專利名稱：展示狂犬病病毒保護(hù)性抗原的犬Ⅱ型腺病毒活載體重組疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用犬II型腺病毒不同結(jié)構(gòu)蛋白的特性，分別展示狂 犬病病毒保護(hù)性抗原或抗原表位的重組疫苗，可用于新型動物狂犬病 疫苗的研制和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
狂犬病是由狂犬病病毒引起的以非化膿性腦脊髓炎為主要特征 的一種重要人畜共患傳染病，感染人和動物后， 一旦發(fā)病，死亡率幾
乎是100%。我國是狂犬病的多發(fā)地，每年有上千人死于狂犬病，主
要是由帶病毒的犬咬傷引起。盡管目前人用商品疫苗安全有效，但大 量帶毒動物的存在仍然對人類生命安全構(gòu)成了直接威脅。特別是近年 來，死于狂犬病的人數(shù)呈逐年上升的趨勢。因此，減少或控制狂犬病 病毒在家養(yǎng)動物中的貯集是有效控制人狂犬病發(fā)生的重要途徑。
目前用于動物狂犬病預(yù)防的疫苗主要是滅活疫苗和弱毒疫苗，二 者對預(yù)防狂犬病的發(fā)生起到了積極重要的作用。但是滅活疫苗免疫周 期短，接種方式單一，不適于動物的田間免疫，而且在我國還沒有實(shí) 現(xiàn)國產(chǎn)化，進(jìn)口滅活疫苗制備工藝復(fù)雜，成本昂貴，比較適用于發(fā)達(dá) 國家。弱毒疫苗在敏感動物體內(nèi)有毒力返袓的危險，不能從根本上消 除狂犬病，因此，難以在我國得到推廣。
隨著對狂犬病病毒分子生物學(xué)特性的不斷研究，已證明糖蛋白是 唯一可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白。國際上許多 實(shí)驗(yàn)室都開展了以糖蛋白為保護(hù)性抗原的亞單位疫苗、基因工程亞單
位疫苗、DNA疫苗等新型狂犬病疫苗的研究。雖然這些疫苗可以誘 導(dǎo)特異性中和抗體的產(chǎn)生，并具有一定的免疫保護(hù)力，但由于免疫原 性較弱，未得到實(shí)際應(yīng)用。以痘病毒和人5型腺病毒為載體表達(dá)狂犬 病病毒糖蛋白的活載體重組疫苗研究取得了一定進(jìn)展，在歐洲和北美 洲的免疫試驗(yàn)證明，具有良好的免疫原性。但由于存在再次免疫排斥 或安全性問題，而未得到正式批準(zhǔn)使用。為提高重組腺病毒疫苗的實(shí)際應(yīng)用價值，目前，以人5型腺病毒為載體的展示疫苗己有研究，而 以犬II型腺病毒為載體的展示疫苗技術(shù)在國內(nèi)外尚未見報道。
以犬II型腺病毒為載體的重組疫苗對犬科動物易感，也可在貓、 牛和豬等家畜動物體內(nèi)有效復(fù)制，而且遺傳特性穩(wěn)定，安全性好，在 新型狂犬病疫苗的研究中具有較大的開發(fā)潛力。本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的表達(dá) 狂犬病病毒糖蛋白的犬II型腺病毒活載體重組疫苗，已獲得國家發(fā) 明專利，并完成了在生產(chǎn)性試驗(yàn)階段的生物安全評價，證明具有良好 的免疫效果和安全性。在此基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步提高犬II型腺病毒重 組疫苗的免疫效力和實(shí)際應(yīng)用價值，本發(fā)明提供了一系列以犬II型 腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白展示表達(dá)狂犬病病毒保護(hù)性抗原或抗原表位的重組 疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供展示狂犬病病毒保護(hù)性抗原或抗 原表位的犬II型腺病毒活載體重組疫苗。
本發(fā)明的技術(shù)方案是以犬II型腺病毒為載體，在其結(jié)構(gòu)蛋白基因 的疏水性位點(diǎn)插入狂犬病病毒保護(hù)性抗原基因或表達(dá)抗原表位的核 苷酸序列，使外源抗原或表位在腺病毒表面與其結(jié)構(gòu)蛋白融合表達(dá)。
進(jìn)一步講，以犬II型腺病毒疫苗株為載體，在其結(jié)構(gòu)蛋白六鄰粒、 纖突或IX蛋白上，利用這些結(jié)構(gòu)蛋白基因自身的轉(zhuǎn)錄原件，融合表
達(dá)狂犬病病毒保護(hù)性抗原或抗原表位，使其在犬II型腺病毒顆粒表 面得以展示，從而達(dá)到增強(qiáng)重組疫苗免疫效力的目的。免疫試驗(yàn)證明， 該系列重組疫苗均可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的針對狂犬病病毒和犬腺病毒 的中和抗體，并能抵抗狂犬病病毒標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株和犬腺病毒強(qiáng)毒株的攻擊。
首先，在不發(fā)生堿基缺失和不影響結(jié)構(gòu)蛋白轉(zhuǎn)錄的前提下，對犬
II型腺病毒全基因組中六鄰粒、纖突或IX蛋白基因進(jìn)行改造
1、 過重疊PCR分別在犬II型腺病毒全基因組六鄰?；虺儏^(qū) 的4個位點(diǎn)，按六鄰粒的轉(zhuǎn)錄閱讀框分別插入狂犬病病毒糖蛋白中和 抗原表位，使其與六鄰粒在腺病毒顆粒外表面融合表達(dá)；
2、 在犬II型腺病毒全基因組28106 bp處引入一段人工合成的核 酸序列(含XmaI酶切位點(diǎn))，在XmaI酶切位點(diǎn)處，按纖突的轉(zhuǎn)錄 閱讀框插入狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位，使其與纖突在腺病毒顆 粒外表面融合表達(dá)；3 、利用犬II型腺病毒IX蛋白基因內(nèi)的限制性內(nèi)切酶Ase I位點(diǎn)，
在IX蛋白轉(zhuǎn)錄終止密碼子處插入狂犬病病毒糖蛋白膜外區(qū)基因和 SV40病毒多聚A轉(zhuǎn)錄終止信號，使IX蛋白與外源抗原表位利用同 一轉(zhuǎn)錄閱讀框在腺病毒顆粒外表面融合表達(dá)。
其次，狂犬病病毒保護(hù)性抗原或抗原表位能隨重組犬II型腺病 毒結(jié)構(gòu)蛋白一起轉(zhuǎn)錄，在病毒顆粒表面產(chǎn)生多個拷貝，其免疫效力好 于單一拷貝的重組疫苗；第三，重組疫苗的增殖、擴(kuò)大培養(yǎng)以及免疫 接種的方式均與載體病毒疫苗株犬II型腺病毒一致；第四，動物接 種重組疫苗后，將同時獲得針對犬腺病毒感染和狂犬病病毒感染的免 疫力，并能抵抗正常致死劑量強(qiáng)毒株的攻擊。
展示狂犬病病毒保護(hù)性抗原的重組犬II型腺病毒的構(gòu)建過程
1、 利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的含犬II型腺病毒全基因組質(zhì)粒
pPOLYII-CAV2中兩個單一酶切位點(diǎn)得到含六鄰?；虻拇笃?，將 其克隆入pET-28a載體，獲得重組質(zhì)粒pET-LH。再利用pET-LH中 大片段的兩個單一酶切位點(diǎn)得到含六鄰粒基因的小片段，將其克隆入 pET-28a載體，獲得重組質(zhì)粒pET-SH。通過重疊PCR將狂犬病病毒 中和抗原表位分別插入六鄰體超變區(qū)內(nèi)的4個不同位點(diǎn)(分別在犬II 型腺病毒全基因組的17378 bp、 17450 bp、 17623 bp和18084 bp處)， 并將PCR產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體，進(jìn)行序列測定。測序正確后，
利用六鄰粒中兩個單一酶切位點(diǎn)將改造后的六鄰粒基因克隆入 pET-SH。最后，按照上述路線返向克隆，獲得重組犬II型腺病毒全 基因組。
2、 利用pBluescriptn KS(屮/一)中的酶切位點(diǎn)Sac I和Kpn I，插入 人工合成序列Linker SK (依次含Sal I、 Xma I、 Spe I和Pac I多個酶 切位點(diǎn))，獲得重組質(zhì)粒pBS-SKI。按纖突基因序列，人工合成犬II 型腺病毒全基因組序列28050 bp 28106 bp區(qū)段，并插入Linker SK 中Sal I Xma I之間，利用PCR獲得犬II型腺病毒全基因組中30182 bp 29358 bp序列，將兩片段插入Linker SK中Spe I Pac I之間， 獲得重組質(zhì)粒pBS-SKII。再將狂犬病病毒中和抗原表位按纖突基因 的轉(zhuǎn)錄閱讀框插入pBS-SKII的Linker SK中Xma I和Spe I位點(diǎn)之間， 獲得改造后的纖突基因。最后，通過Linker SK中兩端的酶切位點(diǎn)Sal I和PacI，將改造的纖突基因插入pPOLYII-CAV2中，得到重組犬II 型腺病毒全基因組。
3、 利用pPOLYII-CAV2中兩個單一酶切位點(diǎn)得到含IX蛋白基因的大片段，將其克隆入pBluescriptII KS(:+Z—)載體，獲得重組質(zhì)粒 pBS-LIX。再利用pBS-LIX中大片段的兩個單一酶切位點(diǎn)得到含IX 蛋白基因的小片段，將其克隆入pEGFP-Cl載體，獲得重組質(zhì)粒 pEGFP-SIX。然后，在IX蛋白終止密碼子處，利用其自身的酶切位 點(diǎn)插入狂犬病病毒糖蛋白膜外區(qū)基因與SV40多聚A轉(zhuǎn)錄終止序列， 實(shí)現(xiàn)IX蛋白與糖蛋白膜外區(qū)融合表達(dá)。最后，按照上述路線，返向 克隆獲得重組犬II型腺病毒全基因組。
4、堿裂解法大量制備各種重組犬II型腺病毒基因組質(zhì)粒，分別 經(jīng)Asc I和Pme I雙酶切游離全基因組后，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染5pg基因 組DNA于犬腎傳代細(xì)胞系MDCK，隔天傳代1次，直至出現(xiàn)典型的 犬腺病毒病變(葡萄串狀)。
展示狂犬病病毒保護(hù)性抗原的犬II型腺病毒活載體重組疫苗免疫 原性
1、 利用MDCK細(xì)胞大量制備重組疫苗，并測定疫苗的TCID^(均 不低于1065TCID5Q/0.1ml)。取無狂犬病免疫史的家犬為試驗(yàn)動物， 分別兩側(cè)股內(nèi)側(cè)肌肉注射和口服接種。
2、 免疫時每條犬肌肉注射lml或口服2ml —種重組疫苗，免疫一 次，免疫前及免疫后每周采血并分離血清。
3、 采用熒光抗體狂犬病病毒中和試驗(yàn)(FAVN)法，檢測免疫犬 血清中和抗體效價，結(jié)果顯示，重組疫苗誘導(dǎo)的平均中和抗體水平在 免疫后第3周時，均能達(dá)到國際最低保護(hù)水平(0.5IU/ml)以上，第 4 5周達(dá)到最高(4.62 6.43IU/ml)。通過血凝抑制試驗(yàn)，檢測試驗(yàn) 犬體內(nèi)腺病毒抗體效價，結(jié)果顯示，重組疫苗誘導(dǎo)的腺病毒抗體水平 在免疫后第4周時最高，均為1:2，
展示狂犬病病毒保護(hù)性抗原的犬II型腺病毒活載體重組疫苗的免 疫保護(hù)作用
免疫6周后，對各試驗(yàn)組動物進(jìn)行攻毒，每組分別用100LDs。的 狂犬病病毒標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒CVS-24和犬腺病毒強(qiáng)毒進(jìn)行攻毒。攻毒后對試 驗(yàn)動物進(jìn)行封閉隔離飼養(yǎng)，相互之間不接觸，每天觀察并記錄試驗(yàn)動 物的采食和發(fā)病情況，觀察40天。結(jié)果顯示，口服和肌肉注射任何 一種重組疫苗的犬均可抵抗強(qiáng)毒的攻擊，存活率在90%以上。
具體實(shí)施方案
下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述
實(shí)施例1:以六鄰粒展示狂犬病病毒保護(hù)性抗原的重組疫苗全基因組的克隆
Eco52 I和SnaB I雙酶切pPOLYII-CAV2，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收 12516 bp片段，克隆入pET-28a載體，獲得重組質(zhì)粒pET-LH。再用 Nde I和Mlu I雙酶切pET-LH，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收4325 bp片段， 克隆至pET-28a載體，獲得重組質(zhì)粒pET-SH。通過重疊PCR將狂犬 病病毒中和抗原表位分別插入六鄰體內(nèi)4個不同位點(diǎn)，并將PCR產(chǎn) 物克隆至pMD18-T載體，進(jìn)行序列測定。測序正確后，利用六鄰粒 Kpn I和Dra I兩個自然酶切位點(diǎn)將改造后的六鄰?；蚩寺∪?pET-SH。最后，按照上述路線，返向克隆獲得4種重組犬II型腺病 毒全基 因 組質(zhì)粒 pPolylI-CAV2/HVRl-GAP 、 pPolylI-CAV2/HVR2-GAP 、 pPoly:[I-CAV2/HVR3-GAP 和 pPolyII畫C AV2/HVR4-GAP 。
重疊PCR引物序列
HV(forward):
5 ，-ATATCAGGGGTACCCTAGACAGAG-35; HV(reverse):
5 ,-GGTGTGTATTTAAAGGCATCAGGC-3 ，； HVRl-GAP(fo歷rd):
5'-CTCGGATCCTGGAGCCCTATTGACATACTAGGTTCAGCT GTCAC AAACAATACCTACCA-3'; HVRl畫GAP(reverse):
5,-TGAACCTAGTATGTCAATAGGGCTCCAGGATCCGAGCAC AGTTATGGCACCTGCAGAGG-3,; HVR2畫GAP (forward):
5,-CTCGGATCCTGGAGCCCTATTGACATACTAGGTTCAGAG CTGGGGGATGCGTCTGGCCG扁3 ，； HVR2-GAP(reverse):
5,畫TGAACCTAGTATGTCAATAGGGCTCCAGGATCCGAGATC GACCCAGCTTTCAGGGCCCA隱3，； HVR3-GAP (forward):
5 ， -CTCGGATCCTGGAGCCCTATTGAC ATACTAGGTTC AGCC ATGCTATAC ACTGAAGATGT-3,; HVR3-GAP (reverse):
5 ， -TGAACCTAGTATGTC AATAGGGCTCC AGGATCCGAGGGTGGTCACCTTATAAAATCTGG-3'; HVR4-GAP (forward):
5'-CTCGGATCCTGGAGCCCTATTGACATACTAGGTTCATTTC AGGC AGAAAATACCAATGT-3 ，； HVR4-GAP (reverse):
5，-TGAACCTAGTATGTCAATAGGGCTCCAGGATCCGAGAAC CTTCATGGTGGTCATGTTTG-3'。
其中，在犬II型腺病毒全基因組17378 bp處插入外源基因時，用 引物HV和HVR1-GAP，最終得到重組犬II型腺病毒全基因組質(zhì)粒 pPolylI-CAV2/HVRl-GAP;在17450 bp處插入時，用引物HV和 HVR2-GAP，最終得到重組犬II型腺病毒全基因組質(zhì)粒 pPolylI-CAV2/HVR2-GAP;在17623 bp處插入時，用引物HV和 HVR3-GAP，最終得到重組犬II型腺病毒全基因組質(zhì)粒 pPolylI-CAV2/HVR3-GAP;在18084 bp處插入時，用引物HV和 HVR4-GAP，最終得到重組犬II型腺病毒全基因組質(zhì)粒 pPolylI-CAV2解R4-GAP 。
狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位DNA序列
5 ,-TGAACCTAGTATGTCAATAGGGCTCCAGGATCCGAG畫3'。
PCR反應(yīng)條件
以在犬II型腺病毒全基因組17378 bp處插入外源基因?yàn)槔?，質(zhì)粒 pET-SH為模板，HVR (reverse)和HVRl-GAP(forward)為引物，在 TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶作用下，95 □預(yù)變性5min， 94□變性45s， 59口退火45s， 72口延伸lmin，共30個循環(huán)，得到突變位點(diǎn)左側(cè)片段 (2L)。以pET-SH為模板，HVR1-GAP (reverse)和HV(forward)為 引物，在TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶作用下，95口預(yù)變性5min， 94口 變性45s， 56口退火45s， 72口延伸lmin，共30個循環(huán)，72口延伸10min 擴(kuò)增突變位點(diǎn)右側(cè)片段(2R)。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收 純化。然后，進(jìn)行第二步PCR，分別取25-50 ng 2L和2R片段充分 混勻作為模板，以HV(forward)和HV(reverse)為引物，在TaKaRaEx Taq DNA聚合酶作用下，95口預(yù)變性5min， 94口變性45s， 56C退火 45s， 72E]延伸lmin，共30個循環(huán)，擴(kuò)增得到HVR1-GAP突變片段。 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化，連接到pMD18-T Vector,進(jìn)行測序。在其他位置插入時以相同方法，利用各自引物進(jìn)行重疊PCR 擴(kuò)增。
實(shí)施例2:以纖突展示狂犬病病毒保護(hù)性抗原的重組疫苗全基因 組的克隆
利用pBluescriptII KS(十/一)中的酶切位點(diǎn)Sac I和Kpn I，插入人 工合成序列Linker SK (依次含Sal I、 Xma I、 Spe I和Pac I多個酶切 位點(diǎn))，獲得重組質(zhì)粒pBS-SKI。按纖突基因序列，人工合成犬II型 腺病毒全基因組序列28050 bp 28106 bp區(qū)段，并插入Linker SK中 Sal I Xma I之間，利用PCR獲得犬II型腺病毒全基因組中30182 bp 29358 bp序列，將兩片段插入Linker SK中Spe I Pac I之間， 獲得重組質(zhì)粒pBS-SKII。再將狂犬病病毒中和抗原表位按纖突基因 的轉(zhuǎn)錄閱讀框插入pBS-SKII的Linker SK中Xma I和Spe I位點(diǎn)之間， 獲得改造后的纖突基因。最后，通過Linker SK中兩端的酶切位點(diǎn)Sal I和PacI，將改造的纖突基因插入pPOLYII-CAV2中，得到重組犬II 型腺病毒全基因組質(zhì)粒pPOLYII-CAV2/Fiber-GAP。
Linker SK序列
Sense sequence:
5'隱CGTCGACAGTCCCGGGAGTGGCGCCAGTGGGCCCAGTAC TAGTGCCTTAATTAAGGTAC-3'; Antisense sequence:
5，-CTTAATTAAGGCACTAGTACTGGGCCCACTGGCGCCACTC CCGGGACTGTCGACGAGCT -3，。
人工合成犬II型腺病毒全基因組28050 bp 28106 bp區(qū)段序列 Sense sequence:
5，-TCGACGGTGCCCCCAGCAGAAGTATCGACTGCATGCTAAT TATTAACAAACCAAAAC畫3 ，； Antisense sequence:
5'-CCGGGTTTTGGTTTGTTAATAATTAGCATGCAGTCGATACT TCTGCTGGGGGCACCG-3，。
PCR引物序列Forward: 5 ，畫TGATCACCGCAACGGTGAATG-3' Reverse: 5，隱TGAGTATGATGATGCTCTTGCAC-3，
PCR反應(yīng)條件
在TaKaRaExTaqDNA聚合酶作用下，95口預(yù)變性5min， 94匚:變 性45s， 55口退火45s， 72口延伸lmin，共30個循環(huán)，72口延伸10min。 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化，連接到pMD18-T Vector,進(jìn)
行測序。
實(shí)施例3:以IX蛋白展示狂犬病病毒保護(hù)性抗原的重組疫苗全基 因組的克隆
EcoR I和Cla I雙酶切pPOLYII-CAV2，瓊脂糖凝膠電泳回收3610 bp片段，克隆入pBluescriptII KS(+/—)，獲得重組質(zhì)粒pBS-LIX。 Mlu I與EcoR I雙酶切pBS-LIX，瓊脂糖凝膠電泳回收340 bp片段， 克隆入pEGFP-Cl，獲得重組質(zhì)粒pEGFP-SIX。在IX蛋白終止密碼 子處，利用單一酶切位點(diǎn)Ase I插入狂犬病病毒糖蛋白膜外區(qū)基因(G，) 與SV40多聚A轉(zhuǎn)錄終止信號序列，實(shí)現(xiàn)IX蛋白與糖蛋白膜外區(qū)融 合表達(dá)。最后，按照上述路線，返向克隆獲得重組犬II型腺病毒全 基因組質(zhì)粒pPOLYII-CAV2/IX-G'。
實(shí)施例4:重組疫苗的包裝與鑒定
1、 重組疫苗的包裝
取改造的犬二型腺病毒質(zhì)粒pPolylI-CAV2/HVRl-GAP 、 pPolylI-CAV2/HVR2-GAP 、 pPolylI-CAV2/HVR3-GAP 、 pPolyll-CAV2/HVR4-GAP ， pPOLYII畫CAV2/Fiber隱GAP 和 pPOLYII-CAV2/IX-G'各5fig，分別以Asc I和Pme I雙酶切釋放重組 的全基因組，利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染至MDCK細(xì)胞系，直到 細(xì)胞出現(xiàn)病變。
酶切條件
限制性內(nèi)切酶Asc I和Pme I各10U， 10xBuffer 5(^1，質(zhì)粒5pg， 加水補(bǔ)至5(^1。 37D水浴反應(yīng)lh后，氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次， 2倍體積無水乙醇沉淀，滅菌四餾水溶解沉淀，—20口保存?zhèn)溆谩?br> 2、 重組疫苗的鑒定重組疫苗基因組鑒定
取50ml培養(yǎng)瓶內(nèi)已呈葡萄串狀病變的單層MDCK細(xì)胞，傾棄培 養(yǎng)基，以PBS洗滌2次，加入800^il新鮮配制的細(xì)胞裂解液(0.6Q/。 SDS， 1 OmM EDTA ， 100^ g^ml蛋白酶K) ， 37 □溫育1 h ，加入200^11 5M NaCl ， 輕輕混勻后，冰水浴lh。將全部混合物移入離心管，于4LJ， 12000rpm 離心40min，上清移入加一離心管，以等體積酚:氯仿抽提2次，加入 終濃度0.25M醋酸鈉和2倍體積無水乙醇，12000rpm離心10min， DNA沉淀以70。/。乙醇洗滌1次，無菌風(fēng)干后，溶于5(V1去離子水。 以基因組為模板，PCR擴(kuò)增外源基因，測序鑒定。
鑒定用PCR引物序列
□ CAV2/HVR1-GAP、 CAV2/HVR2-GAP、 CAV2/HVR3-GAP和 CAV2/HVR4-GAP鑒定用弓|物序列
Forward: 5 ， -GGTGTGTATTTAAAGGCATCAGGC-3'; Reverse: 5，匿ATATCAGGGGTACCCTAGACAGAG-3,。
口CAV2/Fiber-GAP鑒定用引物序列
Forward: 5 ， -AGCAGAAGTATCGACTGCAT-3';
Reverse: 5 ，-TGAGTATGATGATGCTCTTGCAC陽3'。
□ CAV2/IX-G'鑒定用引物序列
Forward: 5，-AGCTGAAGATCCAGGTGGCT-3';
Reverse: 5, -ACGCTGGACACGGTATTATC-3'。
PCR反應(yīng)條件
同上。 TCID5Q的測定
將lxlO"MDCK細(xì)胞傳入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔內(nèi)細(xì)胞約lxl06， 補(bǔ)加培養(yǎng)基至100^1。次日，接入待測病毒樣品。在1 11孔內(nèi)，進(jìn) 行10" 10—n稀釋，A H列為同濃度重復(fù)。7天后，以Karber法計 算待測重組疫苗的TCID5o。
免疫原性鑒定(Western blotting)
取含狂犬病病毒SRV9株的細(xì)胞裂解液50^1，加等量2xSDS-PAGE 上樣緩沖液，沸水浴10min，冷卻至室溫，短暫離心后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳。電泳完畢，將膠上蛋白樣品電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，分別與 犬抗重組疫苗的多抗及陽性和陰性對照多抗、HRP標(biāo)記兔抗犬二抗 反應(yīng)，最后以DAB/H202顯色，根據(jù)顯色帶出現(xiàn)與否及其位置判定重 組疫苗是否表達(dá)狂犬病病毒抗原。毒力鑒定
取4 5月齡犬腺病毒和狂犬病病毒抗體陰性犬60條，按接種重 組疫苗不同分為6組，每組10條，分別用含1(fTCID5。和107TCID5。
的重組疫苗細(xì)胞培養(yǎng)液各肌肉注射5條犬。注射后，觀察注射犬的飲 食、精神狀態(tài)等表現(xiàn)，測量體溫、計數(shù)白細(xì)胞數(shù)量和其它臨床表現(xiàn)等， 并在4周后解剖注射犬，觀察犬體病理變化，并進(jìn)行肝等主要臟器的 組織切片觀察。 穩(wěn)定性鑒定
lxl(^MDCK細(xì)胞傳入25cn^細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，細(xì)胞長成單層后，按 培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基體積的0.5%接入重組疫苗，接種后3 4天收毒，對 各種重組疫苗分別連續(xù)傳代40次，標(biāo)記并保存每次的培養(yǎng)液，同時 每隔5代，提取感染細(xì)胞中的腺病毒基因組，通過PCR和DNA測序 鑒定外源基因的大小、方向和位置。
結(jié)果
1.各重組疫苗基因組內(nèi)均正確插入了狂犬病病毒保護(hù)性抗原，轉(zhuǎn) 錄方向與病毒基因組轉(zhuǎn)錄方向一致；
2.0.1ml各重組疫苗的TCID5o無明顯差別，為1065 107;
3. 各重組疫苗均表達(dá)了狂犬病病毒糖蛋白中和表位，抗體可以與 狂犬病病毒糖蛋白特異性結(jié)合；
4. 毒力檢測結(jié)果顯示，注射犬未出現(xiàn)飲食和精神表現(xiàn)等異常，體 溫在正常范圍內(nèi)G7.5 38.5口)。體內(nèi)白細(xì)胞計數(shù)顯示，白細(xì)胞總數(shù)
(7.5 16.0xl09/L)分類計數(shù)均在正常范圍內(nèi)，注射犬未出現(xiàn)藍(lán)眼或 厭食等臨床表現(xiàn)。解剖未見主要組織器官出現(xiàn)異常變化，重組疫苗注 射犬肺、肝和腎等組織切片與健康犬的組織切片無明顯區(qū)別。
5. 穩(wěn)定性鑒定結(jié)果表明，各重組疫苗經(jīng)過40代傳代，其基因組 (包括外源基因的大小、方向和位置)均保持不變，外源基因序列均
未發(fā)生改變。
實(shí)施例5:以六鄰粒展示狂犬病病毒保護(hù)性抗原的犬II型腺病毒 活載體重組疫苗的免疫效果 實(shí)驗(yàn)動物
狂犬病病毒和腺病毒抗體陰性的4 5月齡犬80條，隨機(jī)分為8 組，每組10條。 動物免疫分別以TCID5。為1065的重組疫苗CAV2/HVR1-GAP 、 CAV2/HVR2-GAP、 CAV2/HVR3-GAP和CAV2/HVR4-GAP對8組
犬進(jìn)行免疫。每種重組疫苗各免疫20條犬，其中肌肉注射10條，lml/ 條；口服10條，2ml/條。 免疫檢測
免疫前及免疫后每周分別采集少量靜脈血，分離血清，以FAVN 檢測受試犬狂犬病病毒中和抗體水平。 攻毒試驗(yàn)
免疫6周后，每組隨機(jī)抽取5條犬，以100LD5?？袢?biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒 株CVS-24接種；其余犬以100 LDso犬I型和II型腺病毒強(qiáng)毒混合物 接種。隔離觀察各犬至接種后40天，詳細(xì)記錄各組犬的發(fā)病及死亡 情況。
結(jié)果
1. 所有受試犬的免疫前血清內(nèi)檢不出抗犬腺病毒及狂犬病病毒 的特異性抗體；
2. 所有犬免疫后2 3周，其血清中均可檢出抗腺病毒抗體，至6 周時，抗體仍維持在較高水平；
3. 所有受試犬免疫后3 4周時，其血清中均可檢出狂犬病中和 抗體，抗體消長規(guī)律與腺病毒抗體一致；
4. 受試犬能抵抗犬I型與II型腺病毒強(qiáng)毒的攻擊，存活率為95%;
5. 受試犬能抵抗狂犬病強(qiáng)毒的攻擊，存活率為90%; 結(jié)論
4株不同重組疫苗均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對犬腺病毒和狂犬病病毒 的特異性中和抗體，對犬腺病毒和狂犬病病毒感染具有保護(hù)作用。 實(shí)施例6:以纖突展示狂犬病病毒保護(hù)性抗原的犬II型腺病毒活
載體重組疫苗的免疫效果 實(shí)驗(yàn)動物
狂犬病病毒和腺病毒抗體陰性的4 5月齡犬20條，隨機(jī)分為2 組，每組10條。 動物免疫
分別以TCID5Q為10"的重組疫苗CAV2/Fiber-GAP對2組犬進(jìn)行 免疫。其中肌肉注射10條，lml/條；口月艮10條，2ml/條。 免疫檢測
免疫前及免疫后每周分別采集少量靜脈血，分離血清，以FAVN檢測受試犬狂犬病病毒中和抗體水平。 攻毒試驗(yàn)
免疫6周后，每組隨機(jī)抽取5條犬，以100LDso狂犬病標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒 株CVS-24接種；其余犬以100 LDso犬I型和II型腺病毒強(qiáng)毒混合物 接種。隔離觀察各犬至接種后40天，詳細(xì)記錄各組犬的發(fā)病及死亡 情況。
結(jié)果
1. 所有受試犬的免疫前血清內(nèi)檢不出抗犬腺病毒及狂犬病病毒 的特異性抗體；
2. 所有犬免疫后2 3周，其血清中均可檢出抗腺病毒抗體，至6 周時，抗體仍維持在較高水平；
3. 所有受試犬免疫后3 4周時，其i清中均可檢出狂犬病中和 抗體，抗體消長規(guī)律與腺病毒抗體一致；
4. 受試犬能抵抗犬I型與II型腺病毒強(qiáng)毒的攻擊，存活率為95%;
5. 受試犬能抵抗狂犬病強(qiáng)毒的攻擊，存活率為90%; 結(jié)論
重組疫苗CAV2/Fiber-GAP可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對犬腺病毒和狂犬 病病毒的特異性中和抗體，對犬腺病毒和狂犬病病毒感染有保護(hù)作 用。
實(shí)施例7:以IX蛋白展示狂犬病病毒保護(hù)性抗原的犬II型腺病毒 活載體重組疫苗的免疫效果 實(shí)驗(yàn)動物
狂犬病病毒和腺病毒抗體陰性的4 5月齡犬20條，隨機(jī)分為2 組，每組10條。 動物免疫
分別以TCID5。為1065的重組疫苗CAV2/IX-G'對2組犬進(jìn)行免疫。 其中肌肉注射10條，lml/條；口月艮10條，2ml/條。 免疫檢測
免疫前及免疫后每周分別采集少量靜脈血，分離血清，以FAVN 檢測受試犬狂犬病病毒中和抗體水平。 攻毒試驗(yàn)
免疫6周后，每組隨機(jī)抽取5條犬，以100LD5?？袢?biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒 株CVS-24接種；其余犬以100 LDs。犬I型和II型腺病毒強(qiáng)毒混合物接種。隔離觀察各犬至接種后40天，詳細(xì)記錄各組犬的發(fā)病及死亡 情況。 結(jié)果
1. 所有受試犬的免疫前血清內(nèi)檢不出抗犬腺病毒及狂犬病病毒 的特異性抗體；
2. 所有犬免疫后2 3周，其血清中均可檢出抗腺病毒抗體，至6 周時，抗體仍維持在較高水平；
3. 所有受試犬免疫后3 4周時，其血清中均可檢出狂犬病中和 抗體，抗體消長規(guī)律與腺病毒抗體一致；
4. 受試犬能抵抗犬I型與II型腺病毒強(qiáng)毒的攻擊，存活率為95%;
5. 受試犬能抵抗狂犬病強(qiáng)毒的攻擊，存活率為90%; 結(jié)論
重組疫苗CAV2/IX-G'可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對犬腺病毒和狂犬病病 毒的特異性中和抗體，對犬腺病毒和狂犬病病毒感染有保護(hù)作用。
附改造后犬II型腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因序列 1.改造后犬II型腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白六鄰?；蛐蛄?重組疫苗CAV2/HVR1-GAP中六鄰?；蛐蛄?lt;formula>formula see original document page 20</formula>CCTAA
加框<formula>formula see original document page 22</formula>CCACCTAA
,序列為狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位基因序列
重組疫苗CAV2/HVR3-GAP中六鄰?；蛐蛄?
ATGGCAGCCTAGCAGAGCTGGGGGATGCGTCTGGCCGTGCCCT
CCAAGTGCCAGAGGGTCAGGTTACAGGGGTGCAAGGGCTGGG<formula>formula see original document page 24</formula>加框序列為狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位基因序列
重組疫苗CAV2/HVR4-GAP中六鄰?；蛐蛄?br> ATGGCAGCCTAGCAGAGCTGGGGGATGCGTCTGGCCGTGCCCT
CTGGTGCACCAAGTGCCAGAGGGTCAGGTTACAGGGGTGCAA<formula>formula see original document page 26</formula>ACCACCTAA
加框序列為狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位基因序列
2.重組疫苗CAV2/Fiber-GAP中纖突基因序列
ACTTAGACTTATGGACGGAACATGGGGGCCCAGTAATGAGACCCTCTAAAAGCATTGTTTACATTAGGGTGATTATTAACAACGTCAG
CATACTCA
加框序列分別為Sal I、 Xma I和Pac I位點(diǎn)，下劃線部分是狂犬
病病毒中和抗原表位序列,
3.重組疫苗CAV2/IX-G'中IX蛋白序列GGGAAGGTTAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAA
GCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAACG
CGTAAT
加框
是犬II型腺病毒IX蛋白序列，下劃線部分是狂犬病病
毒糖蛋白膜外區(qū)序列，陰影部分是SV40poly(A)/
權(quán)利要求
1、一種展示狂犬病病毒保護(hù)性抗原的犬II型腺病毒活載體重組疫苗，其特征在于以犬II型腺病毒為載體，在其結(jié)構(gòu)蛋白基因的疏水性位點(diǎn)插入狂犬病病毒保護(hù)性抗原基因或表達(dá)抗原表位的核苷酸序列，使外源抗原或表位在腺病毒表面與其結(jié)構(gòu)蛋白融合表達(dá)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組疫苗，其特征在于所述的疏水 性位點(diǎn)位于犬II型腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白六鄰粒、纖突或IX蛋白。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組疫苗，其特征在于利用重 疊PCR分別在犬II型腺病毒全基因組六鄰粒基因超變區(qū)的4個位點(diǎn)， 按六鄰粒的轉(zhuǎn)錄閱讀框分別插入狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位，使 其與六鄰粒在腺病毒顆粒外表面融合表達(dá)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組疫苗，其特征在于在犬II型腺病毒全基因組28106 bp處引入一段人工合成的核酸序列，人工 合成的核酸序列含XmaI酶切位點(diǎn)，在XmaI酶切位點(diǎn)處，按纖突的 轉(zhuǎn)錄閱讀框插入狂犬病病毒糖蛋白中和抗原表位，使其與纖突在腺病 毒顆粒外表面融合表達(dá)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組疫苗，其特征在于利用犬 II型腺病毒IX蛋白基因內(nèi)的限制性內(nèi)切酶Ase I位點(diǎn)，在IX蛋白轉(zhuǎn) 錄終止密碼子處插入狂犬病病毒糖蛋白膜外區(qū)基因和SV40病毒多聚 A轉(zhuǎn)錄終止信號，使IX蛋白與外源抗原利用同一轉(zhuǎn)錄閱讀框在腺病 毒顆粒外表面融合表達(dá)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組疫苗，其特征在于利用含犬II 型腺病毒全基因組質(zhì)粒pP0LYII-CAV2中兩個單一酶切位點(diǎn)得到含 六鄰?；虻拇笃?，將其克隆入pET-28a載體，獲得重組質(zhì)粒pET-LH。再利用pET-LH中大片段的兩個單一酶切位點(diǎn)得到含六鄰 ?；虻男∑?，將其克隆入pET-28a載體，獲得重組質(zhì)粒pET-SH， 通過重疊PCR將狂犬病病毒中和抗原表位分別插入六鄰體超變區(qū)內(nèi) 的4個不同位點(diǎn)，其位點(diǎn)分別在犬II型腺病毒全基因組的17378 bp、 17450 bp、 17623 bp和18084 bp處，并將PCR產(chǎn)物克隆入pMD18-T 載體，進(jìn)行序列測定，測序正確后，利用六鄰粒中兩個單一酶切位點(diǎn) 將改造后的六鄰?；蚩寺∪雙ET-SH，最后，按照上述路線返向克隆，獲得重組犬n型腺病毒全基因組。
7、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組疫苗，其特征在于利用pBluescriptn KS(十/一)中的酶切位點(diǎn)Sac I和Kpn I，插入人工合成序列Linker SK(依次含SalI、 Xmal、 Spe I和Pac I多個酶切位點(diǎn))，獲得重組質(zhì)粒 pBS-SKI。按纖突基因序列，人工合成犬II型腺病毒全基因組序列 28050 bp 28106 bp區(qū)段，并插入Linker SK中Sal I Xma I之間， 利用PCR獲得犬II型腺病毒全基因組中30182 bp 29358 bp序列， 將兩片段插入Linker SK中Spe I Pac I之間，獲得重組質(zhì)粒 pBS-SKII，再將狂犬病病毒中和抗原表位按纖突基因的轉(zhuǎn)錄閱讀框插 入pBS-SKII的Linker SK中Xma I和Spe I位點(diǎn)之間，獲得改造后的 纖突基因，最后，通過Linker SK中兩端的酶切位點(diǎn)Sal I和Pac I， 將改造的纖突基因插入pPOLYII-CAV2中，得到重組犬II型腺病毒全 基因組。
8、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組疫苗，其特征在于利用 pPOLYII-CAV2中兩個單一酶切位點(diǎn)得到含IX蛋白基因的大片段， 將其克隆入？811^0^111&8(+/—)載體，獲得重組質(zhì)粒pBS-LIX，再利用pBS-LIX中大片段的兩個單一酶切位點(diǎn)得到含IX蛋白基因的小片段，將其克隆入pEGFP-Cl載體，獲得重組質(zhì)粒pEGFP-SIX，然后，在IX蛋白終止密碼子處，利用其自身的酶切位點(diǎn)插入狂犬病病毒糖 蛋白膜外區(qū)基因與SV40多聚A轉(zhuǎn)錄終止序列，實(shí)現(xiàn)IX蛋白與糖蛋 白膜外區(qū)融合表達(dá)，最后，按照上述路線，返向克隆獲得重組犬II 型腺病毒全基因組。
9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組疫苗，其特征在于所述的狂犬病病毒保護(hù)性抗原基因?yàn)榭袢〔《咎堑鞍啄ね鈪^(qū)序列為GGCCCAAATTCCCTATTTACACGATACCAGACACACTTGGTCTTGGTTGTGGAGGATGAAGGATGCACCAACCTGTCAGGGTTCTGAAGATGGCCGGTGACCCCAGATATGAAGAGTCTCTACACAGTCTTGTGATATTTTTACTAATAGTAGAGGGAAGAGAGCATCCAAGGGGAGCAAGACCTGTGGCTTTGTAGATGAAAGGGGCCTATATAACAAGACCTTGATGGAGGCTGAAGCTCACTACAAGTCAGTCAGGGTCTCAGGGGTTGACCTGGGTCTCCCGAACTGGGGGAAG 。
10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組疫苗，其特征在于所述的表達(dá) 抗原表位的核苷酸序列為TGAACCTAGTATGTCAATAGGGCTCCAGGATCCGAG 或AGCATCTTGTTGTAGAGGAGGCTAGC 。
全文摘要
一種展示狂犬病病毒保護(hù)性抗原的犬II型腺病毒活載體重組疫苗，涉及利用犬II型腺病毒不同結(jié)構(gòu)蛋白的特性，分別展示狂犬病病毒保護(hù)性抗原或抗原表位的重組疫苗，在其結(jié)構(gòu)蛋白基因的疏水性位點(diǎn)插入狂犬病病毒保護(hù)性抗原基因或表達(dá)抗原表位的核苷酸序列，使外源抗原或表位在腺病毒表面與其結(jié)構(gòu)蛋白融合表達(dá)。本發(fā)明重組疫苗攻毒后對試驗(yàn)動物進(jìn)行封閉隔離飼養(yǎng)，觀察并記錄試驗(yàn)動物的采食和發(fā)病情況，結(jié)果顯示，口服和肌肉注射任何一種重組疫苗的犬均可抵抗強(qiáng)毒的攻擊，存活率在90％以上。
文檔編號A61K39/205GK101406698SQ20071005598
公開日2009年4月15日 申請日期2007年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月22日
發(fā)明者曄 劉, 張守峰, 扈榮良, 忠 李 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所