎn)化灶(EJB2D)。每個(gè)逃逸病毒均首先在BSR或MNA細(xì)胞上根據(jù)其生長(zhǎng)特性小規(guī)模擴(kuò)增。然后將這些小批量的病毒用于在MNA或BSR細(xì)胞上進(jìn)一步大規(guī)模擴(kuò)增。然后將擴(kuò)增的病毒在 MNA細(xì)胞上滴定，以確定每個(gè)逃逸病毒批次物的效價(jià)以及逃逸病毒的最佳稀釋度(在M小時(shí)后產(chǎn)生80-100%感染)，以在病毒中和分析中使用。進(jìn)行修改的RFFIT (快速熒光灶抑制試驗(yàn))分析，以檢測(cè)E57 (CR-57的逃逸病毒) 和EJB (CR-JB的逃逸病毒)分別與CR-JB和CR-57的交叉保護(hù)作用。因此，從1 5稀釋開始對(duì)CR-57或CR-JB進(jìn)行系列3倍稀釋。向每個(gè)稀釋液中加入一定濃度的狂犬病病毒(CVS-11毒株)，使得產(chǎn)生80-100%感染。將病毒/IgG混合物在37°C /5% CO2條件下保溫1小時(shí)，之后加入MNA細(xì)胞中。在感染后M小時(shí)(在34°C/5% CO2條件下)，將細(xì)胞在 4°C用丙酮固定20分鐘，用抗狂犬病病毒N-FITC抗體綴合物(Centocor)進(jìn)行最少3小時(shí)染色。然后在熒光顯微鏡下分析孔的狂犬病病毒感染情況，以確定50%終點(diǎn)稀釋度。這是在這個(gè)分析中病毒感染被阻斷50%的稀釋度。為了計(jì)算效力，在每個(gè)修改的RFFIT中均包括國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)(Rabies Immune Globulin Lot R3，來(lái)自 Mandards and Testing DMPQ/CBER/ FDA實(shí)驗(yàn)室的參考材料)。這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的50%終點(diǎn)稀釋度相應(yīng)于效力為2IU/ml。對(duì)單獨(dú)的人單克隆抗體CR-57和CR-JB以及這些抗體的組合的中和效力進(jìn)行測(cè)試。EJB病毒不再由CR-JB或者CR-57中和(見表1所示)，提示這兩種抗體結(jié)合狂犬病病毒糖蛋白的相似區(qū)域并誘導(dǎo)其中氨基酸改變。E57病毒不再由CR-57中和，而6個(gè)E57 病毒中有4個(gè)病毒仍由CR-JB中和，但效力較低(見表1所示)?？贵wCR-57和CR-JB的混合物(1 lIU/mg比率)提供與單一抗體相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。為了鑒別狂犬病病毒糖蛋白中可能的突變，確定每個(gè)EJB和E57逃逸病毒的糖蛋白開放讀框(ORF)的核苷酸序列。每個(gè)逃逸病毒和CVS-Il的病毒RNA均分離自病毒感染的MNA細(xì)胞，通過標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR轉(zhuǎn)變?yōu)閏DNA。隨后，使用cDNA對(duì)狂犬病病毒糖蛋白ORF進(jìn)行核苷酸測(cè)序以鑒別突變。E57和EJB逃逸病毒均示出在糖蛋白的相同區(qū)域中的突變(分別見圖1和2所示； 見圖1和2描述的全部序列SEQ ID NO :130-151)。這表明這兩種抗體識(shí)別重疊表位。由上文可以推斷混合物中CR-57和CR-JB的組合不阻止中和抗性變體的逃逸，并因此不是狂犬病暴露后預(yù)防的理想的免疫球蛋白制品。實(shí)施例2用狂犬病接種的供體的外周血淋巴細(xì)胞構(gòu)建scFv噬菌體展示文庫(kù)在最后一次加強(qiáng)免疫后一周從4個(gè)狂犬病接種的人個(gè)體的靜脈中取50ml血。 用Ficoll細(xì)胞密度分級(jí)分離從這些血樣中分離外周血淋巴細(xì)胞(PBL)。血清冷凍保存在-20°C。在狂犬病病毒糖蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上用FACS染色測(cè)得血清中抗狂犬病抗體的存在呈陽(yáng)性。用有機(jī)相分離(TRIZ0L )和隨后的乙醇沉淀從PBL中制備總RNA。將獲得的RNA溶解在DEPC處理的超純水中，通過OD 260nm測(cè)量確定濃度。之后，將RNA稀釋至IOOng/ μ 1的濃度。接著，如下將Iyg RNA轉(zhuǎn)化成cDNA 向10 μ 1總RNA中加入13 μ 1 DEPC處理的超純水和1 μ 1隨機(jī)六聚體(500ng/ μ 1)，將獲得的混合物在65°C加熱5分鐘并在濕冰上迅速冷卻。然后，向混合物中加入8 μ 1 5X第一鏈緩沖液、2 μ 1 dNTP (各IOmM)、 2 μ 1 DTT (0. 1Μ)、2μ 1 Rnase 抑制劑 0OU/μ 1)禾口 2 μ 1 Superscription III MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶QOOU/μΙ)，在室溫保溫5分鐘，并在50°C保溫1小時(shí)。通過熱失活終止反應(yīng)，即將混合物在75°C保溫15分鐘。用DEPC處理的超純水將獲得的cDNA產(chǎn)物稀釋至終體積為200 μ 1。獲得的cDNA 產(chǎn)物的稀釋液的50倍稀釋溶液(于IOmM Tris緩沖液中)的OD^Onm的值為0. 1。對(duì)于每一供體，5-10 μ 1稀釋的cDNA產(chǎn)物用作模板，用特異性寡核苷酸引物(見表2-7)PCR擴(kuò)增免疫球蛋白γ重鏈家族和κ或λ輕鏈序列。在終體積50 μ 1的20mM Tris-HCl(pH 8.4)、50mM KC1、2. 5mM MgCl2、250yM dNTP 和 1. 25 單位 Taq 聚合酶中，PCR 反應(yīng)混合物除了含有稀釋的cDNA產(chǎn)物之外還含有25pmol有義引物和25pmol反義引物。在溫度為96°C的加熱蓋熱循環(huán)儀中，獲得的混合物快速解鏈2分鐘，隨后30個(gè)循環(huán)的96°C 30 秒、60°C 30 秒和 72 0C 60 秒。在第一輪擴(kuò)增中，17種輕鏈可變區(qū)有義引物(針對(duì)λ輕鏈有11種 (見表2)，針對(duì)κ輕鏈有6種)的每一種與識(shí)別C- κ的稱為HuCk5 ‘ -ACAC TCTCCCCTGTTGAAGCTCTT-3 ‘(見 SEQ ID NO :152)或識(shí)別 C-λ 恒定區(qū)的稱為 HuC λ 2 5 ‘ -TGAACATTCTGTAGGGGCCACTG-3 ‘(見 SEQ ID NO :153)禾口 HuC λ 7 5 ‘ -AGAGCATTCTGCAGGGGCCACTG-3 ‘(見 SEQ ID NO 154)的反義引物(HuC λ 2 和 HuC λ 7 反義引物在使用前等摩爾混和)組合，產(chǎn)生4倍的約600堿基對(duì)的17種產(chǎn)物。這些產(chǎn)物在 2%瓊脂糖凝膠上純化并用Qiagen凝膠提取柱從凝膠中分離。在一使用相同的17種有義引物的如上所述相同的PCR反應(yīng)中使用1/10每種分離的產(chǎn)物，其中每種λ輕鏈有義引物與 3種JX-區(qū)特異性反義引物的一種組合，每種κ輕鏈有義引物與5種Jk-區(qū)特異性反義引物的一種組合。用于第二個(gè)擴(kuò)增中的引物用限制位點(diǎn)延伸(見表4)以使得直接克隆在噬菌體展示載體PDV-C06中(見圖3和SEQ ID NO :155)。這產(chǎn)生4倍約350堿基對(duì)的63 種產(chǎn)物，這些產(chǎn)物混和(pooled)成總共10個(gè)級(jí)分。選擇這一數(shù)量的級(jí)分以保持不同輕鏈家族在文庫(kù)內(nèi)的天然分布而不會(huì)過度代表某些家族或某些家族代表不足。用家族內(nèi)的等位基因數(shù)量確定文庫(kù)內(nèi)呈現(xiàn)的百分比(見表幻。在下一步，將2. 5yg混和的級(jí)分和IOOyg PDV-C06載體用MlI和NotI消化并從凝膠中純化。之后，在16°C如下連接過夜在含有 50mM Tris-HCKpH 7. 5) UOmM MgCl2UOmM DTTUmM ΑΤΡ,25μ g/ml BSA 禾口 2· 5 μ 1 Τ4 DNA 連接酶GOOU/μ 1)的總體積為50 μ 1的連接混合物中向500ng PDV-C06載體中加入70ng 混和的級(jí)分。每種混和的級(jí)分均進(jìn)行這一程序。用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法經(jīng)苯酚/氯仿、氯仿提取和乙醇沉淀而純化連接混合物。將獲得的DNA溶解在50 μ 1超純水中，根據(jù)廠商方案(Stratagene)每種連接混合物2倍2. 5 μ 1等份被電穿孔進(jìn)40 μ 1 TGl感受態(tài)大腸桿菌細(xì)菌中。轉(zhuǎn)化子在含有補(bǔ)加50 μ g/ml氨芐青霉素和4. 5%葡萄糖的2TY瓊脂的30個(gè)培養(yǎng)皿上于37°C過夜生長(zhǎng)(每種混和的級(jí)分3個(gè)培養(yǎng)皿，培養(yǎng)皿尺寸MOmm χ 240mm)。通過從瓊脂平板上刮下轉(zhuǎn)化子獲得輕鏈可變區(qū)的(亞)文庫(kù)。這一(亞)文庫(kù)被直接用于用 Qiagen QIAFilter MAXI pr印試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒DNA制備。對(duì)于每種供體，以如上針對(duì)輕鏈區(qū)所述的類似的兩輪PCR程序和相同反應(yīng)參數(shù)從相同cDNA制備物中擴(kuò)增重鏈免疫球蛋白序列，條件是使用表6和表7的引物。用一組9個(gè)有義方向引物(見表6 ；覆蓋全部重鏈可變區(qū)家族)進(jìn)行第一次擴(kuò)增，每種引物與稱為HuCIgG 5' -GTC CAC CTT GGT GTT GCT GGG CTT-3‘ (SEQ ID NO :156)的 IgG 特異性恒定區(qū)反義引物組合，產(chǎn)生4倍約650堿基對(duì)的9種產(chǎn)物。這些產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上純化并用 Qiagen凝膠提取柱從凝膠中分離。在如上所述的使用相同9種有義引物的相同PCR反應(yīng)中使用1/10每種分離的產(chǎn)物，其中每種重鏈有義引物與4種JH區(qū)特異性反義引物中的一種組合。第二輪中使用的引物用限制位點(diǎn)延伸(見表7)以使得在輕鏈(亞)文庫(kù)載體中定向克隆。這導(dǎo)致每個(gè)供體產(chǎn)生為約350堿基對(duì)的36種產(chǎn)物。這些產(chǎn)物根據(jù)每種使用的 (VH)有義引物每種供體混和成9種級(jí)分。獲得的產(chǎn)物用Qiagen PCR純化柱純化。接著，將級(jí)分用SfiI和B10I消化并使用上述針對(duì)輕鏈(亞)文庫(kù)所述的相同連接程序和體積連接進(jìn)輕鏈(亞)文庫(kù)載體中，該輕鏈(亞)文庫(kù)載體已用相同限制酶切割。或者，所述級(jí)分用 NcoI和B10I消化并使用上述針對(duì)輕鏈(亞)文庫(kù)所述的相同連接程序和體積連接進(jìn)輕鏈載體中，該輕鏈載體已用相同限制酶切割。還根據(jù)以上針對(duì)輕鏈(亞)文庫(kù)所述那樣進(jìn)行連接純化和所得確定文庫(kù)的后續(xù)轉(zhuǎn)化，在此時(shí)根據(jù)每VH庫(kù)組合每個(gè)供體的連接混合物。轉(zhuǎn)化子在含有補(bǔ)加了 50 μ g/ml氨芐青霉素和4. 5%葡萄糖的2TY瓊脂的27個(gè)培養(yǎng)皿中生長(zhǎng) (每個(gè)混和的級(jí)分3個(gè)培養(yǎng)皿；培養(yǎng)皿尺寸240mm χ 240mm)。所有細(xì)菌收集在含有50 μ g/ ml氨芐青霉素和4. 5%葡萄糖的2TY培養(yǎng)基中，與甘油混和至15% (ν/ν)并以1. 5ml等份冷凍在-80°C。每一文庫(kù)的拯救和選擇如下所述進(jìn)行。實(shí)施例3攜帶特異性識(shí)別狂犬病病毒糖蛋白的單鏈Fv片段的噬菌體的選擇基本上如美國(guó)專利6，265，150和WO 98/15833 (兩者均引入本文作參考)所述， 用抗體噬菌體展示文庫(kù)、通用噬菌體展示技術(shù)和Mabstract 技術(shù)選擇抗體片段。所用抗體噬菌體文庫(kù)是兩種不同的半合成scFv噬菌體文庫(kù)(JK1994和WT2000)以及實(shí)施例2中制備的免疫scFv噬菌體文庫(kù)(RAB-03-G01和RAB-04-G01)。第1種半合成scFv噬菌體文庫(kù)(JK1994)在 de Kruifet al. (1995b)中描述，第 2 種(WT2000)基本上如 de Kruifet al. (1995b)所述構(gòu)建。簡(jiǎn)單地說(shuō)，文庫(kù)具有半合成形式，其中用將變異摻入CDR區(qū)域內(nèi)的簡(jiǎn)并寡核苷酸將變異摻入重鏈和輕鏈V基因中。僅僅VH3重鏈基因被使用，其與κ和λ輕鏈基因組合。重鏈的CDRl和CDR3以及輕鏈的CDR3在與de Kruif et al. (1995b)所述類似的基于PCR的途徑中合成構(gòu)建。由此構(gòu)建的V區(qū)基因以scFv形式依次克隆在噬菌粒載體中并被擴(kuò)增以產(chǎn)生如前所述的噬菌體文庫(kù)。另外WO 02/103012(引入本文作參考)所述的方法和輔助噬菌體用于本發(fā)明中。為了鑒別識(shí)別狂犬病病毒糖蛋白的噬菌體抗體，用通過β-丙內(nèi)酯處理而滅活的完全狂犬病病毒(狂犬病病毒Pitman-Moore毒株)、純化的狂犬病病毒糖蛋白(狂犬病病毒ERA毒株)和/或表達(dá)狂犬病病毒G蛋白(狂犬病病毒ERA 毒株)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行噬菌體選擇實(shí)驗(yàn)。如下從狂犬病病毒ERA毒株純化G蛋白。向病毒溶液中加入1/10體積的10% 辛基- β -吡喃葡糖苷并溫和混合。在4°C保溫30分鐘，在SW51轉(zhuǎn)子中離心病毒樣品 (36000rpm，4°C )。收集上清并在4°C對(duì)0. IM Tris/EDTA透析過夜。隨后，從透析腔收集糖蛋白，等分并儲(chǔ)存于-80°C直至進(jìn)一步使用。在0D280測(cè)蛋白質(zhì)濃度，由SDS-PAGE分析G蛋白完整性。完整的滅活狂犬病病毒或狂犬病病毒G蛋白在磷酸鹽緩沖鹽水(PBQ中稀釋，將 2_3ml加至MaxiSorp Nunc-Immuno Tubes (Nunc)并在旋轉(zhuǎn)輪上于4°C保溫過夜。一等份噬菌體文庫(kù)(500μ1，約IO13Cfu，用CT輔助噬菌體擴(kuò)增(見WO 02/103012))在封閉緩沖液
補(bǔ)體素(ftx)tifar)于PBS中)中于室溫封閉1-2小時(shí)。將封閉的噬菌體文庫(kù)加到免疫管中(與或未與CR-57 scFv預(yù)保溫以封閉由CR-57識(shí)別的表位)，在室溫保溫2小時(shí)，并用洗滌緩沖液(0. l%Tween-20 (Serva)于PBS中)洗滌以除去未結(jié)合的噬菌體。結(jié)合的噬菌體然后通過在室溫與Iml的50mM甘氨酸-HCl pH 2. 2保溫10分鐘而從抗原中洗脫。隨后， 洗脫的噬菌體與0. 5ml的IM Tris-HCl pH7. 5混和以中和pH。用混合物感染已在37°C生長(zhǎng)至0D600nm約0. 3的5ml XLl-Blue大腸桿菌培養(yǎng)物。噬菌體在37°C感染XLl-Blue細(xì)菌 30分鐘。然后，混合物在3200Xg于室溫離心10分鐘，細(xì)菌沉淀重懸于0. 5ml的2-trypton 酵母提取物(2TY)培養(yǎng)基中。獲得的細(xì)菌懸浮液分在補(bǔ)加了四環(huán)素、氨芐青霉素和葡萄糖的兩個(gè)2TY瓊脂平板上。平板在37°C過夜保溫后，從平板刮下菌落并用于制備富集的噬菌
31體文庫(kù)，基本上如De Kruifet al. (1995a)和WO 02/103012所述。簡(jiǎn)單地，用刮下的細(xì)菌接種含有氨芐青霉素、四環(huán)素和葡萄糖的2TY培養(yǎng)基，在37°C生長(zhǎng)至0D600nm為約0. 3。加入CT輔助噬菌體并感染細(xì)菌，之后培養(yǎng)基變?yōu)楹邪逼S青霉素、四環(huán)素和卡那霉素的2TY。 繼續(xù)在30°C保溫過夜。第2天，細(xì)菌通過離心從2TY培養(yǎng)基中除去，之后培養(yǎng)基中的噬菌體用聚乙二醇(PEG)6000/NaCl沉淀。最后，將噬菌體溶于含有牛血清白蛋白(BSA)的 2ml PBS中，過濾滅菌并用于下一輪選擇。還用狂犬病病毒糖蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行了噬菌體選擇。所用細(xì)胞是來(lái)自在1996 年2月29日保藏在歐洲動(dòng)物細(xì)胞保藏中心(ECACC)，CAMR，Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Great Britain的保藏號(hào)為9602^40的細(xì)胞系的細(xì)胞，該細(xì)胞系以PER. C6 的商標(biāo)在市場(chǎng)上銷售。它們以下被稱為PER. C6 細(xì)胞。此處，封閉的噬菌體文庫(kù)Oml)首先被加到IX IO7Subtractor細(xì)胞中(在DMEM/10 % FBS中)并在一旋轉(zhuǎn)輪上于4°C保溫1小時(shí)。Subtractor細(xì)胞是在其表面表達(dá)與狂犬病病毒跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域融合的皰疹性口腔炎病毒(VSV)糖蛋白胞外域(ectodomain)的PER. C6 細(xì)胞。隨著這一扣除步驟，識(shí)別 VSV糖蛋白或特異于PER. C6 細(xì)胞的抗原的噬菌體被從噬菌體文庫(kù)中除去。離心噬菌體 /細(xì)胞混合物(500Xg 5分鐘，4°C)以除去細(xì)胞結(jié)合的噬菌體，將上清加入到含有3ml的 IX Io7Subtractor細(xì)胞的新試管中。這一扣除步驟用各個(gè)上清重復(fù)2次。隨后，在一旋轉(zhuǎn)輪上將扣除的噬菌體與表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白的轉(zhuǎn)染細(xì)胞(PER. C6 細(xì)胞(3X IO6細(xì)胞) 在4°C保溫1. 5小時(shí)。之前，轉(zhuǎn)染細(xì)胞與或未與CR-57scFV預(yù)保溫以封閉由CR-57識(shí)別的表位。保溫后，細(xì)胞用Iml的DMEM/10% FBS洗5次(每次洗滌細(xì)胞均重懸并移至新試管)， 如上所述洗脫并加工噬菌體。典型地，在分離各個(gè)噬菌體抗體之前進(jìn)行兩輪選擇。在第2輪選擇后，用各個(gè)大腸桿菌菌落制備單克隆噬菌體抗體?；旧?，在96孔板中將各個(gè)菌落生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期并用 VCSM13輔助噬菌體感染，之后使噬菌體抗體產(chǎn)生進(jìn)行過夜。產(chǎn)生的噬菌體抗體用PEG/NaCl 沉淀、過濾滅菌并在ELISA中測(cè)試與完整滅活的狂犬病病毒和純化的狂犬病病毒G蛋白的結(jié)合。從選擇中獲得一大組噬菌體抗體，證實(shí)與完整滅活的狂犬病病毒和狂犬病病毒G蛋白均結(jié)合(見下述實(shí)施例)。用上述免疫文庫(kù)進(jìn)行兩種選擇策略。在第一種策略中，在第一輪和第二輪選擇中用滅活病毒或純化的G蛋白的兩輪選擇后選擇了 736種噬菌體抗體。在第二種選擇策略中，在第一輪選擇用細(xì)胞表面表達(dá)的重組G蛋白和在第二輪選擇中用滅活病毒或純化的G蛋白的兩輪選擇后選擇了 736種噬菌體抗體。用第一種策略獲得的獨(dú)特噬菌體抗體數(shù)量是97，而第二種策略產(chǎn)生70種獨(dú)特噬菌體抗體。第一種策略發(fā)現(xiàn)的97種獨(dú)特噬菌體抗體產(chǎn)生18種中和抗體，第二種策略鑒別的70種獨(dú)特克隆產(chǎn)生33種中和抗體。 這清楚表明包括狂犬病病毒糖蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，即細(xì)胞表面表達(dá)的重組G蛋白作為抗原的選擇與僅使用純化的G蛋白和/或滅活病毒的選擇相比似乎產(chǎn)生更多的中和抗體。實(shí)施例4狂犬病病毒糖蛋白特異性單鏈?zhǔn)删w抗體的確認(rèn)在上述篩選中獲得的選擇的單鏈?zhǔn)删w抗體在ELISA中確認(rèn)特異性，即與如上所述純化的狂犬病病毒G蛋白的結(jié)合。另外，還測(cè)試了單鏈?zhǔn)删w抗體與5% FBS的結(jié)合。 為此，用狂犬病病毒G蛋白或5% FBS包被Maxisorp ELISA平板。包被后，在室溫將板在 PBS/1%補(bǔ)體素中封閉1小時(shí)。選擇的單鏈?zhǔn)删w抗體在等體積的PBS/1%補(bǔ)體素中保溫15分鐘以獲得封閉的噬菌體抗體。倒空平板，向孔中加入被封閉的噬菌體抗體。保溫1小時(shí)， 將平板在含有0. 1% Tween-20的PBS中洗滌，用與過氧化物酶綴合的抗M13抗體檢測(cè)結(jié)合的噬菌體抗體(用0D492nm測(cè)量)。作為對(duì)照，不使用單鏈?zhǔn)删w抗體、使用針對(duì)CD8的陰性對(duì)照單鏈?zhǔn)删w抗體(SC02-007)或使用針對(duì)狂犬病病毒糖蛋白的陽(yáng)性對(duì)照單鏈?zhǔn)删w抗體(scFv S057)同時(shí)進(jìn)行所述程序。如表8所示，稱為SC04-001、SC04-004、SC04-008、 SC04-010、SC04-018、SC04-021、SC04-026、SC04-03U SC04-038、SC04-040、SC04-060、 SC04-073、SC04-097、SC04—098、SC04—103、SC04—104、SC04—108、SC04—120、SC04—125、 SC04-126、SC04-140、SC04-144、SC04-146和SC04-164的選擇的噬菌體抗體展示與固定化的純化的狂犬病病毒G蛋白的顯著結(jié)合，但未觀察到與FBS的結(jié)合。在使用如上所述制備的完整滅活的狂犬病病毒的ELISA中獲得相同結(jié)果(數(shù)據(jù)未示出)。實(shí)施例5狂犬病病毒特異性scFv的鑒定從選擇的特異性單鏈?zhǔn)删w抗體(scFv)克隆獲得質(zhì)粒DNA并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定核苷酸序列。稱為 SC04-001、SC04-004、SC04-008、SC04-010、SC04-018、SC04-021、 SC04-026、SC04-031、SC04-038、SC04-040、SC04-060、SC04-073、SC04-097、SC04-098、 SC04-103、SC04-104、SC04-108、SC04-120、SC04-125、SC04-126、SC04-140、SC04-144、 SC04-146和SC04-164的scFv的核苷酸序列(包括用于克隆的限制位點(diǎn))分別示于SEQ ID NO :157,SEQ ID NO 159,SEQ ID NO 161,SEQ ID NO 163,SEQ ID NO 165,SEQ ID NO: 167,SEQ ID NO 169,SEQ ID NO :171、SEQ ID NO 173、SEQ ID NO 175、SEQ ID NO 177,SEQ ID NO :179,SEQ ID NO 181,SEQ ID NO 183,SEQ ID NO 185,SEQ ID NO 187,SEQ ID NO: 189,SEQ ID NO 191,SEQ ID NO 193,SEQ ID NO :195、SEQ ID NO :197、SEQ ID NO 199、SEQ ID NO :201 和 SEQ ID NO :203。稱為 SC04-001、SC04-004、SC04-008、SC04-010、SC04-018、 SC04-021、SC04-026、SC04-031、SC04-038、SC04-040、SC04-060、SC04-073、SC04-097、 SC04-098、SC04-103、SC04-104、SC04-108、SC04-120、SC04-125、SC04-126、SC04-140、 SC04-144、SC04-146 和 SC04-164 的 scFv 的氨基酸序列分別示于 SEQ ID NO :158、SEQ ID NO :160, SEQ ID NO :162、SEQ ID NO :164、SEQ ID NO :166、SEQ ID NO :168、SEQ ID NO 170、SEQ ID NO :172、SEQ ID NO :174、SEQ ID NO :176、SEQ ID NO :178、SEQ ID NO :180、 SEQ ID NO :182,SEQ ID NO 184,SEQ ID NO 186,SEQ ID NO 188,SEQ ID NO 190,SEQ ID NO :192,SEQ ID NO 194,SEQ ID NO :196、SEQ ID NO 198,SEQ ID NO :200、SEQ ID NO :202 和 SEQ ID NO :204ο特異性結(jié)合狂犬病病毒G蛋白的scFv的VH和VL基因相同性(參見1Toml inson IM, Williams SC, Ignatovitch 0, Corbett SJ, Winter G. V-BASE Sequence Directory. Cambridge United Kingdom :MRC Centre for Protein Engineering (1997))禾口重鏈 CDR3 組成見表9所示。實(shí)施例6狂犬病病毒特異性scFv對(duì)狂犬病病毒的體外中和(修改的RFFIT)為了確定選擇的scFv是否能阻斷狂犬病病毒感染，進(jìn)行了體外中和分析(修改的 RFFIT)。通過用1 5稀釋度開始的系列3倍稀釋而稀釋scFv制備物。狂犬病病毒(毒株CVS-11)以產(chǎn)生80-100%感染的濃度加入到每一稀釋液中。病毒/scFv混合物在加入到MNA細(xì)胞上之前在37°C /5% CO2下保溫1小時(shí)。感染后M小時(shí)(在34°C /5% CO2)，在 4°C用丙酮固定細(xì)胞20分鐘，用抗狂犬病N-FITC抗體綴合物(Centocor)染色最少3小時(shí)。 然后在熒光顯微鏡下分析細(xì)胞的狂犬病病毒感染以確定50%終點(diǎn)稀釋度。這是在這一分析中病毒感染被阻斷50%的稀釋度(見實(shí)施例1)。鑒別了幾種scFv，它們顯示出對(duì)狂犬病病毒的中和活性(見表10)。另外，通過如上所述的體外中和分析(修改的RFFIT)研究了是否選擇的scFv能中和實(shí)施例1制備的E57逃逸病毒(E57A2、E57A3、E57B1、E57B2、E57B3和E57C3)。鑒別了幾種scFv，它們顯示出對(duì)E57逃逸病毒的中和活性(見表IlA和11B)。實(shí)施例7使用scFv的狂犬病病毒G蛋白競(jìng)爭(zhēng)ELISA為鑒別與非重疊的非競(jìng)爭(zhēng)的表位結(jié)合的抗體，進(jìn)行了狂犬病糖蛋白競(jìng)爭(zhēng)ELISA。用在PBS(50yl)中的1 1000稀釋的純化狂犬病病毒糖蛋白(lmg/ml ；狂犬病病毒ERA毒株)在4°C包被Nunc-Immuno Maxisorp F96板(Nunc)過夜。洗掉未包被的蛋白質(zhì)，之后孔用100 μ 1的PBS/1%補(bǔ)體素在室溫封閉1小時(shí)。隨后棄掉封閉溶液并加入50μ 1于 PBS/1%補(bǔ)體素中的未純化的抗狂犬病病毒scFv(h稀釋的)。孔用100 μ 1的PBS/0. 05% Tween-20洗5次。然后，向每孔加入50 μ 1生物素化抗狂犬病病毒競(jìng)爭(zhēng)物IgG，CR-57bio, 在室溫保溫5分鐘，孔用100 μ 1的PBS/0. 05% Tween-20洗5次。為檢測(cè)CR-57bio的結(jié)合，將50 μ 1的1 2000稀釋的鏈霉親和素-HRP抗體(Becton Dickinson)加入到孔中并在室溫保溫1小時(shí)。如上所述再次洗孔，通過加入100 μ IOPD試劑(Sigma)而進(jìn)一步顯色 ELISA0通過加入50 μ 1的IM H2SO4終止反應(yīng)，在492nm測(cè)量OD0當(dāng)與scFv S057,即CR-57的scFv形式(S057的核苷酸和氨基酸序列分別見SEQ ID NO 205和206)或scFv SOJB,即CR-JB的scFv形式(S0JB的核苷酸和氨基酸序列分別見 SEQ ID NO :312和31 共保溫時(shí)，用CR_57bio單獨(dú)獲得的信號(hào)可被降低至背景水平。這表明scFv S057和SOJB通過與CR-57bio結(jié)合相同表位或重疊表位而競(jìng)爭(zhēng)分別競(jìng)爭(zhēng)CR-57bio 與狂犬病病毒糖蛋白的相互作用。相反，稱為SC02-007的無(wú)關(guān)scFv，即與⑶8結(jié)合的 scFv 不競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。稱為 SC04-004、SC04-010、SC04-024、SC04-060、SC04-073、SC04-097、 SC04-098、SC04-103、SC04-104、SC04-120、SC04-125、SC04-127、SC04-140、SC04-144 和 SC04-146的抗狂犬病病毒scFv不與CR_57bio競(jìng)爭(zhēng)，提示這些scFv結(jié)合與CR-57識(shí)別的表位不同的表位(見圖4)。用下述實(shí)驗(yàn)獲得類似的結(jié)果。首先，向用狂犬病病毒G蛋白包被的孔中加入狂犬病病毒抗體CR-57。接著，加入競(jìng)爭(zhēng)scFv。在這一設(shè)置中，抗狂犬病病毒scFv用抗VSV-HRP 根據(jù)scFv氨基酸序列中VSV-tag的存在而檢測(cè)(見圖5)。實(shí)施例8從選擇的抗狂犬病病毒單鏈Fv’ s構(gòu)建完全人免疫球蛋白分子(人單克隆抗狂犬病病毒抗體)稱為SC04-001、SC04-008、SC04-018、SC04-040 和 SC04-126 的 scFv 的重鏈和輕鏈可變區(qū)用寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增以附加限制位點(diǎn)和/或序列以分別在IgG表達(dá)載體 pSyn-C03-HC γ 1 (見 SEQ ID No :277)和 pSyn-C04_C λ (見 SEQ ID No :278)中表達(dá)。分別用表12和13所示寡核苷酸擴(kuò)增Vh和\基因，將PCR產(chǎn)物分別克隆進(jìn)載體pSyn-C03-HC y 1和 p^n-C04-C λ。稱為SC04-004、SC04-010、SC04-021、SC04-026、SC04-031、SC04-038、SC04-060、 SC04-073、SC04-097、SC04—098、SC04—103、SC04—104、SC04—108、SC04—120、SC04—125、 SC04-140、SC04-144、SC04-146和SC04-164的scFv的重鏈和輕鏈可變區(qū)也用寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增以附加限制位點(diǎn)和/或序列以分別在IgG表達(dá)載體pSyn-C03-HC γ 1和 pSyn-C05-C κ (見SEQ ID No :279)中表達(dá)。分別用表12和13所示寡核苷酸擴(kuò)增Vh和\ 基因，將PCR產(chǎn)物分別克隆進(jìn)載體pSyn-C03-HC γ 1和pSyn-C05-C κ中。寡核苷酸的設(shè)計(jì)是使得它們改正來(lái)自種系序列的任何偏差，這些偏差是在文庫(kù)構(gòu)建過程中由于用來(lái)擴(kuò)增龐大數(shù)量的抗體基因的寡核苷酸組數(shù)量有限而導(dǎo)入的。根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)驗(yàn)證了所有構(gòu)建體的核苷酸序列。所得到的編碼抗狂犬病病毒人IgGl重鏈的表達(dá)構(gòu)建體pgG104_001C03、 pgG104-008C03、pgG104_018C03、pgG104-040C03 和 pgG104_U6C03 與編碼相應(yīng)輕鏈的相關(guān)pSyn-C04-VX構(gòu)建體組合在細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)，并獲得含有IgGl抗體的上清。編碼抗狂犬病病毒人 IgGl 重鏈的表達(dá)載體 pgG104-004C03、pgG104_010C03、pgG104_021C03、 pgG104-026C03、pgG104_031C03、pgG104_038C03、pgG104_060C03、pgG104_073C03、 pgG104-097C03、pgG104_098C03、pgG104_103C03、pgG104_104C03、pgG104_108C03、 pgG104-120C03、pgG104_125C03、pgG104_140C03、pgG104_144C03、pgG104_146C03 和 pgG104-164C03與編碼相應(yīng)輕鏈的相關(guān)pSyn-C05-VK構(gòu)建體組合在細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)， 并獲得含有IgGl抗體的上清。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)確定了稱為CR04-001、CR04-004、CR04-008、CR04-010、CR04-018、 CR04-02U CR04-026, CR04-03U CR04-038、CR04-040, CR04-060, CR04-073, CR04-097, CR04-098、CR04-103、CR04-104、CR04-108、CR04-120、CR04-125、CR04-126、CR04-140、 CR04-144、CR04-146和CR04-164的抗體的重鏈和輕鏈的核苷酸和氨基酸序列。隨后，用通常用于免疫球蛋白的標(biāo)準(zhǔn)純化方法(參見例如W000/63403，引入本文作參考)在蛋白質(zhì)-A 柱上、隨后在脫鹽柱上緩沖液交換而純化所述重組人單克隆抗體。另外，對(duì)于CR04-098，根據(jù)針對(duì)分別編碼CR-57和CR-JB的載體pgS057Cll和 PgSOJBCll所述(見實(shí)施例1)產(chǎn)生稱為pgG104-098C10的單人IgGl表達(dá)載體。由載體 pgG104-098C10編碼的抗體CR04-098的重鏈和輕鏈的核苷酸和氨基酸序列分別示于SEQ ID NO :334-3370載體pgS057Cll (見實(shí)施例1)和pgG104_098C10分別用于在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)CR-57和CR04-098，所述細(xì)胞來(lái)自在1996年2月四日保藏在歐洲動(dòng)物細(xì)胞保藏中心 (ECACC)，CAMR，Salisbury，Wiltshire SP4 0JG, Great Britain 的保藏號(hào)為 9602^40 的細(xì)胞系，該細(xì)胞系以PER. C6⑥的商標(biāo)在市場(chǎng)上銷售。穩(wěn)定產(chǎn)生的CR-57和CR04-098的計(jì)算等電點(diǎn)分別為8. 22和8. 46。實(shí)驗(yàn)觀察到的CR-57的等電點(diǎn)在8. 1-8. 3之間，CR04-098的在 9. 0-9. 2之間。重組人單克隆抗體如上所述純化。除非另外描述，對(duì)于CR04-001、CR04-004、 CR04-008、CR04-010、CR04-018、CR04-021、CR04-026、CR04-031、CR04-038、CR04-040、 CR04-060, CR04-073, CR04-097、CR04-098、CR04-103, CR04-104、CR04-108、CR04-120、 CR04-125、CR04-126、CR04-140、CR04-144、CR04-146 和 CR04-164，使用由上述兩個(gè)載體系統(tǒng)瞬時(shí)表達(dá)的重組人單克隆抗體，對(duì)于CR57，使用由實(shí)施例1所述的一個(gè)載體系統(tǒng)瞬時(shí)表達(dá)的重組人單克隆抗體。
實(shí)施例9使用IgG的狂犬病病毒G蛋白競(jìng)爭(zhēng)ELISA為確定所述人單克隆抗狂犬病病毒G蛋白IgG是否結(jié)合非重疊的非競(jìng)爭(zhēng)性表位， 進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。具有包被的狂犬病病毒G蛋白的孔用增加濃度(0-50yg/ml)的未標(biāo)記的抗狂犬病病毒G蛋白IgG在室溫保溫1小時(shí)。然后，向每孔中加入50 μ 1不同的生物素化的抗狂犬病病毒IgG(l μ g/ml)，在室溫保溫5分鐘，立即用100 μ 1的PBS/0. 05% Tween-20洗 5次。隨后在室溫將孔與50μ 1的1 2000稀釋的鏈霉親和素-HRP(Becton Dickinson) 保溫1小時(shí)，洗滌并如上所述顯色。隨著未標(biāo)記IgG濃度增加信號(hào)降低，表明這兩種抗體互相競(jìng)爭(zhēng)并識(shí)別相同表位或重疊表位。或者，將用狂犬病病毒G蛋白(ERA毒株)包被的孔與50 μ g/ml未標(biāo)記的抗狂犬病病毒G蛋白IgG在室溫保溫1小時(shí)。然后向每孔加入50 μ 1生物素化CR57 (0. 5-5 μ g/ml ； 不完全飽和水平)。如上所述進(jìn)行進(jìn)一步的步驟。將獲得的信號(hào)與僅用生物素化CR57獲得的信號(hào)進(jìn)行比較(見圖6 ；無(wú)競(jìng)爭(zhēng)劑)。從圖6可以推出使用作為陰性對(duì)照的稱為CR02-428 的抗體的信號(hào)不降低。相反，用未標(biāo)記的CR57(陽(yáng)性對(duì)照)或CR-JB的競(jìng)爭(zhēng)降低信號(hào)至背景水平。從圖6可進(jìn)一步推出抗狂犬病病毒G蛋白IgG無(wú)一與CR-57顯著競(jìng)爭(zhēng)，這與實(shí)施例7描述的scFv競(jìng)爭(zhēng)數(shù)據(jù)一致。另外，通過流式細(xì)胞術(shù)在狂犬病病毒G蛋白(ERA毒株)轉(zhuǎn)染的PER. C6細(xì)胞上進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與20 μ 1未標(biāo)記的抗狂犬病病毒G蛋白IgG (50 μ g/ml)在4°C保溫20 分鐘。在用含1 % BSA的PBS洗滌細(xì)胞后，向每孔中加入20 μ 1生物素化的CR57 (0. 5-5 μ g/ ml ；在不完全飽和水平)，在4°C保溫5分鐘，立即用100 μ 1含1 % BSA的PBS洗2次。隨后，將孔與20 μ 1的1 200稀釋的鏈霉親和素-PE (Caltag)在4°C保溫15分鐘，洗滌并如上所述顯色。用生物素化CR57獲得的信號(hào)不能用陰性對(duì)照抗體CR02-^8顯著降低(見圖 7)。相反，用未標(biāo)記的CR57(陽(yáng)性對(duì)照)或CR-JB的競(jìng)爭(zhēng)降低信號(hào)至背景水平?？箍袢〔《綠蛋白IgG無(wú)一與CR-57顯著競(jìng)爭(zhēng)，例外是CR04-126，其降低信號(hào)至大約30% (見圖 7)。后者在ELISA中不競(jìng)爭(zhēng)(見圖6)。這可能是由于在FACS實(shí)驗(yàn)中糖蛋白被呈遞給抗體的方式與ELISA實(shí)驗(yàn)不同而導(dǎo)致的。CR04-126的結(jié)合可能更依賴于糖蛋白的構(gòu)象，導(dǎo)致在基于FACS的競(jìng)爭(zhēng)分析中用CR04-U6觀察到競(jìng)爭(zhēng)性作用，而在基于ELISA的分析中未觀察到。另外，CR04-008和CR04-010在基于FACS的競(jìng)爭(zhēng)分析中降低信號(hào)至約50% (見圖7)， 說(shuō)明它們可能與CR57競(jìng)爭(zhēng)。對(duì)于CR04-010，這卻沒有被scFv競(jìng)爭(zhēng)數(shù)據(jù)或基于ELISA的競(jìng)爭(zhēng)分析證實(shí)。對(duì)于其它的IgG，F(xiàn)ACS數(shù)據(jù)與各自的scFv和IgG的ELISA數(shù)據(jù)一致。實(shí)施例10抗狂犬病IgG在狂犬病病毒的體外中和作用中的加性/協(xié)同效應(yīng)GfSmRFFIT)為了確定抗狂犬病病毒G蛋白IgG在狂犬病病毒中和作用中是否具有加性或協(xié)同效應(yīng)，測(cè)試不同組合的IgG。首先，每種抗體的效力(以IU/mg表示)在一修改的RFFIT中確定(見實(shí)施例1)。然后，基于等量的IU/mg制備抗體組合并在修改的RFFIT中測(cè)試。可確定每種抗體組合的效力并與預(yù)期效力進(jìn)行比較。如果抗體組合的效力等于組合中存在的每種抗體的效力之和，則這些抗體具有加性效應(yīng)。如果抗體組合的效力更高，則這些抗體在狂犬病病毒中和中具有協(xié)同效應(yīng)?；蛘?，可通過下述實(shí)驗(yàn)確定加性或協(xié)同效應(yīng)。首先，在一標(biāo)準(zhǔn)RFFIT(參見 Laboratory techniques in rabies, Edited by :F.-X Meslin, Μ. M. Kaplan and H. Koprowski(1996),4th edition, Chapter 15, World Health Organization, Geneva)中確定待測(cè)抗體例如CR-57和CR04-098的效力。然后，將這些抗體以基于IU/ml為1 1的比例混合。這一抗體混合物與相同濃度的各個(gè)抗體一起在六個(gè)獨(dú)立的RFFIT實(shí)驗(yàn)中被測(cè)試以確定50%中和終點(diǎn)。隨后用由Chou et al. (1984)描述的公式CI = (Cl/Cxl) + (C2/ Cx2) + (ClC2/CxlCx2)確定抗體混合物的組合指數(shù)(Cl)。Cl和C2是當(dāng)組合應(yīng)用時(shí)導(dǎo)致50% 中和的單克隆抗體1和單克隆抗體2的量(以μ g表示)，Cxl和Cx2是當(dāng)單獨(dú)應(yīng)用時(shí)導(dǎo)致 50%中和的單克隆抗體1和單克隆抗體2的量(以yg表示)。CI = 1表示單克隆抗體的加性效應(yīng)，CI < 1表示單克隆抗體的協(xié)同效應(yīng)，CI >表示單克隆抗體的拮抗效應(yīng)。
實(shí)施例11 通過PEPSCAN-ELISA鑒別由重組人抗狂犬病病毒抗體識(shí)別的表位從狂犬病病毒毒株ERA的G蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域(狂犬病病毒毒株ERA的糖蛋白G的完整氨基酸序列見SEQ ID NO :207，胞外結(jié)構(gòu)域由氨基酸20-458組成；在EMBL 數(shù)據(jù)庫(kù)中狂犬病病毒毒株ERA的糖蛋白的蛋白質(zhì)id為合成15-mer線性和環(huán) (looped)/環(huán)狀(cyclic)肽，并如前所述(Slootstra et al. , 1996 ；WO 93/09872)用信用卡(credit-card)形式的mini-PEPSCAN卡055個(gè)肽形式/卡)進(jìn)行篩選。所有的肽均在氨基末端進(jìn)行乙?；?。在所有環(huán)肽中，第2位和第14位用半胱氨酸置換(乙酰-XCXXXXXXXXXXXCX-minicard)。如果在制備的肽中除了第2位和第4位的半胱氨酸之外還存在其它半胱氨酸，則用丙氨酸置換所述其它半胱氨酸。用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc化學(xué)合成環(huán)肽并用三氟酸和清除劑去保護(hù)。隨后，去保護(hù)的肽在卡上與在碳酸氫銨OOmM，pH 7.9/乙腈 (1 l(v/v))中的0.5mM 1，3-雙(溴甲基)苯溶液反應(yīng)。將卡完全浸在溶液中，同時(shí)在該溶液中輕輕搖動(dòng)卡30-60分鐘。最后，用過量的H2O徹底洗卡并在含1 % SDS/0. 1 % β -巰基乙醇的PBS (pH 7. 2)的破壞緩沖液中于70°C超聲30分鐘，隨后在H2O中再超聲45分鐘。 人單克隆抗體如上所述制備。在基于PEPSCAN的酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)中測(cè)試這些抗體與每一線性和環(huán)肽的結(jié)合。將含有共價(jià)連接的肽的455孔信用卡形式的聚丙烯卡與抗體 (10yg/ml ；在封閉溶液中稀釋，該封閉溶液含有5%馬血清(ν/ν)和5%卵清蛋白(w/v)) 保溫G°C，過夜)。洗滌后，將肽與抗人抗體過氧化物酶(稀釋度1/1000)保溫(1小時(shí)， 25°C )，隨后，在洗滌后加入過氧化物酶底物2,2'-連氮-二 -3-乙基苯并噻唑磺酸(2，2’ -azino-di-3-ethylbenzthiazoline sulfonate,ABTS)和 2μ 1/ml 3% H2O20 對(duì)照(針對(duì)線性和環(huán)肽)僅與抗人抗體過氧化物酶保溫。1小時(shí)后，測(cè)量顏色生成。用CCD相機(jī)和圖像處理系統(tǒng)量化ELISA的顏色生成。設(shè)備包括CXD相機(jī)和55mm鏡頭(Sony CXD Video Camera XC-77RR, Nikon micro-nikkor 55mm f/2. 8 鏡頭)、相機(jī)適配器(Sony Camera adaptor DC-77RR)和圖像處理軟件包 Optimas，版本 6. 5(Media Cybernetics, Silver Spring, MD 20910，U. S. A.)。Optimas在奔騰II計(jì)算機(jī)系統(tǒng)上運(yùn)行。測(cè)試了人抗狂犬病病毒G蛋白單克隆抗體與如上所述合成的15-mer線性和環(huán)/ 環(huán)狀肽的結(jié)合。當(dāng)OD值等于或高于所有肽的平均OD值(每抗體)的兩倍時(shí)，該肽被認(rèn)為是相關(guān)地結(jié)合一抗體。表14列出了稱為CR57、CRJB和CR04-010的人單克隆抗體與狂犬病病毒毒株ERA的糖蛋白G的胞外結(jié)構(gòu)域的線性肽的結(jié)合結(jié)果。顯示與各個(gè)抗體顯著結(jié)合的區(qū)域用灰色高亮顯示(見表14)。
抗體CR57與具有選自如下一組的氨基酸序列的線性肽結(jié)合 SLKGACKLKLCGVLG(SEQ ID NO 314)、LKGACKLKLCGVLGL(SEQ ID NO :315)、 KGACKLKLCGVLGLR(SEQ ID NO 316)、 GACKLKLCGVLGLRL(SEQ ID NO :317)、 ACKLKLCGVLGLRLM(SEQ ID NO 318)、 CKLKLCGVLGLRLMD(SEQ ID NO :319)、 KLKLCGVLGLRLMDG(SEQ ID NO 320)、LKLCGVLGLRLMDGT(SEQ ID NO :321)禾口 KLCGVLGLRLMDGTff (SEQ ID NO :322)(見表 14)。具有氨基酸序列 GACKLKLCGVLGLRL (SEQ ID NO :317)、ACKLKLCGVLGLRLM(SEQ ID NO :318)的肽的OD值比平均值的兩倍低。但是仍請(qǐng)求保護(hù)這些肽，因?yàn)樗鼈冊(cè)谟煽贵wCR57識(shí)別的抗原肽區(qū)域的鄰近。與具有氨基酸序列 KLCGVLGLRLMDGTff (SEQ ID NO :322)的肽的結(jié)合是最顯著的。抗體CR04-010與具有選自如下一組的氨基酸序列的線性肽結(jié)合 GFGKAYTIFNKTLME(SEQ ID NO 323)、FGKAYTIFNKTLMEA(SEQ ID NO :324)、 GKAYTIFNKTLMEAD (SEQ ID NO 325)、KAYTIFNKTLMEADA (SEQ ID NO :326)、 AYTIFNKTLMEADAH(SEQ ID NO 327)、YTIFNKTLMEADAHY(SEQ ID NO :328)、 TIFNKTLMEADAHYK (SEQ ID NO 329)、IFNKTLMEADAHYKS (SEQ ID NO :330)禾口 FNKTLMEADAHYKSV(SEQ ID NO :331)。具有氨基酸序列 AYTIFNKTLMEADAH(SEQ ID NO 327)、YTIFNKTLMEADAHY (SEQ ID NO 328)的肽的OD值比平均值的兩倍低。但是仍請(qǐng)求保護(hù)這些肽，因?yàn)樗鼈冊(cè)谟煽贵wCR04-010識(shí)別的抗原肽區(qū)域的鄰近。與具有氨基酸序列 TIFNKTLMEADAHYK(SEQ ID NO :329)、IFNKTLMEADAHYKS(SEQ ID NO 330)和 FNKTLMEADAHYKSV (SEQ ID NO 331)的肽的結(jié)合是最顯著的。CRJB和稱為CR04-040、CR04-098和CR04-103的抗體(數(shù)據(jù)未示出)不識(shí)別線性
抗原肽的區(qū)域。任何上述肽或其部分均代表狂犬病病毒中和表位的良好候選者，并且可以形成疫苗的基礎(chǔ)或者形成產(chǎn)生中和抗體以治療和/或預(yù)防狂犬病病毒感染的基礎(chǔ)?；谒鼈?cè)赑EPSCAN 中的高反應(yīng)性，SLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTff (SEQ ID NO :332) 和GFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSV(SEQ ID NO :333)是特別感興趣的糖蛋白區(qū)域。從上述PEPSCAN數(shù)據(jù)可進(jìn)一步推出稱為CR57和CR04-010的人單克隆抗體與狂犬病病毒G蛋白的不同區(qū)域結(jié)合，表明它們識(shí)別非競(jìng)爭(zhēng)性表位。實(shí)施例12用體外中和分析(修改的RFFIT)確定抗狂犬病G蛋白IgG的中和效力在如實(shí)施例1所述的修改的RFFIT中確定每種所產(chǎn)生的人單克隆抗體的中和效力。16種IgG中和狂犬病毒株CVS-Il的效力高于1000IU/mg，而僅有兩種IgG的效力低于 2IU/mg (見表15)。16種抗體中有8種比瞬時(shí)產(chǎn)生的CR-57的效力強(qiáng)，提示在狂犬病病毒的暴露后預(yù)防中比CR-57有更高的效率。瞬時(shí)產(chǎn)生的CR-57的效力約為3800IU/mg蛋白質(zhì) (見表1和表15)，而穩(wěn)定產(chǎn)生的CR-57展示出效力為M00IU/mg蛋白質(zhì)(數(shù)據(jù)未示出)。 令人感興趣地，所鑒別的大多數(shù)中和人單克隆抗體含有可變重鏈3-30種系基因(見表9)?；诳贵w對(duì)狂犬病病毒的親和性(數(shù)據(jù)未示出)和在修改的RFFIT分析中的抗體的100%終點(diǎn)稀釋度(數(shù)據(jù)未示出)，選擇一組6個(gè)獨(dú)特的IgG，即CR04-010、CR04-040、 CR04-098、CR04-103、CR04-104 和 CR04-144 進(jìn)行進(jìn)一步開發(fā)。在這一組中，抗體 CR04-098 是特別令人感興趣的，因?yàn)槠滹@示出最高的效力，即約7300IU/mg蛋白質(zhì)(見表15)。對(duì)于穩(wěn)定產(chǎn)生的CR04-098也發(fā)現(xiàn)類似的效力(數(shù)據(jù)未示出)。實(shí)施例13用抗狂犬病病毒IgG體外中和E57逃逸病毒為進(jìn)一步鑒定新的人單克隆抗狂犬病抗體，在如上所述的修改的RFFIT中測(cè)試這些IgG對(duì)E57逃逸病毒的中和活性。大多數(shù)抗狂犬病病毒IgG有對(duì)全部6種E57逃逸病毒的良好中和活性(見表16)。相反，CR04-008、CR04-018和CR04-126分別不中和6/6,2/6 和3/6 E57逃逸病毒。不中和意味著在1 100抗體稀釋度未達(dá)到50%終點(diǎn)(endpoint)。 CR04-021、CR04-108、CR04-120、CR04-125和CR04-164顯示出對(duì)一些逃逸病毒的中和活性顯著下降。這提示這些抗體的表位在E57逃逸病毒糖蛋白中已受到直接或間接影響。基于以上，一些抗狂犬病病毒IgG可能與用于暴露后預(yù)防治療的抗狂犬病混合物中的CR-57 相容。特別地，如上鑒別的一組6個(gè)獨(dú)特的IgG，即抗體CR04-010、CR04-040、CR04-098、 CR04-103、CR04-104和CR04-144，展示了針對(duì)E57逃逸病毒的良好中和效力，提示這些抗體識(shí)別的表位未被CR-57誘導(dǎo)的氨基酸突變影響?？贵wCR04-098似乎是最有前途的，因?yàn)樗鼘?duì)每種逃逸病毒均具有高于3000IU/mg的效力。實(shí)施例14抗狂犬病抗體CR-57和CR04-098的表位識(shí)別為了證實(shí)稱為CR-57和CR04-098的人單克隆抗體識(shí)別非重疊的非競(jìng)爭(zhēng)表位，基本上根據(jù)針對(duì)CR57的逃逸病毒所描述的那樣(見實(shí)施例1)產(chǎn)生稱為CR04-098的人單克隆抗體的逃逸病毒。簡(jiǎn)單地說(shuō)，通過免疫熒光記錄每孔轉(zhuǎn)化灶數(shù)，選擇優(yōu)選地含有1個(gè)轉(zhuǎn)化灶的孔的培養(yǎng)基進(jìn)行病毒擴(kuò)增。從1個(gè)單轉(zhuǎn)化灶產(chǎn)生除E98-2Q個(gè)轉(zhuǎn)化灶)和E98-M4個(gè)轉(zhuǎn)化灶)之外的所有的E98逃逸病毒。如果中和指數(shù)<2. 51og，則病毒被限定為逃逸變體。 中和指數(shù)如下確定從用病毒單獨(dú)感染的BSR或MNA細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的感染性病毒顆粒數(shù)/ml中減去用病毒加上單克隆抗體(約4IU/ml)感染的BSR細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的感染性顆粒數(shù)/ml ([(log在單克隆抗體不存在時(shí)的轉(zhuǎn)化灶形成單位/ml病毒)減去(log在單克隆抗體存在時(shí)的ffu/ml病毒)])。指數(shù)低于2. 51og被認(rèn)為是逃逸的證據(jù)。為進(jìn)一步研究與CR-57相比，CR04-098與不同的非重疊非競(jìng)爭(zhēng)性表位結(jié)合，在如上所述的修改的RFFIT分析中針對(duì)E98逃逸病毒測(cè)試CR-57。如表17所示，CR-57針對(duì)全部 5種E98逃逸病毒均具有良好的中和活性。另外，測(cè)試了抗體CR04-010和CR04-144對(duì)E98 逃逸病毒的中和活性。兩種抗體均不中和E98逃逸病毒(數(shù)據(jù)未示出)，提示由兩種抗體識(shí)別的表位受抗體CR04-098所誘導(dǎo)的氨基酸突變的直接或間接影響。測(cè)試了抗體CR04-018 和CR04-U6對(duì)E98逃逸病毒中的一種即E98-4的中和活性。CR04-018能夠中和該逃逸病毒，而CR04-U6對(duì)該逃逸病毒僅有弱的中和效力。這提示由CR04-018識(shí)別的表位不受抗體 CR04-098 所誘導(dǎo)的突變的影響。另外，抗體 CR04-010、CR04-038、CR04-040、CR04-073、 CR04-103、CR04-104、CR04-108、CR04-120、CR04-125、CR04-164 不中和 E98-4，提示它們與 CR04-098識(shí)別相同的表位(數(shù)據(jù)未示出)。為了鑒別每種E98逃逸病毒的狂犬病糖蛋白中可能的突變，根據(jù)以前針對(duì)E57和 EJB逃逸病毒所述的那樣確定該糖蛋白開放讀框(ORF)的核苷酸序列。所有的E98逃逸病毒均顯示在狂犬病糖蛋白的第336位氨基酸有N變?yōu)镈的突變(見圖8)。這一糖蛋白區(qū)域已被定義為抗原位點(diǎn)III，其包含第330-338位氨基酸(不計(jì)信號(hào)肽的編號(hào))。相反，CR-57識(shí)別位于第2沈_231位氨基酸(不計(jì)信號(hào)肽的編號(hào))的表位，其與抗原位點(diǎn)I重疊。除了 N336D突變外，稱為E98-5的E98逃逸病毒顯示在狂犬病糖蛋白第3M位氨基酸的H變?yōu)镼 的突變(CAT變?yōu)镃AG的密碼子改變)(數(shù)據(jù)未示出)。另外，對(duì)CR57與攜帶突變的CR57表位的肽結(jié)合(如在E57逃逸病毒中觀察到的) 的pepscan分析確實(shí)示出CR57的相互作用被破壞(數(shù)據(jù)未示出)。令人注目的是，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得CR04-098仍能夠與PER. C6⑩細(xì)胞上表達(dá)的突變糖蛋白(包含N336D突變)結(jié)合 (數(shù)據(jù)未示出)，盡管含有這一突變的病毒不再被中和。另外，用BIAcOre3000TM分析系統(tǒng)經(jīng)表面等離子共振分析進(jìn)行了表位作圖研究和親和性排序研究。用胺偶聯(lián)技術(shù)將純化的狂犬病糖蛋白(ERA毒株)作為配體固定化在研究級(jí) CM5 4 流路(flow channel, Fe)傳感器芯片(Biacore AB, Sweden)上。排序是在 25°C 用HBS-EP (Biacore AB, Sweden)作為流動(dòng)緩沖液而進(jìn)行。將50 μ 1每種抗體以20 μ 1/min 的恒定流速注入。然后，加入流動(dòng)緩沖液750秒，隨后用5μ 1 2Μ Na0H,5y 1 45mM HCl和 5μ1 2mM NaOH再生CM5芯片。將以共振單位(RU)表示的共振信號(hào)作為時(shí)間的函數(shù)作圖， 確定分別作為締合和解離測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)的RU的增加和減少，并用作抗體的排序。通過表面等離子共振測(cè)得的CR57和CR04-098的實(shí)際KD值分別是2. 4nM和4. 5nM。表位作圖研究進(jìn)一步證實(shí)CR57和CR04-098與狂犬病糖蛋白上的不同表位結(jié)合。注入CR57產(chǎn)生了 58RU的應(yīng)答(數(shù)據(jù)未示出)。在注入CR04-098后，獲得了應(yīng)答水平的額外增加(MRU)，提示針對(duì) CR04-098的結(jié)合位點(diǎn)未被占據(jù)(數(shù)據(jù)未示出)。當(dāng)采用相反順序時(shí)，觀察到類似結(jié)果，表明無(wú)論注入順序如何，每一抗體均達(dá)到類似RU水平(數(shù)據(jù)未示出)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí) CR57和CR04-098可同時(shí)結(jié)合和識(shí)別狂犬病病毒糖蛋白上的不同表位。總之，上述數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)抗體CR-57和CR04-098識(shí)別不同的非重疊表位，即分別為抗原位點(diǎn)I和III中的表位。這些數(shù)據(jù)與ELISA/FACS競(jìng)爭(zhēng)數(shù)據(jù)非常符合，該競(jìng)爭(zhēng)數(shù)據(jù)表明CR-57和CR04-098不競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ERA G以及抗體CR04-098對(duì)所有E57逃逸病毒的良好中和活性。基于這些結(jié)果以及將狂犬病病毒體外暴露于CR57和CR04-098的組合(在4IU/ ml每種抗體存在下的選擇)不產(chǎn)生逃逸病毒(數(shù)據(jù)未示出)這一事實(shí)，得出如下結(jié)論抗體CR-57和CR04-098識(shí)別非重疊的非競(jìng)爭(zhēng)性表位，并且可以被有利地用于抗狂犬病病毒抗體混合物中以進(jìn)行暴露后預(yù)防治療。實(shí)施例15評(píng)估由CR57和CR04-098識(shí)別的表位的保守性將CR-57的最小結(jié)合區(qū)(SEQ ID NO :332內(nèi)的氨基酸KLCGVL,由PEPSCAN和丙氨酸掃描技術(shù)確定的由CR57識(shí)別的狂犬病病毒糖蛋白區(qū)域)與2 個(gè)基因型1狂犬病病毒分離株的核苷酸序列進(jìn)行序列比對(duì)以評(píng)估該表位的保守性(見表18)。樣品組含有人分離株、蝙蝠分離株和來(lái)自犬類的或來(lái)自最易受患有狂犬病的犬類攻擊的家畜的分離株。在該最小結(jié)合區(qū)內(nèi)每一位置的氨基酸的頻率分析揭示了組成該表位的關(guān)鍵殘基是高度保守的。 在第1位的賴氨酸在99. 6%的分離株中是保守的，而僅在1/2 分離株中觀察到保守的K >R突變。第2位和第3位(L和C)是完全保守的。據(jù)信中心的半胱氨酸殘基在結(jié)構(gòu)上參與糖蛋白折疊并且在所有狂犬病屬病毒中是保守的(參見Badrane and TordO，2001)。第 4位的甘氨酸在98. 7%的分離株中是保守的，而在3/2 分離株中觀察到朝向帶電荷氨基酸的突變(在1/229中有G > R ；在2/229中有G > E)。第5位也是保守的，只在一個(gè)分離
40株中有例外，在該分離株中觀察到保守的V > I突變。在由丙氨酸置換掃描確定為非關(guān)鍵殘基的第6位，在街毒分離株中觀察到顯著的異質(zhì)性在70. 7%毒株中為。在沈.7%毒株中為P，在2. 6%毒株中為S。加在一起，預(yù)計(jì)約99%的可以遇到的狂犬病病毒被CR-57抗體識(shí)別。對(duì)這2 個(gè)病毒分離株中的123個(gè)分析了 CR-57和CR04-098表位中突變的存在。 這123個(gè)街毒分離株中無(wú)一在兩個(gè)表位中含有突變。在E98逃逸病毒中觀察到的N > D突變僅在5個(gè)病毒分離株中存在。這些病毒地域上是獨(dú)立的并分離自非洲的動(dòng)物(參見圖9的系統(tǒng)發(fā)生樹；這 5 個(gè)病毒分離株即 AF325483、AF325482、AF325481、AF325480 和 AF325485， 以粗體示出)。糖蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)生分析揭示具有突變的CR57表位的狂犬病病毒僅與攜帶突變的CR04-098表位的狂犬病病毒遠(yuǎn)緣相關(guān)。因此，遇到對(duì)CR-57和CR04-098的混合物所致的中和作用有抗性的狂犬病病毒的可能性基本上是不存在的。表1 :CR_57和CR-JB對(duì)野生型和逃逸病毒的中和效力
病毒效力效力病毒效力效力CR-57CR-JBCR-57CR-JB(IU/mg)(IU/mg)(IU/mg)(IU/mg)CVS-Il3797605CVS-Il3797605Ε57Α20<0.2EJB2B0.0040.6Ε57Α30419EJB2C<0.0042Ε57Β1093EJB2D<0.0043Ε57Β20<0.3EJB2E<0.2<0.3Ε57Β30419EJB2F<0.063E57C3031EJB3F<0.040.06表2 人λ鏈可變區(qū)引物(有義)
權(quán)利要求
1.一種鑒別特異性結(jié)合狂犬病病毒的結(jié)合分子或者編碼特異性結(jié)合狂犬病病毒的結(jié)合分子的核酸分子的方法，其中所述方法包括如下步驟a)將可復(fù)制的遺傳包裝的表面上的結(jié)合分子集合與狂犬病病毒或其片段在有益于結(jié)合的條件下接觸，b)選擇與狂犬病病毒或其片段結(jié)合的結(jié)合分子至少一次，和c)分離并回收與狂犬病病毒或其片段結(jié)合的結(jié)合分子。
2.一種鑒別潛在性具有狂犬病病毒中和活性的結(jié)合分子或者編碼潛在性具有狂犬病病毒中和活性的結(jié)合分子的核酸分子的方法，其中所述方法包括如下步驟a)將可復(fù)制的遺傳包裝的表面上的結(jié)合分子集合與狂犬病病毒或其片段在有益于結(jié)合的條件下接觸，b)從未結(jié)合的結(jié)合分子分離和回收與狂犬病病毒或其片段結(jié)合的結(jié)合分子，c)分離至少一種回收的結(jié)合分子，d)核實(shí)該分離的結(jié)合分子是否具有狂犬病病毒中和活性。
3.權(quán)利要求2的方法，其進(jìn)一步包括分離并回收含有可變重鏈3-30種系基因的結(jié)合分子的步驟。
4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的方法，其中所述可復(fù)制的遺傳包裝的表面上的結(jié)合分子集合是從分離自細(xì)胞的RNA中制備的，所述細(xì)胞得自已經(jīng)接種了狂犬病疫苗的對(duì)象或者已經(jīng)暴露于狂犬病病毒的對(duì)象。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法，其中所述可復(fù)制的遺傳包裝的表面上的結(jié)合分子集合是單鏈Fv文庫(kù)。
6.權(quán)利要求4和5任一項(xiàng)的方法，其中所述對(duì)象是已經(jīng)接種了狂犬病疫苗的人。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述可復(fù)制的遺傳包裝選自噬菌體顆粒、 細(xì)菌、酵母、真菌、微生物孢子及核糖體。
8.可復(fù)制的遺傳包裝表面上的人結(jié)合分子集合，其特征在于所述集合是從分離自細(xì)胞的RNA中制備的，所述細(xì)胞得自已經(jīng)接種了狂犬病疫苗或者已經(jīng)暴露于狂犬病病毒的對(duì)象。
9.權(quán)利要求8的集合，其特征在于所述集合是單鏈Fv文庫(kù)。
10.權(quán)利要求8或9的集合，其特征在于所述對(duì)象是已經(jīng)接種狂犬病疫苗的人。
11.一種鑒別潛在性具有針對(duì)在生物中引起疾病的感染因子的中和活性的結(jié)合分子或者編碼潛在性具有針對(duì)在生物中引起疾病的感染因子的中和活性的結(jié)合分子的核酸分子的方法，其中所述方法包括如下步驟a)將可復(fù)制的遺傳包裝的表面上的結(jié)合分子集合至少與細(xì)胞在有益于結(jié)合的條件下接觸，其中所述細(xì)胞在其表面上表達(dá)在生物中引起疾病的感染因子的蛋白，b)從未結(jié)合在其表面上表達(dá)在生物中引起疾病的感染因子的蛋白的所述細(xì)胞的結(jié)合分子中分離和回收與所述細(xì)胞結(jié)合的結(jié)合分子，c)分離至少一種回收的結(jié)合分子，d)核實(shí)該分離的結(jié)合分子是否具有針對(duì)在生物中引起疾病的感染因子的中和活性。
12.權(quán)利要求11的方法，其特征在于所述結(jié)合分子是人分子。
13.權(quán)利要求11或12的方法，其特征在于所述感染因子是病毒、細(xì)菌、酵母、真菌、或者寄生蟲。
14.權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的方法，其特征在于所述蛋白是通常在所述感染因子表面上表達(dá)的蛋白。
15.權(quán)利要求11-14任一項(xiàng)方法，其特征在于將所述可復(fù)制的遺傳包裝的表面上的結(jié)合分子集合用不在其表面上表達(dá)在生物中引起疾病的感染因子的蛋白的細(xì)胞進(jìn)行扣除。
全文摘要
本發(fā)明提供了特異性結(jié)合狂犬病病毒并且能中和該病毒的結(jié)合分子。本發(fā)明進(jìn)一步提供了編碼該結(jié)合分子的核酸分子、包含該結(jié)合分子的組合物及鑒別或者產(chǎn)生該結(jié)合分子的方法。所述結(jié)合分子可用于得自狂犬病病毒的疾病的診斷、預(yù)防和/或治療。優(yōu)選地，其可用于狂犬病的暴露后預(yù)防。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102241769SQ20111007093
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2005年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月27日
發(fā)明者亞歷山大·貝特霍爾德·亨德里克·巴克, 威廉·埃格伯特·馬里森, 科內(nèi)利斯·阿德里安·德克呂夫, 羅伯特·阿耶恩·克拉默 申請(qǐng)人:克魯塞爾荷蘭公司