專利名稱：：一種改善微膠囊血液相容性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種改善微膠囊血液相容性的方法，尤其是通過靜電作用吸附表面修飾劑或者通過共價作用利用交聯(lián)劑接枝表面修飾劑而對微膠囊表面進行修飾并改善其血液相容性的方法。
背景技術(shù)：
：微膠囊是通過成膜物質(zhì)將囊內(nèi)空間與囊外空間隔離開以形成特定幾何結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。微膠囊的形狀以球形結(jié)構(gòu)為主，也可為卵圓形、多角形及其它不規(guī)則形狀。傳統(tǒng)微膠囊尺寸大小通常在微米至毫米級，壁厚在亞微米至幾百微米。根據(jù)囊壁形成的原理，微膠囊的傳統(tǒng)制備技術(shù)大體可分為三類利用反應(yīng)生成囊壁的化學(xué)方法、利用相分離形成囊壁的物理化學(xué)方法和利用機械或其它物理作用形成囊壁的物理方法。囊壁通常由天然或合成的高分子材料組成，也可是無機化合物。根據(jù)囊心的性質(zhì)和微膠囊的使用要求，囊壁可由一種材料或多種材料復(fù)合構(gòu)成。微膠囊的特點在于囊內(nèi)物質(zhì)被包埋，囊壁具有半透性能和一定的阻隔性能。核-殼結(jié)構(gòu)微膠囊的囊心物質(zhì)以固體或液體為主，也可是氣體。在藥物的包埋與傳遞中，聚電解質(zhì)微膠囊顯示出了十分獨特的性能。例如，利用自沉積技術(shù)和電荷調(diào)控滲透性能，可將多種水溶性物質(zhì)如蛋白、酶、維生素、納米微粒及各種藥物自發(fā)高效地包埋在微膠囊內(nèi)。由于囊壁的半透性質(zhì)，微膠囊具有緩釋藥物的能力，從而達到低毒、長效的目的。靶向藥物載體最主要的應(yīng)用形式即載體微球或微膠囊。對作為靶向藥物載體高分子材料的基本要求包括其必須無毒，有一定的生物可降解性和血液相容性，能在血液循環(huán)中保持一定的壽命。除了定點注射，通過血液流動的方法將藥物傳遞到需要的部位是一種更為前沿的給藥方式，操作更為簡便。但是，由于聚電解質(zhì)微膠囊的特殊帶電結(jié)構(gòu)，它們與血液接觸后，將可能引起較為嚴(yán)重的凝血反應(yīng)，導(dǎo)致血栓形成進而影響到動物的生命。因此，對微膠囊表面進行物理或化學(xué)改性以提高其血液相容性、降低蛋白質(zhì)的吸附(減少微球或微膠囊等的非特異性吞噬)是十分必要的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種操作過程簡單、適用范圍廣、效率高的改善微膠囊血液相容性的方法。本發(fā)明提供的改善微膠囊血液相容性的方法，其原理是通過靜電作用吸附表面修飾劑或者通過共價作用利用交聯(lián)劑接枝表面修飾劑而對微膠囊表面進行修飾。具體包括以下步驟1)室溫下，在0.5mol/L的NaCl溶液中，將濃度為0.5-4mg/mL的具有相反電荷的聚電解質(zhì)層_層自組裝在膠體微粒表面，得到核_殼結(jié)構(gòu)的膠體微粒；2)按每25-100mg的膠體微粒加入含0.5mo1NaCl的0.5-4mg/mL的牛血清白蛋3白溶液l-2ml，振蕩吸附15-60min;或者按每25_100mg的膠體微粒加入0.5_2ml的質(zhì)量濃度為1%的交聯(lián)劑，室溫下反應(yīng)l-12h后，再加入l-2ml含0.5molNaCl的0.5_4mg/mL的牛血清白蛋白溶液或端胺基聚乙二醇溶液，振蕩吸附15-60min，再將此微粒用質(zhì)量濃度為0.1%的NaBH4浸泡處理15-60min;3)用乙二胺四乙酸二鈉溶解或用鹽酸分解去除膠體微粒，得到懸浮在水中的血液相容性被改善的中空微膠囊。本發(fā)明中，所述的膠體微粒是微交聯(lián)三聚氰胺_甲醛樹脂微粒、碳酸鈣微粒、聚苯乙烯磺酸鈉摻雜的碳酸鈣微?；蛱妓徨i微粒。所述的聚電解質(zhì)是聚烯丙基胺鹽酸鹽(PAH)、聚二烯丙基二甲基季銨鹽(PDADMAC)、殼聚糖、膠原、多聚賴氨酸(PLL)、陽離子化葡聚糖(DEAE-葡聚糖)、聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)、聚丙烯酸(PAA)、聚甲基丙烯酸(PMA)、硫酸軟骨素、硫酸肝素、透明質(zhì)酸、藻酸鈉或硫酸葡聚糖。所述的交聯(lián)劑可以是戊二醛或京尼平。本發(fā)明中膠體微粒的去除方法與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，如微交聯(lián)三聚氰胺_甲醛樹脂微粒用鹽酸分解，碳酸鈣微粒和碳酸錳微粒用鹽酸分解或乙二胺四乙酸二鈉溶解去除。本發(fā)明方法的有益效果在于改善微膠囊血液相容性，為微膠囊在生物材料、藥物傳遞、組織工程等領(lǐng)域的應(yīng)用創(chuàng)造了良好條件。圖1微膠囊的人血槳復(fù)f丐化時間(PRT):a，(PSS/PAH)5;b，(PSS/PAH)5/GA，c，(PAH/PSS)4PAH/GA/PEG;d，(PSS/PAH)5/GA/BSA微膠囊；圖2微膠囊的新鮮兔血的全血凝固時間(CT):a，(PSS/PAH)5;b，(PSS/PAH)5/GA，c，(PAH/PSS)4PAH/GA/PEG;d，(PSS/PAH)5/GA/BSA微膠囊；圖3微膠囊吸附熒光標(biāo)記的FITC-BSA后的熒光顯微鏡照片其中，(A):(PAH/PSS)4PAH;(B):(PAH/PSS)4PAH/BSA;(C):(PAH/PSS)4PAH/GA/BSA/NaBH4;(D):(PAH/PSS)4PAH/GA/PEG/NaBH4;(E):(PAH/PSS)4PAH/GA/NaBH4(無熒光信號，用光鏡照片代替)；圖4用流式細胞儀定量表征微膠囊吸附FITC-BSA前[(A)-(E)]與吸附FITC-BSA后[(F)-(J)]的熒光強度變化關(guān)系圖(A)，(F):(PAH/PSS)4PAH;(B)，(G):(PAH/PSS)4PAH/BSA;(C)，(H):(PAH/PSS)4PAH/GA/BSA/NaBH4;(D)，(I):(PAH/PSS)4PAH/GA/PEG/NaBH4;(E)，(F):(PAH/PSS)4PAH/GA/NaBH4微膠囊；具體實施例方式以下實例進一步說明本發(fā)明，但這些實例并不用來限制本發(fā)明。實例1往400mL濃度為0.025M/L的硝酸鈣(Ca(N03)2)溶液快速加入400mL濃度為0.025M/L的碳酸鈉(NaC03)溶液。15分鐘后，將生成的碳酸鈣(表示為CaC03)微粒離心收4集，用水洗滌3次，保存于乙醇中。將lmL(固含量5-10%)直徑為3-10iim的CaC03微粒置于2mL的離心管中。(1)離心去除乙醇，用水洗滌3次。(2)加入lmL的聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)的NaCl溶液(NaCl濃度為0.5mol/L)，間或振蕩離心管。10分鐘后，用水洗滌3次，以去除多余的PSS，從而在CaC03表面吸附了一層PSS(表示為CaC03-PSS)。(3)然后加入lmL的聚烯丙基胺鹽酸鹽(PAH)的NaCl溶液(NaCl濃度為0.5mol/L)，間或振蕩離心管。10分鐘后，用水洗滌3次，以去除多余的PAH，從而在CaC03-PSS表面又吸附了一層PAH(表示為CaC03_PSS/PAH)。重復(fù)上述(2)、(3)過程，直至形成CaC0f(PSS/PAH)5的核殼微粒。往組成為CaC03-(PSS/PAH)5的微粒中加入1ml1%戊二醛(GA)，室溫下反應(yīng)12h，4000rpm離心lmin，棄上清，水洗三次，即為CaC03-(PSS/PAH)5/GA的核殼微粒。往組成為CaC03-(PSS/PAH)5/GA的微粒中分別加入BSA或PEG,即得最外層共價接枝BSA或PEG的微粒，即CaC03-(PSS/PAH)5/GA/BSA或CaC03-(PSS/PAH)5/GA/PEG的核殼微粒。然后向以上各類核殼微粒中加入濃度為0.lmol/L的鹽酸溶液或者乙二胺四乙酸溶液，反應(yīng)30min使核分解。然后在5000rpm離心3min，除去上清。以上過程重復(fù)3_5次，以徹底除去碳酸鈣，得到聚電解質(zhì)中空微膠囊。各類微膠囊分別用(PSS/PAH)5、(PAH/PSS)4/PAH/GA、(PSS/PAH)5/GA/BSA、(PSS/PAH)5/GA/PEG來表示。測定微膠囊的抗凝血槳復(fù)f丐化時間(PRT):將人體抗凝血槳和0.025M的CaCl2溶液在37t:水浴中預(yù)熱，取lmL已預(yù)熱至37t:的人體血漿加入內(nèi)表面已硅化的玻璃試管中，再加入0.5mL的濃度為1.OX106個/mL(通過血球計數(shù)器計數(shù))的微膠囊溶液，靜置60s。然后往試管中加入上述CaCl2溶液lmL，同時開動秒表計時，將一根不銹鋼小鉤伸入溶液中緩慢而均勻的攪動，檢查是否有纖維蛋白形成。記錄小鉤上開始出現(xiàn)絲狀物的時間，此時間即為PRT。每個樣品重復(fù)測六次，取平均值。采用新鮮兔血測定微膠囊的全血凝固時間(CT):實驗分為(PSS/PAH)4、(PSS/PAH)4/GA、(PSS/PAH)4/GA/PEG、(PSS/PAH)4/GA/BSA四組微膠囊體系，每組采用3支2mL的離心管，每支離心管分別加入0.5mL的微膠囊(約2X105個/mL)，全部置于37。C水浴中預(yù)熱。從兔靜脈采血，用兩個硅化注射器抽取，少量血液進入注射器后廢棄(約l-2mL)，即刻更換第2個注射器，當(dāng)血液進入第2個注射器時開始開動秒表計時。取血后棄去針頭，沿試管壁注入血液lmL，將全部試管置于37t:水浴箱中。血液離體3min后，每隔1530s將每組微膠囊體系的第1支試管輕輕傾斜至約30。，直至血液不再流動為止。再以相同方式依次觀察各組第2、3管，以第3管的血液凝固時間為凝血時間。通過對(PSS/PAH)5微膠囊的人血槳復(fù)f丐化時間PRT(如圖1)和新鮮兔血的全血凝固時間CT(見圖2)的測定，發(fā)現(xiàn)最外層接枝PEG和BSA后的血漿復(fù)鈣化時間和全血凝固時間較未接枝的(PSS/PAH)乂GA微膠囊均有所延長，血液相容性有所改善。微膠囊的溶血性能測定首先制備2%紅細胞懸液的制備。用肝素鈉抗凝管抽取新西蘭兔(健康雄性，1.8-2.3kg)新鮮血液20mL，放入盛有玻璃珠的三角燒瓶中振動搖晃10min，除去纖維蛋白原，制成脫纖血液，加100mL生理鹽水搖勻，1500rmin—1離心20min，除去上清液，反復(fù)用生理鹽水洗至上清液無紅色，將所得紅細胞用生理鹽水配制成2%紅細胞混懸液，備用。取2%兔血紅細胞懸液0.2ml加入10ml蒸餾水中，用酶標(biāo)儀545nm波長測量，吸光度為0.760，符合試驗要求，正常陽性對照組吸光度值為0.8±0.3。5將微膠囊(約1X107個微膠囊)浸于0.9%生理鹽水，在37°C下恒溫恒濕細胞培養(yǎng)箱中浸提72h，分別取10ml微膠囊浸提液、去離子水(陽性對照)、0.9%生理鹽水(陰性對照)于15ml離心管，37。C水浴X30min，每只試管分別加2%兔血紅細胞懸液0.2ml，于37t:水浴下預(yù)熱60min后，將各管的溶液置入干燥離心管中離心(1000prm)5min，取上清在分光光度計上545nm處掃描，以蒸餾水為空白讀取各管吸光度(OD)值，每組設(shè)10個平行樣溶血試驗的評價標(biāo)準(zhǔn)生物材料的溶血率用％表示，計算公式如下溶血率(%)=(Dt-Dnc)/(Dpc_Dnc)X100其中Dt——試驗樣品吸光度Dn。——陰性對照吸光度Dp。——陽性對照吸光度以Dnc吸光度應(yīng)不大于0.03，Dpc吸光度值為0.8±0.3，若溶血率<5%，則材料符合生物材料溶血實驗要求；若溶血率>5%，則預(yù)示試驗材料有溶血作用。溶血實驗結(jié)果顯示(PSS/PAH)5/GA、(PSS/PAH)5/GA/BSA、(PSS/PAH)5/GA/PEG等各類微膠囊的溶血率分別為1.56%、2.31%和2.07%，見表1，三者的溶血率均小于5%，均無致溶血性。發(fā)現(xiàn)上訴各類微膠囊在一定濃度下將具有良好的血液相容性，符合生物醫(yī)學(xué)材料的血液相容性標(biāo)準(zhǔn)。表1微膠囊的溶血率<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實例2往400mL濃度為0.05M/L的硝酸鈣(Ca(N03)2)溶液與800mg聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)混合，10分鐘后，快速加入400mL濃度為0.05M/L的碳酸鈉(NaC03)溶液。15分鐘后，將生成的碳酸鈣(表示為CaCOjPSS))沉淀離心收集，用水洗滌3次，保存于乙醇中。以CaC03(PSS)微粒為核，PAH、PSS為組裝聚電解質(zhì)，參照實例1制備CaC03(PSS)-(PAH/PSS)4/PAH的核殼微粒。向50mg的CaC03(PSS)-(PAH/PSS)4/PAH膠體微粒中加入lml的2mg/mL的BSA(鹽濃度0.5mol/LNaCl)溶液，振蕩吸附30min，即通過靜電作用吸附表面修飾劑而對微膠囊表面進行修飾得到組成為CaC03(PSS)-(PAH/PSS)4/PAH/BSA的核殼微粒；或者向50mg的CaC03(PSS)-(PAH/PSS)4/PAH膠體微粒中加入1ml的濃度為lwt%GA，室溫下反應(yīng)12h，4000rpm離心lmin，棄上清，水洗三次，得到組成為CaC03(PSS)-(PAH/PSS)4/PAH/GA/NaBH4的核殼微粒，再加入1ml的2mg/mL的BSA(鹽濃度0.5mol/LNaCl)或PEG溶液，振蕩吸附30min;然后將經(jīng)GA交聯(lián)過的微粒用0.1%的NaBH4浸泡處理30min。水洗三次，即通過得到組成分別為CaC03(PSS)-(PAH/PSS)4/PAH/GA/NaBH4、CaC03(PSS)-(PAH/PSS)4/PAH/GA/BSA/NaBH4、CaC03(PSS)-(PAH/PSS)4/PAH/GA/PEG/NaBH4的核殼微粒。將以上各類核殼微粒用O.lM的EDTA去核，反應(yīng)30min，然后在5000rpm離心3min，除去上清。以上過程重復(fù)3-5次，以徹底除去碳酸鈣，得到中空微膠囊。各類微膠囊分別用(PAH/PSS)4/PAH、(PAH/PSS)4/PAH/BSA、(PAH/PSS)4/PAH/GA/NaBH4、(PAH/PSS)4/PAH/GA/BSA/NaBH4、(PAH/PSS)4/PAH/GA/PEG/NaBH4來表示。采用血球計數(shù)器計數(shù)微膠囊，再分別往1X107個不同種類的微膠囊中加入1ml的FITC-BSA(2mg/mL)，吸附一小時后，在5000rpm下離心3min以除上清，再用純水洗三次，以備測試。將各類微膠囊吸附FITC-BSA后，比較各微膠囊表面吸附的情況。為觀察所制微膠囊吸附FITC-BSA后的表面情況，分別取10L吸附后的微膠囊，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。圖3分別是各類微膠囊吸附FITC-BSA的熒光顯微鏡圖像。微膠囊本身沒有熒光標(biāo)記，吸附了FITC-BSA后才會有熒光，才在熒光顯微鏡下可見。又用流式細胞儀(FCM)定量分析了各類微膠囊在吸附FITC-BSA前后的平均熒光強度。每次測量平均計數(shù)10000個微膠囊，每個樣品測三次。結(jié)果見圖4與表2。發(fā)現(xiàn)(PAH/PSS)4/PAH微膠囊與(PAH/PSS)4/PAH/BSA微膠囊吸附FITC-BSA后熒光強度均有明顯增加，表明其能吸附較多量的FITC-BSA;而其它最外層經(jīng)修飾過的微膠囊的熒光強度幾乎沒有改變，表明其難以再吸附FITC-BSA，血液相容性提高。表2微膠囊吸附FITC-BSA前后的平均熒光強度<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求一種改善微膠囊血液相容性的方法，其特征在于包括如下步驟1)室溫下，在0.5mol/L的NaCl溶液中，將濃度為0.5-4mg/mL的具有相反電荷的聚電解質(zhì)層-層自組裝在膠體微粒表面，得到核-殼結(jié)構(gòu)的膠體微粒；2)按每25-100mg的膠體微粒加入含0.5molNaCl的0.5-4mg/mL的牛血清白蛋白溶液1-2ml，振蕩吸附15-60min；或者按每25-100mg的膠體微粒加入0.5-2ml的質(zhì)量濃度為1％的交聯(lián)劑，室溫下反應(yīng)1-12h后，再加入1-2ml含0.5molNaCl的0.5-4mg/mL的牛血清白蛋白溶液或端胺基聚乙二醇溶液，振蕩吸附15-60min，再將此微粒用質(zhì)量濃度為0.1％的NaBH4浸泡處理15-60min；3)用乙二胺四乙酸二鈉溶解或用鹽酸分解去除膠體微粒，得到懸浮在水中的血液相容性被改善的中空微膠囊。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改善微膠囊血液相容性的方法，其特征在于膠體微粒是微交聯(lián)三聚氰胺_甲醛樹脂微粒、碳酸鈣微粒、聚苯乙烯磺酸鈉摻雜的碳酸鈣微?；蛱妓徨i微粒。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改善微膠囊血液相容性的方法，其特征在于所述的聚電解質(zhì)是聚烯丙基胺鹽酸鹽、聚二烯丙基二甲基季銨鹽、殼聚糖、膠原、多聚賴氨酸、陽離子化葡聚糖、聚苯乙烯磺酸鈉、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、硫酸軟骨素、硫酸肝素、透明質(zhì)酸、藻酸鈉或硫酸葡聚糖。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的改善微膠囊血液相容性的方法，其特征在于所述的交聯(lián)劑是戊二醛或京尼平。全文摘要本發(fā)明公開了一種改善微膠囊血液相容性的方法。該方法步驟依次為采用膠體微粒為模板，通過層層靜電自組裝方法將具有相反電荷的聚電解質(zhì)組裝到微粒表面，得到了核—殼結(jié)構(gòu)的膠體微粒，在微粒的最外層接枝聚乙二醇(PEG)或牛血清白蛋白(BSA)，或通過靜電吸附BSA，然后采用溶解或分解的方法去除模板而得到聚電解質(zhì)中空微膠囊。測定各種微膠囊的抗凝血漿復(fù)鈣化時間(PRT)、全血凝固時間(CT)以及微膠囊的溶血性能，證明了如此改性的微膠囊的血液相容性有較大提高。這為微膠囊在生物材料、藥物傳遞、組織工程等領(lǐng)域的應(yīng)用創(chuàng)造了良好條件。文檔編號A61K47/36GK101785764SQ20101012782公開日2010年7月28日申請日期2010年3月19日優(yōu)先權(quán)日2010年3月19日發(fā)明者仝維鋆,張裕英,彭采宇,高長有申請人:浙江大學(xué)